RNAi與基因沉默課件

1、RNAi與基因沉默 朱啟順 第一章 緒論 一、基因沉默 1.基因沉默： 基因沉默可以分為兩大類,第一類:位置效應(yīng)(position effect),由于外源基因插入基因座(loci)兩側(cè)的或插入特定的染色質(zhì)部位對插入的基因起到了負(fù)影響所致(異染色質(zhì)區(qū))；第二類是由于多拷貝的外源基因存在于同一染色體中而誘發(fā)的一種表遺傳失活(epigenetic inactivation)現(xiàn)象,由于是同源或互補(bǔ)的序列所誘導(dǎo),所以也稱為同源依賴的基因沉默(homology dependent gene silencing, HDGS)2轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(transcriptional gene silencing

2、, TGS)： 轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默是指由于的修飾(如甲基化等)等原因使基因不能正常轉(zhuǎn)錄,而導(dǎo)致外源基因不能表達(dá)；3轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post- transcriptional gene silencing, PTGS)： 轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默是指外源基因在核內(nèi)能夠正常轉(zhuǎn)錄甚至超常轉(zhuǎn)錄,但是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)中的積累卻很低或根本檢測不到。一般來說,同一染色體上的兩個(gè)同源基因相互作用所產(chǎn)生的順式沉默、不同染色體的兩個(gè)同源基因所產(chǎn)生的反式沉默,以及DNA甲基化所造成的沉默都屬于轉(zhuǎn)錄水平上的沉默。而由反向重復(fù)序列產(chǎn)生的雙鏈RNA(double strand RNA, dsRNA)所誘導(dǎo)的沉默或由單拷貝

3、轉(zhuǎn)基因所產(chǎn)生的異常RNA(aberrant RNA)介導(dǎo)的沉默都屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默。 反式沉默: 一些轉(zhuǎn)錄上的沉默現(xiàn)象可以被同一轉(zhuǎn)基因植物上存在于基因組不同位置的同源啟動(dòng)子之間的相互作用所激發(fā)；或者被某一復(fù)合轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)上不同部分之間的相互作用所激發(fā)。其它的似乎與轉(zhuǎn)基因在染色體上插入的位置和插入位點(diǎn)周圍的序列有關(guān) 。順式沉默 同一染色體上的兩個(gè)同源基因相互作用所產(chǎn)生的二、基因沉默與RNA干擾的發(fā)現(xiàn) PTGS和RNAi是在研究植物，蠕蟲等真核細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化中發(fā)現(xiàn)的，在研究過程中發(fā)現(xiàn)，盡管轉(zhuǎn)基因編碼的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平很高，但是其同源性內(nèi)源基因的mRNA的表達(dá)卻很低或沒有表達(dá)。1.轉(zhuǎn)基因沉默2.共抑

4、制現(xiàn)象.三、RNA干擾的機(jī)理 第一步靶mRNA的dsRNA的產(chǎn)生， 第二步是dsRNA的識別以及2123bp的小RNA（siRNA）的產(chǎn)生，至關(guān)重要的一步是siRNA對靶mRNA的識別與選擇性地降解mRNA。1.植物體內(nèi)基因沉默 植物 位置效應(yīng) 轉(zhuǎn)基因沉默 （擬南介）2. 線蟲 dsRNA 基因沉默3.果蠅 RNaseIII siRNA 基因沉默4. 鼠胚胎細(xì)胞 siRNA 基因沉默 （ dsRNA能夠引起正常細(xì)胞的非程序性凋亡）4. RNA閾值模型(RNA threshold model) ： Lindbo 等認(rèn)為RNA 干涉是細(xì)胞質(zhì)中mRNA 的監(jiān)控系統(tǒng),當(dāng)某種mRNA 超量表達(dá)時(shí),監(jiān)控系

5、統(tǒng)就將這種超量表達(dá)的mRNA 降解。5.異常RNA模型(aberrant RNA model)： 轉(zhuǎn)基因DNA和RNA相互作用或內(nèi)源和外源基因DNA間的相互作用導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄區(qū)域的甲基化，產(chǎn)生異常RNA，異常RNA觸發(fā)所有相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的特異性降解 6.分子間(內(nèi))堿基配對模型(inter-or intra-molecular base pairing model)： 指轉(zhuǎn)錄物間的堿基配對以及轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的堿基配對造成同源轉(zhuǎn)錄物的降解。7.RdRP模型： 在線蟲中，小量的dsRNA能夠使大量的靶RNA沉默，這種現(xiàn)象至少有三種機(jī)制：A、Dicer酶將長dsRNA分子切成短的“初級”siRNA，因?yàn)槊恳粋€(gè)s

6、iRNA具有結(jié)合一個(gè)同源mRNA的能力，效應(yīng)的放大水平取決于dsRNA的長度。B、siRNA在酶作用中，可多次應(yīng)用，能提供進(jìn)一步放大。C、短RNAs可作為靶mRNA的引物啟動(dòng)一個(gè)RNA誘導(dǎo)的RNA聚合反應(yīng)，產(chǎn)生次級siRNAs8.沉默復(fù)合體（RISC）： 由Dicer酶，Argonaute蛋白，siRNA等多種生物大分子裝配而成。 Argonaute蛋白： 是一個(gè)高度保守的家族,該家族包括許多成員,它們組成了RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體的核心元件,是RNA干擾所必須的。其包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域:PAZ和PIWI兩個(gè)結(jié)構(gòu)域， Argonaute蛋白選擇性地與miRNA和siRNA結(jié)合,并與Dicer酶相互作用

7、,其PIWI域與Dicer的RNase結(jié)構(gòu)域直接相互作用,PIWI與Dicer之間的相互作用可能會促進(jìn)miRNA/siRNA的釋放。Argonaute蛋白很可能是RNA干擾中核酸內(nèi)切酶活性的執(zhí)行者。9. Dicer: 是RNase III家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個(gè)片段的3端都有2個(gè)堿基突出。 它包括一個(gè)氨基終端 域、PAZ 域，二個(gè)核糖核酸酶III 域, 和一個(gè) dsRNA 結(jié)合域。 PAZ：含100個(gè)氨基酸，能夠調(diào)節(jié)底物與Ar

8、gonaut蛋白的相互作用。10.參與基因沉默的基因： A、線蟲：rde-1 B、鏈孢霉：gde-2 C、擬南介：ago-1 RNAi干擾模式圖 四、RNA干擾所涉及的技術(shù) 一般來說，任何克隆的基因都可能成為寡RNA的靶，不管該RNA是人工設(shè)計(jì)的，還是RNA表達(dá)的病毒載體，只要其與靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA具有序列互補(bǔ)性即可。下面將RNAi主要涉及到的技術(shù)做一般的介紹1. 干擾RNA（siRNA）及合成原則： A、一般選擇的區(qū)域是以靶基因轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子下游50100bp處開始選擇siRNA作用位點(diǎn); B、5和3非編碼區(qū)和起始密碼子附近區(qū)域應(yīng)盡量避免，因?yàn)檫@些區(qū)域或是編碼調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)、非

