藥物分析中的新技術(shù)、新方法課件

1、 藥物分析中的新技術(shù)、新方法第一節(jié)：手性藥物的色譜分析法一、手性藥物的現(xiàn)狀手性藥物（579）藥物（1992）天然和半合成藥物（556）合成藥物（1436）非手性藥物（857）單一異構(gòu)體（73）外消旋體（506）手性藥物（547）非手性藥物（9）單一異構(gòu)體（537）外消旋體 （10）二、手性藥物對(duì)映體的藥效學(xué)差異1. 治療作用完全依賴一種異構(gòu)體。2. 藥理作用差別不大。 如：異丙嗪3. 藥理作用類似，但反應(yīng)強(qiáng)度有差別。4. 藥理與毒理作用存在“質(zhì)”的區(qū)別。三、手性藥物對(duì)映體的藥動(dòng)學(xué)差異： 1. 吸收。 2. 蛋白結(jié)合。 3. 代謝。四、手性衍生化特點(diǎn)：需要高光學(xué)純度的手性衍生化試劑；反應(yīng)繁瑣費(fèi)時(shí)

2、；衍生化反應(yīng)速率重現(xiàn)性較差；使用價(jià)格便宜、柱效較高的非手性柱；衍生化過(guò)程可同時(shí)純化樣品。 1. 間接法拆分對(duì)映異構(gòu)體即衍生化試 劑法（CDR）。 2. 直接法拆分對(duì)映異構(gòu)體。 手性固定相法（CSP） 手性流動(dòng)相添加劑法（CMP）五、手性藥物拆分的高效液相色譜 法分類： 采用非手性固定相如:柱前衍生化-反相高效液相色譜法 拆分酮洛芬對(duì)映異構(gòu)體S-()-酮洛芬 R-(-)-酮洛芬 酮洛芬對(duì)映體的柱前衍生化示意圖酮洛芬對(duì)映體的柱前衍生化方法：酮洛芬對(duì)照品溶液(1 mg/mL) 0.1 mL加入正己烷0.6 mL二氯亞砜溶液0.2 mL751 h冷卻至室溫吹干后加入S-NEA溶液0.2 mL5 min

3、振搖加入2.0 mol/L H2SO4 0.5 mL混勻吹干后溶解進(jìn)樣二氯甲烷:乙醚2:1色譜條件色譜柱：Hypersil C18, 5 m, 1505.0mm ID， 流動(dòng)相：乙腈水-乙酸-三乙胺 (55 : 45 : 0.1 : 0.02，v/v)，流速： 1 ml/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm酮洛芬對(duì)映體衍生化物色譜圖：RS酮洛芬對(duì)映體衍生化物的保留時(shí)間為tRs=7.3 min，tRr=8.5 min，分離度為1.9常用的手性固定相： 1） Pirkle型相. 2） 合成多聚相. 3） 環(huán)糊精鍵合相.特點(diǎn):1）適用范圍廣2）制備分離方便3）定量分析的可靠性高4）價(jià)格昂貴奈基乙脲鍵合硅

4、膠柱拆分蘇氨酸（A）和苯丙氨酸（B）的p-溴代苯甲酰胺衍生物對(duì)映體色譜圖3. 手性流動(dòng)相添加劑法-CMP 將手性試劑添加到流動(dòng)相中，利用手性試劑與藥物消旋物中各對(duì)映體結(jié)合的穩(wěn)定常數(shù)不同，以及藥物與結(jié)合物在固定相上分配的差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)映體的分離。常用的手性添加劑：1） 配基交換型手性添加劑2）手性離子對(duì)絡(luò)合劑3）環(huán)糊精添加劑(CD)17特點(diǎn)：1）可采用普通的非手性固定相2）不需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化3）手性添加物的可變范圍較寬第二節(jié)：高效毛細(xì)管電泳（HPCE） 毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis, CE）也稱高效毛細(xì)管電泳（HPCE）或毛細(xì)管電分離法（CESM），是一種以毛細(xì)

