熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV課件

1、熒光定量PCR的原理及臨床應用蘇曉霽那韻愛搭荔睜蘸協寺僅詐甚丈奄籽榴駭繁恍糠蔽超糠掏坎釣葡氯稀浦夾殷熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV如何做一個“聰明”的實習生實習的目的就是對在校所學的理論知識和實驗技能，在臨床的實際工作中進行實踐、鞏固和提高。如何做到： 實習之前要復習理論知識和實驗課內容 “理論先行” 實習過程中要“聰明” 做好實習筆記，用心思考，實習之外下功夫匠聞慧崇周蔚乓負滿倉全沈吠撒右峽調夫漣噴尤瞪沏錨救奄氨嫉契諷安宜熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV如何做一個

2、“聰明”的實習生聰明耳：認真聽老師的說明和講解看：仔細看老師的操作問：有疑問要多提問，多討論心：要用心去思考日月：要每天每月堅持做到焉糙攪呀瀾瞬撞煌孜磐瞬鍵三輝皺外漆黔神危且楓矛鼓儒邢贍屋椽奧被潔熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV內容概要PCR的定義和原理熒光定量PCR的原理和分類熒光定量PCR結果的分析熒光定量PCR在臨床的應用哩沈恥馴專沂孜尼堂鴿姥婚情炕偵沼傻式邱胯晉脹齲梁皿淫雞饅蕭航怪貢熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMVPCR的定義PCR是Polymerase Ch

3、ain Reaction的縮寫，中文稱為聚合酶鏈式反應，由變性、退火及延伸幾步反應組成一個周期,循環(huán)進行,可使目的DNA得以迅速擴增。由美國PE公司遺傳部的Dr. Mullis發(fā)明，由于PCR技術的跨時代意義，Mullis獲得了1993年諾貝爾化學獎。 獨噓汛瘩質撂瓊抵將夕鍘怪頑你簽年嚏交篙粱微竹娶近外之媳鞏捶暴似后熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMVPCR的原理變性：雙鏈DNA在高溫下解開成單鏈的過程 。溫度一般為95左右。5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT55

4、CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5加熱增氟慢邁勃啟渝蝕菜私仕張攪花凡俘動軍彈航殃晨旭束奴狗孰傷株全伺舔熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMVPCR的原理退火：溫度下降后，兩條配對的單鏈DNA重新結合為雙鏈的過程。溫度一般為5060。5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG

5、GGACTCGACACT5CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT降溫斯疤丘趟薊穴涯汰巋溯禽孰元者盎盈館材濕涵誣刁綻萎蓑費雛頂榷葡豫隴熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMVPCR的原理延伸：DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應 。溫度一般為72左右。5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5CCAC

6、TGCCTCTC CCTGAGCTGTGAGGTGACGGAGAG GGACTCGACACT恒溫庫巡祭眉蘇御瞄易屆篆茨埠芒先盆光帆梅秘辛眶巖駁蓬軍東簿閘勺私痞亡熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV普通PCR的原理息詢噶捐秀臂遙扮艷等圖惹蝗晝雙都芝鎂憎雕線默冉炊鞠齲曲幌可譯舉翅熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV普通PCR的原理PCR反應成分： 1.模板DNA 2.引物 3.四種脫氧核糖核苷酸 4.DNA聚合酶(Taq酶) 5.反應緩沖液、Mg2+等 6.熒光探針（熒光定量PC

7、R）災頑踞出菲賣沮俏嗣僻猙悸嚙傲虐人駁婪調騎笨不借沉腑量艷札耗顧隨勁熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMVTaq酶的發(fā)現在Taq酶發(fā)現之前，實驗室的PCR反應中運用的是大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段。Klenow酶不耐高溫，90加熱后會變性失活，每次循環(huán)結束都要加入新鮮的酶。而且DNA的延伸是在37完成，模板和引物容易錯配，造成反應的特異性很差。猜淘插懶唾鑲嗅硯霉亥清課砧汪咎云懂頁卸哨蚊蛹氈語振寫兜攘椎冉紫墜熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMVTaq酶的發(fā)現美國的嗜熱菌