9、編碼區(qū)結(jié)合蛋白或翻譯起始復(fù)合物的區(qū)域，它們可能對RISC復(fù)合物的形成造成干擾，而削弱了RNA的作用。C、找出起始密碼子下游的AA二連序列 ，將連同其后19個(gè)bp一起作為siRNA的作用位點(diǎn)。D、DNA模板可來源于質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物和寡核苷酸鏈，與普通模板所不同的是，改進(jìn)的DNA模板必須含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子區(qū)域是RNA聚合酶結(jié)合和RNA開始合成的部位。D、RNA聚合酶是體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA的關(guān)鍵性酶，常用的RNA聚合酶有T7、T3、SP6，它們都以DNA為模板，并要求有特異性的啟動(dòng)子序列。每個(gè)RNA聚合酶對應(yīng)的啟動(dòng)子共有序列如下： T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA

10、 SP6 ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAG NG T3 AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GA RNA聚合酶與雙鏈的DNA啟動(dòng)子結(jié)合后，它將打開雙鏈DNA模板合成互補(bǔ)于DNA的RNA鏈。2. RNAi質(zhì)粒和病毒載體的構(gòu)建 在進(jìn)行RNAi研究中為什么要用到表達(dá)質(zhì)粒和病毒載體呢？A、一個(gè)主要的原因是表達(dá)載體可以在細(xì)胞中持續(xù)產(chǎn)生siRNA以達(dá)長久抑制靶mRNA的目的。B、特定的病毒載體對特定的細(xì)胞非常有效，尤其是對后有絲分裂的細(xì)胞特別有效，能增加細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率。C、就病毒載體本身而言，其可以在細(xì)胞中持續(xù)進(jìn)行表達(dá)。 Brummelkamp等研發(fā)了一種新的載體系

11、統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中進(jìn)行siRNAs的穩(wěn)定表達(dá)，他們使用的是聚合酶III H1-RNA基因啟動(dòng)子。A、該啟動(dòng)子能夠產(chǎn)生一段尾端不帶多聚A，有精確轉(zhuǎn)錄起始和終止信號的小RNA。B、該設(shè)計(jì)還包括一個(gè)插入子，該插入子來源于靶轉(zhuǎn)錄物、具有序列特異性大小為19bp，這一插入子被一短小的間隔子（spacer）與一段序列相同，但是反向互補(bǔ)的19bp的核苷酸序列所分開，C、這樣就形成了19bp配對的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。Brummelkamp等所構(gòu)建的載體系統(tǒng)可以在不同類型的培養(yǎng)細(xì)胞中獲得對靶基因表達(dá)的有效抑制。 目前已有許多研究小組成功地構(gòu)建了包含U6啟動(dòng)子控制下的，合成siRNA的DNA模板的質(zhì)粒。 3.

12、 轉(zhuǎn)染方法 傳統(tǒng)的寡脫氧核糖核酸和DNA質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞的方法已成功地用于siRNAs導(dǎo)入細(xì)胞的研究，然而到目前為止還沒有一種siRNAs的轉(zhuǎn)染方法能適宜對所有細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染，所以必須優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件以便獲得最理想的基因沉默。 A、利用鈣磷酸鹽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染已在一些研究中獲得成功；B、利用脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA對粘連的和不粘連的癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染以沉默ErbB3基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在對沒有粘連的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)沒有獲得成功。 五、RNAi在功能基因研究方面的意義 RNAi技術(shù)已廣泛用于對培養(yǎng)細(xì)胞和活體的研究，研究的最終目的是了解單 個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的最終功能，經(jīng)過幾年的研究，證明RNAi是一種研究細(xì)胞功能基因強(qiáng)有力的工具

13、。 1. RNAi在動(dòng)物功能基因組研究中的應(yīng)用2. RNAi在植物功能基因組研究中的應(yīng)用3. RNAi在信號傳導(dǎo)中的研究 最近的一些研究已經(jīng)證實(shí)了siRNA介導(dǎo)的信號蛋白敲除的有效性并闡述了這類蛋 白質(zhì)在細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)中所扮演的角色。 4. 細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的研究 目前，有一些研究小組利用siRNA技術(shù)敲除一些細(xì)胞周期中相關(guān)的基因，來研究這些基因在細(xì)胞周期中所起的作用。A、Stucke等證實(shí)了Mps1激酶在紡錘體組裝中起關(guān)鍵作用；B、 Ohta等發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的，命名為Cep135的中心體蛋白，該蛋白在微管的組織過程中起關(guān)鍵作用。C、Boehm等證實(shí)了調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶抑制子p27

14、（cyclin-dependent kinase inhibitor p27(Kip1)）,利用RNAi技術(shù)沉默Pik1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著Pik1的剔除，細(xì)胞中的細(xì)胞周期蛋白B被激活了，細(xì)胞周期蛋白B的激活抑制了中心體的擴(kuò)展。5. 生物體發(fā)育的研究 生物體從單細(xì)胞的受精卵迅速地發(fā)育成多細(xì)胞的組織、器官和完整的生物個(gè)體，這其中包含了細(xì)胞的迅速增殖與分化等復(fù)雜的變化與生物化學(xué)的反應(yīng)，在此過程中留下了許多人類未解之密。在這一研究領(lǐng)域?yàn)镽NAi的應(yīng)用提供了廣闊的舞臺，人們正試圖利用有關(guān)RNAi的技術(shù)來揭示生物體發(fā)育，細(xì)胞分化等過程中的細(xì)胞與分子機(jī)理，更好地了解生命的實(shí)質(zhì)。6大分子合成與降解的研究7細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

15、的研究8細(xì)胞的凋亡研究凋亡細(xì)胞：的形態(tài)學(xué)特征主要是核固縮、胞質(zhì)濃縮、胞體急劇變小、細(xì)胞骨架解體，最終形成凋亡小體。 A、Kartasheva等利用siRNA沉默了p73基因，從而阻止了細(xì)胞的程序性凋亡，他們通過進(jìn)一步的分析，發(fā)現(xiàn)p73基因在p53基因介導(dǎo)的細(xì)胞程序性凋亡過程中起著關(guān)鍵性的作用；B、Peng等以人類的成纖維細(xì)胞作為研究對象，用siRNA對細(xì)胞中的DNA依賴蛋白激酶催化亞單位進(jìn)行了沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA依賴蛋白激酶催化亞單位的缺失增加了成纖維細(xì)胞對放射誘導(dǎo)性死亡的敏感性，因?yàn)檫@種酶的缺失影響了對DNA放射性損傷的修復(fù)和識別的能力。 9病毒入侵與復(fù)制的研究 人們利用RNAi技術(shù)來證實(shí)病