5、管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離分析技術(shù)。由于CE可以分離從離子到中性分子；從小分子到生物大分子的一系列化合物，尤其是以生物工程為代表的生命科學(xué)領(lǐng)域中的多肽、蛋白質(zhì)、DNA的分離。因此，CE被認(rèn)為是當(dāng)代分析科學(xué)中最具活力的前沿研究領(lǐng)域。高壓電源毛細(xì)管恒溫系統(tǒng)檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)毛細(xì)管緩沖液/樣品緩沖液（+）()毛細(xì)管電泳裝置示意圖 在柱檢測(cè)器 HPCE是經(jīng)典電泳技術(shù)與現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的一種快速、高效的液相分離技術(shù)。具有以下特點(diǎn)： 1. 高效率：柱子長(zhǎng)，故理論塔板數(shù)大。 2. 高靈敏度：CE分離后一般用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法（LIF）或安培電化學(xué)檢測(cè)法（EC），可檢測(cè)到10-19m

6、ol/L，甚至到單細(xì)胞檢測(cè)。 2. 高速：做一個(gè)樣只需幾十秒到幾十分鐘。 3. 微量：進(jìn)樣1L即可。 4. 低成本： 5. 易于自動(dòng)化：（一）基本原理：v = veo+ vep = (eo+ep) E veo:電滲流速度； eo: 電滲流淌度 vep:電泳流速度；ep: 電泳流淌度E：電場(chǎng)強(qiáng)度； v: 遷移速度+()( + )電滲產(chǎn)生示意圖：()+-毛細(xì)電泳中不同組分的遷移示意圖：( + )27 （二）主要分離模式： 1. 毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）； 2. 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜 （MECC）； 3. 毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）； 4. 毛細(xì)管等電聚焦電泳 （CIEF）； 1. 毛細(xì)管區(qū)帶電泳：（c

7、apillary zone eletrophoresis, CZE） 是最基本、最常用的分離模式。 適用于所有具有不同淌度的荷電粒子的分離，但不能分離中性物質(zhì)及質(zhì)荷比相同的組分。 2. 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜： （micellar eletrokinetic capillary chromatography, MECC） 用離子膠束溶液代替簡(jiǎn)單的緩沖溶液，使中性組分可按其疏水性的不同及在兩相間的分配系數(shù)的不同而分離。采用手性分配相，可用于手性化合物的分離。 3. 毛細(xì)管凝膠電泳： （capillary gel eletrophoresis, CZE） 凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)溶質(zhì)具有分子篩的作用，可分離質(zhì)

8、荷比相同但分子大小不同的組分。 在分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)上有著十分廣泛的應(yīng)用。4. 毛細(xì)管等電聚焦電泳： （capillary isoelectric focusing, CIEF） 根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同而進(jìn)行分離。AAAAAABBBBBBCCCCDDDDDEEEEEFFAAAABBBBCCCCDDDDEEEEFFFFpH梯度高低模式緩沖液體系分離機(jī)理CZE自由緩沖液離子淌度MECC膠束緩沖溶液疏水性/離子性相互作用CGE凝膠緩沖溶液分子大小和荷電數(shù)目CIEF兩性電解質(zhì)等電點(diǎn)分離模式小結(jié)：毛細(xì)管區(qū)帶電泳膠束動(dòng)電毛細(xì)管色譜毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管等電聚焦應(yīng)用：1. 監(jiān)測(cè)藥物生產(chǎn)過(guò)程 如：監(jiān)測(cè)青霉素

9、發(fā)酵液中有關(guān)物質(zhì)的量。青霉素發(fā)酵液的高效毛細(xì)管電泳圖：1. 青霉素G鈉 ；2. 6-APA ；3. 對(duì)羥基苯乙酸 ；4. 鄰羥基苯乙酸 ；5. 苯乙酸2. 中藥成分分析 如：黃酮及其甙類分析黃芩中6種黃酮類成分的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜分離圖：1.漢黃芩甙；2. 黃芩素；3.黃芩甙；4. 千層子素；5. 漢黃芩素；6.內(nèi)標(biāo)水楊酸；7.白楊素3. 手性拆分4. 體內(nèi)分析第三節(jié)：質(zhì)譜法及其應(yīng)用進(jìn)樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測(cè)器控制和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)真空系統(tǒng)一、離子源及離子化技術(shù) 1、EI（電子轟擊離子化）V加速電壓試樣蒸汽陰極陽(yáng)極電子束離子xyz電子轟擊質(zhì)譜示意圖： 優(yōu)點(diǎn)： 靈敏度高，有豐富的碎片離子信息和成熟