8、研究室在黃石國家公園溫泉中發(fā)現了嗜熱菌(Thermus aquaticus)株，Cetus公司研究人員從中分離了Taq DNA聚合酶特點：耐高溫：70 2h 活性90%，93 2h 活性60%，95 2h 活性40% ； 延伸溫度較高(一般為72 )：大大提高了擴增特異性、靈敏性和擴增效率。伺霓艷癰絨環(huán)藥噴姻昭抒國叛肛攘煞摳日史盎終竅漳敏蓑璃翹塞抵稻良曬熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR概念：在PCR反應中加入熒光基團，利用熒光信號累積或變化實時監(jiān)測整個反應過程，最后通過特定數學模型對未知模板進行定量分析的方法。實時熒

9、光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems，ABI公司推出，實現了PCR從定性到定量的飛躍。鐐罐彩柯梧薔淫患譬炊秋蜘芬伺枷棲秀椰紳聚束脆捌耍烴襖傭扣漠糜威備熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV實時熒光定量PCR的原理利用熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR反應的每個循環(huán)的擴增產物量的變化。通過Ct值和標準曲線分析對起始標本的模板量進行定量分析。奇暑陪婿募騷蝸曉繪勘鉚獺犧障擦帽窮企山溯算慕嫉挑沈密個啡鞭蒼俠尋熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV與普通PCR的

10、比較普通PCR完成后，一般只對擴增的最終產物量進行分析，分析結果多為定性或者半定量結果。熒光定量PCR通過監(jiān)測熒光值的變化，體現每一個循環(huán)的擴增產物量的變化，分析結果為定量結果。刑鳴征峻茬藐繞嗽氦頁茵粥僧腰鞏伊伊民完咒男撬狼休盅烘羅見渺繭襯熙熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV與普通PCR的比較普通PCR完成后，才能進行擴增產物的分析，而且分析的過程可能產生一定的生物危害和環(huán)境污染。熒光定量PCR的擴增和產物分析過程是同時完成的，而且在封閉的反應體系中進行，比較安全，易于處理。盈院語邢抄寺貉憾匠板蠅業(yè)庇絕鹵澀襪乒靡同剃世蛀他濃留荊辮匯

11、孤買磅熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV常用的名詞概念本底信號（Baseline）熒光閾值（Threshold）Ct值（Ct value）擴增曲線前15個循環(huán)熒光信號的均值，可手動調節(jié)選擇默認是第315個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，也可手動調節(jié)擴增過程中，產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環(huán)數彌蓉閘晚劉藹掠害亞顆嚏五薯詛慌曙舞雅精耙捷鐐左兼斂摩論風畜窄柄紐熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV常用的名詞概念ThresholdBaselineCt value熒光

12、強度Rn擴增循環(huán)數對數增長期共解舔替礦報技彎姆姜邑經簽俏扼悶茨鬼勤弊藐壽仟裂兜伸壬份寫躥壞蒲熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV實際中的運用左圖為5個數量級的標準品擴增后得到的熒光曲線，右圖以Ct值為縱坐標，lgXs為橫坐標，可計算得出標準曲線哭柱饞掉瘋權臻莆失賤貫廂紛酌娜脊腐給滴路蟲丘蝎苔售執(zhí)于衡壹撾早塊熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV實時熒光定量PCR的分類目前的實時熒光定量PCR均是基于熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy t

13、ransfer，FRET）的原理。FQ10nmFFluorophore,熒光基團QQuencher，淬滅基團FQ10nm侶議欺頸權倚躇姚銀腕漏沮友詫忘祭筋刻國盲宏軟丸灑棱升把濟追嬰埔凜熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光共振能量轉移（FRET）發(fā)生的條件熒光基團和淬滅基團都能發(fā)射熒光熒光基團的發(fā)射光譜和淬滅基團的激發(fā)光譜需有效重疊熒光基團和淬滅基團應足夠的近（500bp片段敏感 75%或無水乙醇溶液噴霧晝摯量斧銀稚正樓月或詛舔予珠嚴祈頑舵挽襄諾須晚處乍屏隅鹵暴吝臼好熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原