16、毒入侵細(xì)胞過程中RNAi的作用機(jī)理，并揭示病毒入侵細(xì)胞過程中分子間的相互作用。利用有針對性的siRNA來處理相關(guān)病毒和不同類型的培養(yǎng)細(xì)胞，可以證實(shí)靶蛋白在病毒入侵細(xì)胞以及在細(xì)胞中復(fù)制方面所起的作用。 六、RNAi在醫(yī)療工作中的應(yīng)用 RNAi在醫(yī)學(xué)方面最常見的應(yīng)用是，利用RNAi技術(shù)選擇性的剔除一種或多種特殊蛋白質(zhì)以達(dá)到減慢或終止疾病的目的。從目前研究的情況來看，雖然從基礎(chǔ)分子生物學(xué)的角度來講，利用RNAi來治療疾病可供選擇的靶基因很多，但理想的主要集中于對癌癥，感染性疾病，心腦血管疾病和神經(jīng)退行性紊亂等方面的研究，目前也主要集中于對這四類疾病的RNAi臨床前研究。1癌癥的研究2. 感染性疾病的

17、研究3. 心腦血管疾病的研究4. 神經(jīng)退行性紊亂 七、RNAi在生物與醫(yī)學(xué)研究中的前景 RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其作用機(jī)制和功能的初步闡明,為RNA的研究展現(xiàn)了一個(gè)新的領(lǐng)域,為RNAi的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ),給基因功能研究和疾病的基因治療帶來了新的希望。RNAi技術(shù)主要應(yīng)用于研究基因功能,通過RNAi特異性抑制基因的表達(dá)來揭示基因在生物體的特定功能；它還可用于研究和開發(fā)基于RNA的基因治療藥物。 第二章 RNA干擾的生物化學(xué) 發(fā)現(xiàn)RNAi后不久, 在秀麗線蟲，擬南芥（Arabidopsis thaliana）, 粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）, 萊茵衣藻(Chlamydomonas

18、 reinhardtii) 和黑腹果蠅中的遺傳篩選，鑒定了轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）需要的基因。這些研究有助于RNAi路徑的確定，但是要認(rèn)識RNAi路徑只有通過生物化學(xué)分析的方法，詳盡地認(rèn)識單個(gè)蛋白質(zhì)在干預(yù)過程中的確切作用，最終了解組分蛋白結(jié)構(gòu)域的確切功能。在此基礎(chǔ)上才能了解這一機(jī)理，全面認(rèn)識RNAi完整的生化基礎(chǔ)。RNAi的生物化學(xué)研究也有生物學(xué)和科技上的意義。 一、RNA干擾的生物化學(xué) 1. 活體中RNAi的早期研究 最早的RNA沉默是在研究植物的過程中發(fā)現(xiàn)的，但是dsRNA作為基因沉默的激活物則是由Fire等在以秀麗線蟲為研究材料的實(shí)驗(yàn)中首次得到證實(shí)的。盡管秀麗線蟲是最早且一直被用作RN

19、Ai遺傳分析研究的材料，但后來一直都沒有有力的證據(jù)證明，線蟲在RNA沉默的生化研究中的獨(dú)特作用。2. RNAi研究的生化模型 通過檢驗(yàn)RNAi每一步生化反應(yīng)所涉及到的對三磷酸腺苷(ATP)的依賴性，并利用路徑中的中間物（intermediates）來激活RNAi，以及用經(jīng)典的生化分餾法提取產(chǎn)生RNAi所需要的蛋白質(zhì)酶和蛋白質(zhì)-RNA混合物，來分析這些物質(zhì)在RNAi路徑中所扮演的角色。這些研究證實(shí)：A. 通過在體外的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這樣一個(gè)事實(shí)，即特異性的dsRNA是使靶mRNA降解的真正物質(zhì)；B. 在體外的研究還證實(shí)了，長的dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后，被特異性地降解為大約長22個(gè)核苷的短干擾RNA（siR

20、NA）；C. 體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了siRNA是RNAi路徑中沉默靶基因的關(guān)鍵物質(zhì)。 在RNAi的反應(yīng)中，siRNAs指導(dǎo) RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體即RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）的形成， RISC是最終降解靶mRNA的物質(zhì)；D. 體外研究表明，以siRNA為基礎(chǔ)形成的 RISC 指導(dǎo)核苷酸內(nèi)切酶在磷酸二酯鍵切割靶RNA，其在靶RNA上的位置取決于它與siRNA 5端的距離；E. 對無細(xì)胞的細(xì)胞提取物的研究證實(shí)了與RISC相關(guān)活性物（RISC-associated activities）完全能夠降解靶mRNA；F. 利用人工合成的siRNA能夠成功誘導(dǎo)靶mRNA的降解；G. 說明RNAi是一種普

21、遍存在的現(xiàn)象。H. RNAi的每一步生化反應(yīng)均涉及ATP 二、RISC：RNAi的催化引擎 RISC是一種核糖核蛋白復(fù)合體，是由核酸內(nèi)切酶，核酸外切酶，解旋酶和siRNA等組成，其中的一個(gè)成分最近在果蠅中被確定，它是Argonaut家族中4個(gè)成員之一的Argonaut2。RISC具有切割mRNA活性的復(fù)合體，切割發(fā)生在與siRNA同源的mRNA上，這樣靶mRNA被切割降解，最終不能再翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。但是來源不同的RISC，它們的大小有很大的差異。1. 線蟲： 在線蟲中Arg基因家族中的rde-1、alg-1、alg-2與RNAi密切相關(guān)2. 擬南介： 在擬南介中Arg-1、Arg-4與RN

22、Ai密切相關(guān) 3. 鏈孢霉 在鏈孢霉中qde-2(Arg基因家族的同源基因）與RNAi密切相關(guān)；4. 果蠅 在果蠅中人們鑒定了4個(gè)與RNAi有關(guān)的Arg基因，分別是Arg-2、vig、FXR和TSN Agg蛋白是進(jìn)化上非常保守的蛋白質(zhì)，機(jī)會存在于所有的真核細(xì)胞，是RNAi機(jī)理中關(guān)鍵的組成成分 三、Dicer與siRNA siRNA 雙鏈體有21-25個(gè)核苷酸長，雙鏈結(jié)構(gòu)有 2個(gè)核苷3突出端。每條siRNA鏈有一個(gè)5磷酸化末端和3羥基末端。siRNA的結(jié)構(gòu)為探索其起源提供了強(qiáng)有力的線索。其中有一個(gè)特異性的dsRNA核糖核酸酶家族RNase III 家族與之密切相關(guān)。 在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)該類酶裂解產(chǎn)

23、生的產(chǎn)物的特征與siRNAs極為相似。siRNA是RNAi復(fù)合體中的組成成分，可以通過果蠅胚胎溶解物中的dsRNA片段裂解成siRNA來獲得小RNA，這一反應(yīng)過程需要ATP的參與。 Dicer 是RNAase 家族中的一員，主要切割dsRNA或者莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA前體成為小RNAs分子。對應(yīng)地，我們將這種小RNAs分子命名為siRNAs和miRNA. Dicer有著較多的結(jié)構(gòu)域，最先在果蠅中發(fā)現(xiàn)，并且在不同的生物體上表現(xiàn)出很高的保守性。A. 推測Dicer含有一個(gè)或多個(gè)dsRNA特異性的核酸酶功能區(qū) B. 因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中加入ATP可以提高siRNA的產(chǎn)量，故認(rèn)為這個(gè)酶有一個(gè)ATP結(jié)合區(qū)（ATP-b

24、inding motif）。C. RNaseII酶 在Dicer中，主要還包括含有串聯(lián)核酸酶區(qū)域的RNaseII和RNaseIII酶。在接近RNaseII酶的羧基未端有兩個(gè)RNaseIII的功能區(qū)。 D. RNaseIII酶 在靠近RNaseIII酶的氨基末端處還有其它結(jié)構(gòu)域。尤其是RNaseIII酶有一個(gè)依賴于ATP的解螺旋酶和PAZ結(jié)構(gòu)域，RISC復(fù)活體中的Argonaute家族蛋白質(zhì)也發(fā)現(xiàn)有PAZ結(jié)構(gòu)域。E. 生化分析表明,體外實(shí)驗(yàn)以及培養(yǎng)的果蠅細(xì)胞中由dsRNA 到siRNA 中RNaseIII 解旋酶蛋白(又稱Dicer 酶) 需要多個(gè)結(jié)構(gòu)域 。它包含依賴于ATP 的RNA 解旋酶結(jié)

25、構(gòu)域,一個(gè)Piwi/ Argonaute/ Zwille(PAZ) 結(jié)構(gòu)域酶、串聯(lián)的RNaseIII 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)dsRNA 的結(jié)合區(qū)(dsRBD)。Argonaute蛋白家族: 是小RNA復(fù)合物的主要成分，它們在真核生物中是保守的。Argonaute家族具有PAZ（Piwi Argonaut and Zwille）和PIWI結(jié)構(gòu)域。從結(jié)構(gòu)和生化方面的研究表明，Argonaute蛋白能夠與小RNA直接發(fā)生相互作用，作用部位是PAZ結(jié)構(gòu)域與小RNA的3端,PIWI結(jié)構(gòu)域以及中間的一個(gè)結(jié)構(gòu)域與小RNA 5端發(fā)生作用。小RNA分子指導(dǎo)Argonaute蛋白找到它的靶位點(diǎn),從而導(dǎo)致了基因沉默。 四、D

26、icer與miRNA microRNA (miRNA)是一類在真核生物中廣泛存在的大小約22 nt的非編碼小分子單鏈RNA，它可以通過對靶標(biāo)RNA的剪切或抑制靶標(biāo)RNA的翻譯調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)。miRNA不僅參與了植物器官的形態(tài)建成，還參與調(diào)控植物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)等與生長發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控過程。與植物抗病毒RNA沉默途徑一樣，miRNA途徑也受到病毒沉默抑制子的干擾。 1. siRNA 與miRNAA. miRNA 介導(dǎo)的基因調(diào)控是生物體內(nèi)除了siRNA 引起的RNA 沉默之外,另一條小RNA (small RNA, sRNA)調(diào)控路徑。B. miRNA 最重要的功能之一是控制轉(zhuǎn)錄因子, 從

27、而調(diào)控生物體的正常發(fā)育。C. miRNA 還可以將諸如蛋白水解代謝離子運(yùn)輸以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的多種mRNA 作為靶點(diǎn)進(jìn)行降解或阻止翻譯。D. siRNA 是由反向重復(fù)序列病毒復(fù)制或RDR (RNA-dependent RNA polymerase)合成的dsRNA產(chǎn)物在Dicer 作用下產(chǎn)生的。E. miRNA 與siRNA 在化學(xué)性質(zhì)和作用效果上極其類似但又有著本質(zhì)上的不同。 近年來的研究發(fā)現(xiàn),miRNA 在代謝上與siRNA 共享著一些相似的蛋白和路徑, 如都是Dicer 蛋白加工的產(chǎn)物, 都需要解旋酶的參與, 所結(jié)合的復(fù)合體siRISC 和miRISC (或稱miRNP, miRNA-r

28、ibonucleoprotein complex)都包含有至少一個(gè)Agonaute 家族蛋白。F.miRNA與siRNA 的來源不同, miRNA 來自于基因組DNA 的非編碼區(qū), 存在于小的單鏈發(fā)夾狀轉(zhuǎn)錄前體, 是內(nèi)源性的。G.siRNA 也可以由內(nèi)源基因產(chǎn)生,如由DCL3(Dicer-like) 產(chǎn)生的siRNA; 其他siRNA 來源于外源核酸入侵或病毒復(fù)制形成的雙鏈RNA。H. miRNA 存在于前體的一條臂, 最終產(chǎn)生的是單鏈RNA, 結(jié)合于miRNPs(miRISCs)復(fù)合物而行使功能。I. siRNA 初為雙鏈,能精確識別位于外顯子區(qū)域的互補(bǔ)靶序列, 并可能由反義鏈和RISC 組

29、成siRNA-RISC(siRISC)復(fù)合物, 最終導(dǎo)致靶序列的降解而誘導(dǎo)RNA 沉默。J. 在作用方式上, siRNA 介導(dǎo)的沉默最終導(dǎo)致靶標(biāo)RNA 的降解, 而miRNA 介導(dǎo)的RNA 調(diào)節(jié)可以是對靶標(biāo)RNA 的剪切或?qū)Π袠?biāo)RNA 翻譯的阻遏, 這主要取決于miRNA 與其靶標(biāo)mRNA 的序列互補(bǔ)的程度。2. miRNA 具有以下幾個(gè)特征:A .成熟的miRNA是一類1925 nt 的小RNA ,可通過Northern 印跡檢測到； B. miRNA 能夠互補(bǔ)配對結(jié)合于基因序列的側(cè)翼區(qū)域； C. miRNA 一般來源于染色體非編碼蛋白區(qū)域； D. 由核酸酶Dicer 作用于前體的雙鏈部分生

30、成單鏈的miRNA。E. miRNA 最重要的功能之一是控制轉(zhuǎn)錄因子, 從而調(diào)控生物體的正常發(fā)育。 與的作用模式圖五、哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNAi的生物化學(xué)特性 哺乳動(dòng)物的RISC介導(dǎo)的靶mRNA的裂解發(fā)生在單一磷酸二酯鍵上，靠近反義siRNA鏈的中心。Gem3和Gem4也是SMN（survival of motor neurons）復(fù)合體的組成成分，SMN復(fù)合體是snRNP（small nuclear ribonucleoportein）生物發(fā)生所必需的成分。SMN復(fù)合體與RISC的明顯區(qū)別是SMN復(fù)合體中的SMN蛋白質(zhì)與兩個(gè)eIF2C 中的任一個(gè)有同源關(guān)系。 研究人員在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)復(fù)

31、合體，其組成成分與果蠅的RISC成分相似，在這類哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，通過轉(zhuǎn)染siRNAs能夠激活RNAi。這個(gè)復(fù)合體包括siRNA或miRNA，一個(gè)Argonaute家族成員（eIF2C/Ago-1），VIG (內(nèi)含子基因蛋白質(zhì))哺乳動(dòng)物的同源體，脆性X金屬阻遏蛋白(the Fragile X mental retardation protein)和與RISC有關(guān)的和哺乳動(dòng)物同源的微球菌核酸酶族（P100）。 六、不同生物種中的RNAi 人們推測在線蟲細(xì)胞中具有放大初始dsRNA的機(jī)制，放大后的dsRNA所產(chǎn)生的siRNA可以彌補(bǔ)每個(gè)細(xì)胞周期對siRNA稀釋效應(yīng)，使得線蟲的RNAi能持續(xù)許多代。在