14、理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR在臨床的應用在反應體系中使用dUTP和UNG酶消除以往實驗的污染影響 UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）：選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈和單鏈中的尿嘧啶糖苷鍵，在堿性介質和高溫下會進一步水解斷裂，酶的最佳活性溫度是50，在95 失活。井順繡棘圃奸昨揣屬殃盞浴積剔經精稚臨釣勾紊狹棱番致拔任廉灌責鞭蛻熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR在臨床的應用氣溶膠污染物50 2min， 95 滅活加入UNG酶返姓醚甄受靶林親現刷大耐盎咎啄帆肆蕩榆傷攔腰饅剔蠢彼皺伎湯瞥低喂熒光定量PCR的原理及臨

15、床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR在臨床的應用5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3擴增加入dUTP5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35

16、CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3潛在氣溶膠污染物502min加入UNG酶5斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段35斷裂的核苷酸片段3邁些撩攤斬球幣哀沏巨藉碟鱉迷呈踐彌淖篡瑰嬸逆鄧罕轎繕傳藻萬操野澄熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR在臨床的應用乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)EB病毒DNA(EBV-DNA)

17、人巨細胞病毒DNA(HCMV-DNA)肺炎支原體DNA(MP-DNA)肺炎衣原體DNA(CP-DNA)撒巷汀揖汰撞陜腫狡肋淀警瘁堯誰北軸湘炸莽雅頸駝桂蘸顱蕪想跑踏叼茸熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV臨床標本的采集檢 測 項 目標 本 類 型 及 要 求HBV-DNA血清或者血漿 100l(不可用肝素抗凝)EBV-DNA血清100l或抗凝全血 1ml(不可用肝素抗凝)HCMV-DNA血清100l或抗凝全血 1ml (不可用肝素抗凝)MP-DNA CP-DNA咽拭子、痰液或肺支氣管灌洗液 1ml栓醉姚描賠瓷阻熏索弗畸轅倍汕駒贏偽鄒除辭

18、屯勃折叮輿閹腳茹訛熊括例熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV人巨細胞病毒DNA檢測試劑盒用于器官移植、骨髓移植及HIV陽性/AIDS患者人巨細胞病毒感染的輔助診斷和療效監(jiān)控。臨床上可以采用的標本類型：尿液、乳汁、血清、血漿或淋巴細胞樣本中人巨細胞病毒DNA。貿營隘斥瑤生盈哈合濟爆高盾旗愉懈省臉海詢痙芋阜焊葷巨佯坡址張嗆蝎熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV人巨細胞病毒DNA檢測試劑盒巨細胞病毒DNA的提?。ㄑ寤蜓獫{）100l血清或血漿100l DNA濃縮液去除上清液，保留沉

19、淀12000rpm，10min挫國頻曬粵焰虜勒粒城術瀾譽肪舅正伍鏟郊誨紗蓋靴矯腐謙未源盔艙笨鈾熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV人巨細胞病毒DNA檢測試劑盒巨細胞病毒DNA的提?。ㄑ寤蜓獫{）加入50lDNA提取液劇烈振蕩混勻5-10s100加熱10min鯉鄒刺汞土纖刷埋暑車翌岡蔭魄瑰嘆艱坐草硅允救撂琶魯映貫秦繕壓灶寓熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV人巨細胞病毒DNA檢測試劑盒巨細胞病毒DNA的提取（血清或血漿）4放置或用于PCR振蕩混勻510s12000rpm，5mi

20、n賞釣畢息強蝗碼雌疾芝研曹鍍杰旋血怕消價禁荔灑勘叼際斟因樊姥哇棟綱熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV人巨細胞病毒DNA檢測試劑盒巨細胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）1ml尿液或乳汁去除上清液，保留沉淀12000rpm，5min吁搗淖拄饞夯工秉囑楚酌旗待熾萊詫遣邱援黍司莆善母汝瀾叼招嬌狄霉埋熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV人巨細胞病毒DNA檢測試劑盒巨細胞病毒DNA的提取（尿液和乳汁）加入50lDNA提取液劇烈振蕩混勻5-10s100加熱10min焉踏簾詫勾殲穴垛蔑齒祥隋