32、植物中觀察到沉默信號的“傳播”（spreading）而不是RNAi傳遞。 七、RNAi 與人類疾病 八、RNAi與基因組 RNAi技術(shù)已廣泛用于對培養(yǎng)細(xì)胞和活體的研究，研究的最終目的是了解單個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的最終功能，經(jīng)過幾年的研究，證明RNAi是一種研究細(xì)胞功能基因強(qiáng)有力的工具。同時(shí)，隨著基因組測序工作的深入開展,人類已積累了大量的基因序列數(shù)據(jù),而這些序列大部分缺乏明確的功能注釋,后基因組時(shí)代的到來使確定基因功能這項(xiàng)任務(wù)更為迫切。如今人們對于某個(gè)基因功能的認(rèn)識一方面通過分離突變體與野生型進(jìn)行比較來確定；另一方面通過以基因阻斷技術(shù)為基礎(chǔ)的遺傳學(xué)方法獲得。近年來基因阻斷技術(shù)在機(jī)理和功能研究中都有很

33、大進(jìn)展,顯示了良好的前景。目前基因的阻斷主要在DNA和mRNA兩個(gè)水平。前者主要包括基因剔除及DNA陷阱,后者主要有反義技術(shù),肽核酸及RNAi。RNAi就是最近幾年發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來的新興基因阻斷技術(shù)。九、RNAi 在動(dòng)物功能基因組研究中的應(yīng)用 目前,RNAi作為研究基因功能的有力工具,已在線蟲、錐蟲、果蠅、渦蟲、水螅、低等脊椎動(dòng)物(如斑馬魚)以及哺乳動(dòng)物基因功能研究中獲得成功。 Ravi等利用喂養(yǎng)表達(dá)dsRNA的大腸桿菌方法,從秀麗線蟲1號染色體構(gòu)建的粘粒庫中,隨機(jī)挑選了86個(gè)基因,從產(chǎn)生的表型中鑒定了13個(gè)基因的功能。 Momoyo等利用RNAi技術(shù)篩選線蟲胚系發(fā)育相關(guān)基因,從消減雜交cDNA

34、文庫中檢測了168個(gè)克隆,共獲得15個(gè)陽性克隆,為進(jìn)一步研究蟲體發(fā)育機(jī)制打下基礎(chǔ)。 Harborth等則利用siRNA在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中鑒定了大量細(xì)胞生長所必需的基因,包括以前認(rèn)為非必需基因如核纖層蛋白B1和B2、胞漿動(dòng)力蛋白、蛋白激酶cdkl、肌動(dòng)蛋白和等。 Fraser等與Gonczy等人在研究RNAi中利用RNAi特異性這一優(yōu)點(diǎn),合成了上千個(gè)與開放讀框相應(yīng)的dsRNA，并在細(xì)菌中表達(dá)這些dsRNA,然后分別用微量注射和喂食的方法導(dǎo)入線蟲體內(nèi),干擾同源基因的表達(dá),再運(yùn)用子代分析和定時(shí)差異干擾比較(differential interference contrast,DIC)顯微分析法

35、,成功地在基因組水平上大規(guī)模地篩選了功能基因(稱為RNAi篩選),證實(shí)了線蟲染色體和染色體中與早期胚胎細(xì)胞分裂及細(xì)胞代謝等有關(guān)的所有基因功能。 Andrew等用可分泌的細(xì)菌喂養(yǎng)線蟲,研究了染色體約90%的預(yù)測基因,13 9%的基因與其功能對應(yīng)起來,使已知表型的基因數(shù)量由70增至378。這種篩選方法與經(jīng)典基因篩選方法相比各有千秋,但它主要的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是逆基因分析,即已知特定的基因序列,通過阻抑這一特異基因的表達(dá)而出現(xiàn)功能或個(gè)體表型的改變,進(jìn)而得到與其對應(yīng)聯(lián)系十、RNAi 在植物功能基因組研究中的應(yīng)用 現(xiàn)在研究線蟲、果蠅、渦蟲的RNAi時(shí),普遍采用了dsRNA微注射方法,但它對研究植物RNAi卻沒成

36、功。 Chuang等人構(gòu)建了可以在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄為dsRNA的DNA嵌合結(jié)構(gòu),再利用農(nóng)桿菌把此結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化到擬南芥中,利用RNAi作用證實(shí)了擬南芥中與花發(fā)育有關(guān)的基因的功能,并證明RNAi在對應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物中是穩(wěn)定的,并可以傳給后代。而植物中RNAi作用穩(wěn)定的這一特點(diǎn)在其它方法產(chǎn)生的RNAi(如dsRNA微量注射的動(dòng)物、RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)的生物體內(nèi)并未體現(xiàn)。 梅洛(Craig Mello)生于1960年，是被恐龍骨引入科學(xué)世界的。梅洛童年時(shí)經(jīng)常跟著父親在美國西部尋找化石。從那時(shí)起，他就迷上了遠(yuǎn)古時(shí)代、地球歷史和人類生命的起源等問題。高中時(shí)代，梅洛的興趣逐漸轉(zhuǎn)移到了基因工程方面。法爾(Andrew Fi

37、re)1959年出生在美國加利福尼亞州，本科在加利福尼亞大學(xué)伯克利分校主修數(shù)學(xué)，僅用3年時(shí)間就拿到學(xué)位。與梅洛類似，他逐漸對涉及生命奧秘的遺傳學(xué)產(chǎn)生興趣，并將其作為自己終身的學(xué)術(shù)追求。 第三章 核糖核酸酶超家族 一、RNase超家族RNA聚合酶：合成轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNAs）、rRNA 5S及其他可以在細(xì)胞核及原生質(zhì)找到的細(xì)小的RNA 核糖核酸酶（RNase）家族是一類識別特定序列對雙鏈RNA進(jìn)行切割的內(nèi)切酶，切割后一般產(chǎn)物3末端會帶有兩個(gè)堿基的粘性末端。目前RNase家族研究得最多的是在RNA干擾途徑中起重要作用的Dicer酶，它負(fù)責(zé)切割雙鏈雙鏈RNA后產(chǎn)生小干擾RNA；而結(jié)構(gòu)較簡單的細(xì)菌RN

38、ase則是這一類酶的典型代表。 Substrate (RNA 5) and a Product (RNA 6) of Aa-RNase III (D44N)Schematic Representation of RNase III-dsRNA Interactionsendonuclease domain (endoND)a dsRNAbinding domain (dsRBD)The Overall Structure of A.aeolicus RNaseIII(D44N)RNA根據(jù)分子量和肽鏈的復(fù)雜性將RNase同源物分為4類。A. 第一類是細(xì)菌的RNase酶。擁有單個(gè)dsRNA接合區(qū)（

39、dsRBM）和催化區(qū)。Rntlp（ RNase III ）延伸的氨基末端對于二聚體的穩(wěn)定性及最佳的加工活性起著重要的作用；B. 第二類是Saccharomyces cerevisiae同源物的Rntlp。該類酶有單一的dsRBM，但是有雙重的催化結(jié)構(gòu)區(qū)，氨基末端區(qū)域包含長的可變異區(qū)和保守區(qū)；C. 第三類是果蠅的Drosha（ RNase III ）D. 第四類型酶屬于哺乳類的Arg，其含有催化的串聯(lián)重復(fù)區(qū)，這個(gè)區(qū)域的氨基末端有RNA解旋酶區(qū)。 二、細(xì)菌RNase的功能 所有類型的細(xì)菌基因組，即便是含有“最簡單”基因組的Mycoplasma genitalium（生殖支原體），都包含有RNase

40、基因。這種保守的情況暗示了RNase包含有一種或多種重要的細(xì)胞功能。許多對同源物的研究集中于E.coil 的RNase，E.coil RNase是一個(gè)基因表達(dá)的全方位的調(diào)控子，在Neisseria sp（奈瑟氏球菌屬）中RNase具有分解富含重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄物的功能(圖示）。 1. rRNA和tRNA的成熟 A. E.coil RNase切割大小約為5500bp由7個(gè)rRNA操縱子轉(zhuǎn)錄生成的核苷酸，從而為16S，23S，以及5S rRNA提供了直接的前體，因?yàn)榍懈钭饔冒l(fā)生于轉(zhuǎn)錄過程中，所以全長度的RNA并不多見，RNase的切割位點(diǎn)位于16S和23S rRNA 5及3端側(cè)鏈的互補(bǔ)配對序列；B. R

41、Nase也參與其它結(jié)構(gòu)的RNA的成熟過程，其中包括tRNA； C. 在T4噬菌體轉(zhuǎn)錄物編碼的8個(gè)tRNAs中，RNase可對第一個(gè)tRNA序列的上游進(jìn)行切割，在形成正確的tRNAGln過程中,這一切割作用是非常必要的。 RNase III超家族成員功能區(qū)結(jié)構(gòu)模式圖PAZ domain： 大約有130個(gè)氨基酸，其上有一個(gè)帶有正電的凹陷處，可以辨認(rèn)siRNA的3端(帶負(fù)電)并和之結(jié)合；而PIWI大約有300個(gè)胺基酸，是屬于RNase H (是一種核糖核酸內(nèi)切酶,它能夠特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵,故能分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈。該酶不能消化單鏈或雙鏈DNA）家族成員之

42、一2. mRNA的成熟（附： RNA的生物合成轉(zhuǎn)錄） E.coil RNase具有位點(diǎn)特異性地切割細(xì)胞和噬菌體編碼的mRNA前體的功能，通過E.coil RNase的切割形成具有完整功能的成熟的mRNA。A. RNase切割位點(diǎn)位于T7噬菌體多順反子早期mRNA前體內(nèi)的5個(gè)順反子之間，通過切割提供了成熟的mRNA。B. RNase的切割作用對這些mRNA是至關(guān)重要的，因?yàn)樗那懈钍沟胢RNA的3形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而避免了35核酸外切酶的降解；C. E.coil RNase能切割噬菌體的轉(zhuǎn)錄物及控制溶解溶原現(xiàn)象；D. 還有一種調(diào)節(jié)成分涉及到了RNase對N mRNA 5引導(dǎo)鏈的切割，這種作用需要大

43、量N蛋白的合成。3. mRNA的降解與反義RNA調(diào)節(jié) E.coil RNase 具有誘發(fā)mRNA降解的功能。A. RNase多在聚核苷酸磷酸化酶（PNPase）mRNA的5非翻譯區(qū)內(nèi)的特異性位點(diǎn)切割，能夠快速誘發(fā)其它核酸酶的降解，PNPase也參與這個(gè)作用機(jī)制，而且受到產(chǎn)物的自動(dòng)調(diào)控，B. RNase 也可以自動(dòng)調(diào)節(jié)它的產(chǎn)物，這個(gè)調(diào)控過程是通過它的mRNA 5UTP(三磷酸尿苷)內(nèi)的特異性位點(diǎn)的切割導(dǎo)致快速誘發(fā)隨后的降解來實(shí)現(xiàn)的；C. RNase通過切割質(zhì)粒編碼的mRNA來進(jìn)行基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控；D. RNase 還參與對細(xì)菌反義RNA的作用。在通過對正義-反義RNA雙鏈體的RNase酶切割，能

44、夠?qū)?xì)菌質(zhì)粒的拷貝數(shù)量或抑制蛋白的生成進(jìn)行負(fù)調(diào)控。盡管一些例子已證實(shí)正義-反義RNA雙鏈體的形成能夠產(chǎn)生抑制作用，但還是不能忽視RNase的切割作用。其它細(xì)菌RNase同源物三、細(xì)菌RNase同源物的底物反應(yīng)抗原表位 抗原表位（抗原決定基）：抗原分子中具有特殊的立體構(gòu)型和決定抗原特異性的化學(xué)基團(tuán)。 RNase 切割產(chǎn)物的功能依賴于RNase對底物的精確切割（類似抗原與抗體的特異性結(jié)合）。A. 切割位點(diǎn)的選擇決定著mRNA的半衰期（half-life）及翻譯的活性;B. 細(xì)胞底物特異性的切割對應(yīng)于復(fù)雜或簡單的dsRNA的隨機(jī)切割，是隨機(jī)的還是特異性的取決于Dicer對小調(diào)節(jié)RNA前體的特異性切割

45、，并最終決定著siRNA的形成。 四、細(xì)菌RNase的作用機(jī)制 在RNase 中dsRBM和催化區(qū)的配對都是保守的，雖然會有一些變化，但人們希望dsRNA的接合及切割作用也是保守的，特別是在底物識別方面。 對E.coil酶的研究有利于認(rèn)識RNase成員的作用機(jī)制。我們已經(jīng)應(yīng)用生物化學(xué)和遺傳學(xué)的方法去確定dsRBM和催化區(qū)如何在催化循環(huán)中協(xié)同工作的。對于dsRBM的結(jié)構(gòu)和E.coil RNase的催化區(qū)以及Aquifer aeolicus的RNase而言，它們提供了確定dsRNA切割保守機(jī)制的新方法。催化區(qū)：功能及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)A. 在常規(guī)的體外轉(zhuǎn)錄情況下，E.coil RNase 的催化功能區(qū)需要d