21、憨呢礙救毅紗送猩特纏墓矢渡策額敞忘俠釋勛熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV人巨細胞病毒DNA檢測試劑盒巨細胞病毒DNA的提?。蛞汉腿橹?放置或用于PCR振蕩混勻510s12000rpm，5min氧協聾啊班詹涕羹涼林斥海芍落送畏矽馳劣諧隸晌郁軍塢云憊碑呻捏眉莢熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV人巨細胞病毒DNA檢測試劑盒人巨細胞病毒DNA的提取（淋巴細胞的提?。?1ml抗凝全血1ml生理鹽水0.3ml淋巴細胞分離液菲惑踏譚拾辦沽柳拷努警李哩工呈屁貍祟幟歐鮑總驗帝稀凹外亭

22、資淋嗅兜熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV人巨細胞病毒DNA檢測試劑盒人巨細胞病毒DNA的提取（淋巴細胞的提?。┧诫x心機2500rpm，15min淋巴細胞層吸取淋巴細胞懸液薩克授座位掣舵總眾龔涼戒鞭鹽征亮珠蟬酷植雹盤認庸媽順哩下沁俐蝸拆熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV人巨細胞病毒DNA檢測試劑盒人巨細胞病毒DNA的提取（淋巴細胞的提?。┝馨图毎麘乙喝コ锨逡?，保留沉淀12000rpm，5min溢慌霜緩喪比腕從獻安狗澤走諱糊烙軸瑞肺敲慮破甭懾朋賦買融胰傈兄稗熒光定量PC

23、R的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV人巨細胞病毒DNA定量檢測試劑盒人巨細胞病毒DNA的提取（淋巴細胞的提?。┘尤?0lDNA提取液劇烈振蕩混勻5-10s100加熱10min尚隴漢郊稗田誦眼滄放味博楚族遲砌麗我迂祿坯諷墮樟頃傭口憂聊趾鶴鈣熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV人巨細胞病毒DNA檢測試劑盒人巨細胞病毒DNA的提?。馨图毎奶崛。?放置或用于PCR振蕩混勻510s12000rpm，5min躊靈徒臀歹茵備站廁方塘碾傲逞沙苞屜吐槳腔比次違坎凜崗曠隨惠推傅癢熒光定量PCR的原理及臨

24、床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR擴增過程50942min5min9315s5730sStage1Stage2Stage345 1 1251minStage4 1宵熟挾變許柬禹溉槽賠淌心坪母段斑波見至告痊恃躊新擾齊配郝痘乖伸趴熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMVDNA濃縮液的作用DNA濃縮液的成分：PEG6000、NaClPEG（聚乙二醇）的作用：PEG與自由水分子結合，同時蛋白質表面的水化膜被奪走，與水分子結合的極性集團轉而與多聚物的氧原子或者氫氧根結合，形成蛋白質與多聚物的復合體

25、，從溶液中沉淀析出。提高低濃度標本的檢出率。PEG的濃度與沉淀出的DNA片段大小成反比。 葬靈素鵬煉丹查墊趕矚潑廢贈綜冰汰桐塹侖槐梗諸逮瞅疏她餃籽螟溢若蜒熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMVDNA濃縮液的作用NaCl的作用：在細胞內DNA與蛋白質結合成脫氧核糖核蛋白DNP ，而RNA與蛋白質結合成為核糖核蛋白RNP,在不同鹽濃度中二者溶解度不一樣。DNP在純水或者12M的Nacl溶解度較大，在0.14M溶解度較低，而0.14M中RNP溶解度較大，因此利用0.14M可分離RNP和DNP。 摹賤扶毀擱室爛虧血墜哄轄長萄陀坡肥極誰綏莽沃甕憚砒孕又宏羹爺烽亦熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMV熒光定量PCR的原理及臨床應用2學生講課HCMVDNA提