46、sRBM對底物的切割。然而，當(dāng)降低鹽濃度以及Mn2+置換Mg2+后，缺少dsRBM 的Rnase 刪簡形式同樣具有活性。B. 在類似的條件下，Rhodobacter刪簡形式的RNase也能分解底物。在低鹽環(huán)境下能提高切割活性的現(xiàn)象，可以用離子間競爭作用的降低來解釋，反之，必須的Mn2+有可能影響其它未達(dá)到最佳狀態(tài)的底物-酶間的相互作用，它可能作用于活性位點(diǎn)來產(chǎn)生影響作用。C. E.coil RNase的催化區(qū)是一種二聚體，對于dsRNA來說，具有嚴(yán)格的特異性，并且能被溴化乙錠所抑制，所有這些都是全酶產(chǎn)生作用的必要條件。催化區(qū)同樣也是底物識別的關(guān)鍵部分，因?yàn)閯h簡形式的酶也有標(biāo)準(zhǔn)的切割位點(diǎn)可用。

47、2. dsRBM：結(jié)構(gòu)及功能特點(diǎn) A. dsRBM 是E.coil RNase保持活性必不可少的部分。 B. 在生理?xiàng)l件下，dsRBM可以提供底物接合必須的親和性，雖然E.coil RNase dsRBM對切割位點(diǎn)的選擇或dsRNA的特異性并不很嚴(yán)格，但是其可能有另外的底物特異性識別與活性調(diào)節(jié)的功能。在其它擁有不同功能的dsRNA接合蛋白中觀察到了dsRBM。 C. E.coil RNase dsRBM的可溶解結(jié)構(gòu)可以通過核磁共振（NMR）來加以確定，通過分析發(fā)現(xiàn)dsRBM 由組成的超二級結(jié)構(gòu)，在3條反向平行的折疊鏈的同一個(gè)面上有兩條螺旋鏈，這樣的折疊存在于所有的dsRBM中，它只能識別dsR

48、NA。 D. 在單位細(xì)胞內(nèi)，兩條雙螺旋同軸堆積后形成了準(zhǔn)連續(xù)螺旋體。E. dsRBM-dsRNA相互間作用的跨幅為16bp，并且dsRBM連接到螺旋體的一個(gè)面上，這個(gè)面包含兩個(gè)小槽和主要的插入槽。F. dsRBM有三個(gè)特殊區(qū)域與RNA相連，這三個(gè)區(qū)域包含1螺旋（區(qū)域1），一個(gè)環(huán)連接的1和2鏈（區(qū)域2）以及2的氨基末端（區(qū)域3）。G. 蛋白-RNA之間主要依靠氫鍵連接，核糖能夠識別的兩條鏈為dsRNA提供了特異性識別的基礎(chǔ)。 根據(jù)共結(jié)晶體結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)，利用分子模型技術(shù)，研究人員提出了一種RNase 全酶-dsRNA的復(fù)合體模型，在此模型中:A. dsRBM“加入”到Aa-RNase催化區(qū)，該區(qū)也是

49、dsRNA結(jié)合的地方。B. 全酶可以連接23-bp的雙螺旋體，在各自的分解反應(yīng)中，它們連接到一起并釋放出19-bp大小含有2核苷酸3突出端的螺旋體。C. RNase 全酶-dsRNA的復(fù)合體具有雙折疊對稱性，與印跡（footprinting）和干擾分析的結(jié)果一致。D. 全酶能隨機(jī)地接合長dsRNA，通過對長dsRNA的加工獲得一定大小范圍的產(chǎn)物（12-15bp）。3.所涉及到的活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和二價(jià)金屬離子 E.coil RNase的磷酸二酯酶活性需要有二價(jià)金屬離子的參與，其中Mg2+是最理想的，其它如Mn2+，Co2+和Ni2+也同樣能起輔助催化作用。 五、酵母RNase同源物：底物及功能 在

50、對S.cerevisiae核苷酸酶Rntlp和Schizosaccharomyces pombe Paclp的研究中，發(fā)現(xiàn)真核RNase同源物是如何識別底物反應(yīng)抗原表位，如何選擇加工的路徑來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。酵母 RNase 的同源物也表現(xiàn)出相同的現(xiàn)象，正如在純化和活性分析中所觀察到的一樣。 穩(wěn)定的RNA成熟涉及Rntlp和Paclp，它們的一種功能就是通過切割25S rRNA 3末端下游的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，從而促使35S rRNA前體的成熟。 六、高級真核細(xì)胞RNase同源物的結(jié)構(gòu)與功能 有兩種哺乳動(dòng)物基因組僅編碼兩種RNase 同源物，而Arabidopsis thaliana 基因組卻至少編碼9

51、種已知的RNase 同源蛋白。通過對催化區(qū)和dsRBM的保守配對分析，它們均有相同的的催化作用。哺乳動(dòng)物的RNase 鼠和人的基因組編碼兩種RNase同源物，其中的一種就是Dicer，另一種被稱為RNase，每一種蛋白都由單拷貝基因編碼，它們都位于染色體上的不同位點(diǎn)。 七、RNAi與小調(diào)節(jié)RNA成熟中的Dicer Dicer作為一種RNA成熟的核酸酶而不是一種降解核酸酶是很精確，因此 Dicer的作用之一是完成小調(diào)節(jié)RNA的成熟；另一個(gè)作用是，Dicer能分解多種dsRNA，提供抑制基因表達(dá)的siRNA。1.siRNA的產(chǎn)生 RNAi的內(nèi)源性功能包括抑制病毒基因的表達(dá)和反轉(zhuǎn)錄子的移動(dòng)。RNAi

52、的作用是識別雙鏈RNA，將它們認(rèn)為是“異?！钡腞NA進(jìn)行降解。A. 首先產(chǎn)生一種稱為小干擾RNA（siRNA）（-21bp）的雙鏈RNAs。在體外研究系統(tǒng)中，人們發(fā)現(xiàn)siRNA是直接由dsRNA通過分解生成的，并證實(shí)了Dicer在加工dsRNA為siRNA過程中的作用。B. siRNA加入一些蛋白中形成稱為RISC的復(fù)合體, RISC能直接降解同源RNA靶序列。果蠅RISC含有一種Argonaute蛋白家族的成員（Argonaute-2），這說明在其它有機(jī)體中也存RNAi現(xiàn)象。靶RNA的切割作用機(jī)理目前尚還不清楚，但可以肯定其并不涉及Dicer的作用。2. 小調(diào)節(jié)RNA的成熟與Dicer Di

53、cer還有一個(gè)重要的作用就是加工小調(diào)節(jié)RNA的前體。在最早涉及Dicer的研究中，發(fā)現(xiàn)A.thaliana(擬南芥） 中Dicer基因變異會引起花分生組織無節(jié)制增殖，從而導(dǎo)致花的非正常發(fā)育，其它的研究如在秀麗線蟲中的研究也得到證實(shí)，Dicer在生殖細(xì)胞的發(fā)育過程中是一個(gè)不可缺少的酶。A. Dicer作用所產(chǎn)生的小調(diào)節(jié)RNA包括小的暫時(shí)性的RNA（stRNA），例如線蟲的let-7 小RNA（microRNA）。這類小調(diào)節(jié)RNA是通過對它們的前體RNA進(jìn)行位點(diǎn)特異性切割得到的。在體外的研究證實(shí)純化的人的重組Dicer能將let-7 的microRNA前體切割為大小正確的成熟的RNA，成熟的let

54、-7 microRNA粘連到靶mRNA的3UTR的互補(bǔ)位點(diǎn)上，以目前未知的作用機(jī)理調(diào)節(jié)mRNA的翻譯。B. Dicer通過對多順反子和單順反子前體的切割生成一定數(shù)量的小調(diào)節(jié)RNA，小調(diào)節(jié)RNA調(diào)節(jié)對應(yīng)mRNA的轉(zhuǎn)錄后翻譯這已成為人們的共識。與siRNA的形成相比，小調(diào)節(jié)RNA前體的切割是不對稱的，這主要涉及到Dicer作用的底物反應(yīng)抗原表位，因此人們推測在細(xì)菌和酵母中RNase底物的內(nèi)部環(huán)狀的特定序列以及同軸堆積現(xiàn)象也參與了Dicer切割位點(diǎn)的選擇。 3. Dicer的結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制 Dicer的多肽結(jié)構(gòu)決定了它特異性功能的發(fā)揮。在Dicer中存在著兩個(gè)催化區(qū)，從結(jié)合細(xì)菌全酶二聚體界面存在的兩

55、個(gè)催化區(qū)可以推測出Dicer全酶的二聚體結(jié)構(gòu)。從Dictyostelium（網(wǎng)柄菌）中純化的雙鏈核糖核酸酶與Dicer很相似，它的大小約為450kD。假設(shè)在非常見結(jié)構(gòu)和/或相關(guān)多肽缺失的情況下，它的結(jié)構(gòu)大小和同源二聚體的大小相似，也有可能兩個(gè)催化區(qū)分子內(nèi)的聯(lián)系提供了一種dsRNA粘連的裂縫，從而避免了必需的分子間的連接。 A. Dicer類似于細(xì)菌RNase，因?yàn)樗鼈兌伎梢苑纸饷黠@的非特異性的dsRNA序列，產(chǎn)生具有2核苷酸3突出端，5磷酸鹽以及3羥基末端的siRNA。B. 根據(jù)蛋白功能區(qū)的特性，產(chǎn)物末端的類型以及所需要的二價(jià)金屬離子，人們推測Dicer對磷酸二酯鍵的水解作用與細(xì)菌RNase的

56、水解作用相同。C. 在真核細(xì)胞中，21bp大小的siRNA足以滿足針對靶序列所需要的特異性互補(bǔ)條件?，F(xiàn)在人們已經(jīng)認(rèn)識了siRNA的結(jié)構(gòu)特征與其發(fā)揮作用的重要性，在對果蠅胚胎溶解產(chǎn)物的分析中，發(fā)現(xiàn)具有2核苷酸3突出端的siRNA能有效地履行RNAi的功能，而且對核糖并沒有什么嚴(yán)格要求。4.RNAi效應(yīng)復(fù)合體的組裝 : RISC組裝的關(guān)鍵步驟是將siRNAs和miRNAs小分子兩條鏈中的一條選擇進(jìn)入該復(fù)合體，目前RISC復(fù)合體的體外研究只在Drosohaila得到研究。 果蠅中，siRNAs和miRNAs小分子是由不同的Dicer酶類進(jìn)行加工的:A. Dcr-1（線蟲中的Dicer）酶產(chǎn)生miRN

57、As小分子，而 Dcr-2酶（果蠅中的Dicer）產(chǎn)生siRNAs小分子;B. Dcr-2酶還指導(dǎo)siRNAs小分子的一條鏈進(jìn)入RISC復(fù)合體。C. 人類中的Dicer酶也可能有指導(dǎo)siRNAs小分子進(jìn)入RISC復(fù)合體的功能，因?yàn)镈icer酶缺失的人類細(xì)胞中siRNAs小分子并不能誘導(dǎo)產(chǎn)生RNA沉默。5.植物中的三種RNA沉默途徑A. 細(xì)胞質(zhì)siRNA沉默。這條途徑可能在病毒感染植物細(xì)胞中起重要作用，其中dsRNA可能作為復(fù)制媒介或具有單鏈病毒RNA的二級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。在植物DNA病毒中，dsRNA可能通過重疊互補(bǔ)轉(zhuǎn)錄本的退火而形成。B. 通過miRNAs沉默內(nèi)源mRNA。miRNAs可能來源于具

58、有部分雙鏈區(qū)域的反向重復(fù)前體RNA分子，它們通過與互補(bǔ)的單鏈mRNA相互作用而起作用。C. 通過DNA甲基化抑制轉(zhuǎn)錄而起作用。這條途徑的最初證據(jù)是在植物中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因及病毒RNA指導(dǎo)特異的核苷酸DNA甲基化。最近研究發(fā)現(xiàn)植物中siRNA指導(dǎo)的DNA甲基化與組蛋白修飾有關(guān)。6. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNA干擾:A. siRNAs的設(shè)計(jì)： siRNAs的設(shè)計(jì)根據(jù) Elbashir (2001)描述的方法，帶3突出的兩個(gè)U。候選的siRNAs序列分別位于mRNA靶的3 5以及中部，從而驗(yàn)證不同的區(qū)域是否對siRNA介導(dǎo)的降解更為敏感。候選序列在人類基因組數(shù)據(jù)庫中Blast以避免和其他基因的同源性，最后每個(gè)目

59、標(biāo)靶基因選出對應(yīng)的4個(gè)siRNAs。 B. siRNA合成： 分別用化學(xué)合成的方法和試劑盒(酶法)制備siRNAs并用常規(guī)方法定量。 C. 轉(zhuǎn)染： 哺乳動(dòng)物細(xì)胞（Hela）在不含抗生素的完全培養(yǎng)基中生長至 40-70%，分別將每個(gè)siRNAs（分別以不同的濃度），轉(zhuǎn)染試劑和Opti-MEM (Invitrogen)-一種多用途培養(yǎng)基混合，室溫下孵育1520分鐘，加入siRNAs轉(zhuǎn)染混合物并適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基的體積。溫育48小時(shí)后收獲細(xì)胞，分別進(jìn)行RNA水平分析 和蛋白表達(dá)分析。 D. RNA純化和分析： 常規(guī)試劑盒抽提總RNA，以分光光度劑定量。目標(biāo)靶mRNA的表達(dá)水平通過Northern或者是定

60、量RT-PCR（ ABI7700）雙標(biāo)探針檢測。E. 蛋白表達(dá)分析： 目標(biāo)靶基因和無關(guān)對照的蛋白表達(dá)水平通過Western方法檢測?；蛘哂妹庖邿晒夥z測。F. 對照： 對于全部樣品，在分析目標(biāo)靶mRNAs和蛋白表達(dá)水平的同時(shí)，至少有一個(gè)不相關(guān)基因的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平同時(shí)進(jìn)行分析作為對照 九、RNase的起源 人們推測RNase可能起源于細(xì)菌，并且通過水平傳遞進(jìn)入到了早期的真核細(xì)胞 十、真核基因表達(dá)調(diào)控真核基因表達(dá)調(diào)控 Control of gene expression in eukaryote 引 言 在高等真核生物中，各種細(xì)胞表型的差異很大程度上取決于那些由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的可編碼