10、的離子開(kāi)裂理論，是結(jié)構(gòu)分析、鑒定的有力手段；重現(xiàn)性好，有標(biāo)準(zhǔn)圖譜，可以通過(guò)譜庫(kù)檢索對(duì)未知物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。 缺點(diǎn)： 樣品須汽化后才可離子化 適用化合物： 易揮發(fā)、熱穩(wěn)定化合物。 2、CI（化學(xué)離子化） 軟電離技術(shù) 優(yōu)點(diǎn)： 可以得到較強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子峰，有利于分子量的測(cè)定。 缺點(diǎn)： 樣品須汽化后才可離子化。 適用化合物： 易揮發(fā)、熱穩(wěn)定化合物 。+快原子槍樣品靶原子束質(zhì)量分析器二次離子束快原子轟擊質(zhì)譜示意圖:3、FAB（快原子轟擊離子化） 軟電離技術(shù)： FAB的特點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)： 樣品不須汽化；既給出化合物的分子量信息，又給出結(jié)構(gòu)信息。 適用范圍廣，儀器商品化較早，普及率高。 缺點(diǎn)： 重現(xiàn)性差，靈敏度較

11、EI低。 適用化合物： 極性、高分子量、非揮發(fā)性及熱不穩(wěn)定化合物。 4、MALDI（基質(zhì)輔助激光解吸離子化） 軟電離技術(shù) 優(yōu)點(diǎn)： 通常只給出分子離子峰（或準(zhǔn)分子離子 峰）。 適用化合物： 蛋白質(zhì)、多肽、寡核苷酸等生物大分子。5、API（大氣壓離子化） 軟電離技術(shù) （1）ESI（電噴霧離子化） 特點(diǎn)： 能夠產(chǎn)生多電荷離子。 適用化合物： 對(duì)生物大分子及其他分子量大的 化合物的分析較有利。+毛細(xì)管+ 4kV含離子的液滴隨液滴蒸發(fā)，電場(chǎng)加強(qiáng)，離子向表面移動(dòng)離子從表面蒸發(fā)離子蒸發(fā)機(jī)理：（2）APCI（大氣壓化學(xué)離子化） 最軟的電離方式之一 特點(diǎn)： 一般只給出化合物的分子量信息，通過(guò)源內(nèi) CID（碰撞誘

12、導(dǎo)分解）可同時(shí)獲得結(jié)構(gòu)信息。 適用化合物： 與ESI比較，更適于分析極性及分子量 ?。?000 amu）的化合物。反應(yīng)氣等離子體Corona放電電極真空樣品+溶劑霧化氣加熱管APCI電離原理：二、質(zhì)量分析器及質(zhì)量分離原理 1、扇型磁場(chǎng)質(zhì)譜儀。 2、四極質(zhì)譜儀。 3、飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。 4、離子阱質(zhì)譜儀。親子鑒定親子鑒定方法 親子鑒定就是利用醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和遺傳學(xué)的理論和技術(shù)，從子代和親代的形態(tài)構(gòu)造或生理機(jī)能方面的相似特點(diǎn)，分析遺傳特征，判斷父母與子女之間是否是親生關(guān)系。原始的親子鑒定方法 外貌對(duì)比法：通過(guò)外貌長(zhǎng)相的對(duì)比來(lái)確定親子關(guān)系恐怕是最原始的方法，但這樣方法只是一種猜測(cè)、判斷，作為一種參考。

13、滴骨驗(yàn)親法：滴骨驗(yàn)親法就是將生者的血液滴在死人的骨骸上，若血液能滲透入骨則斷定生者與死者有血源關(guān)系，否則就沒(méi)有。這種方法并不科學(xué)，但開(kāi)創(chuàng)了用血型鑒別血源關(guān)系的先河。 滴血驗(yàn)親法：滴血驗(yàn)親法又稱合血驗(yàn)親法，就是將小孩的血與大人的血液放在一起，如果能融在一起，就是父母親生的，否則就不是親生的。這種方法沒(méi)有科學(xué)依據(jù)，親子關(guān)系的血液不一定能融合，而非親子關(guān)系的血倒有可能融合。現(xiàn)代的親子鑒定方法血型測(cè)試：血型測(cè)試進(jìn)行親子鑒定就是通過(guò)對(duì)血型的檢驗(yàn)比對(duì)來(lái)確定親子關(guān)系。依據(jù)19世紀(jì)末被公認(rèn)的孟德?tīng)栠z傳定律，人們認(rèn)識(shí)到人類的血型是按照遺傳基因傳給下一代，故一定血型的父母所生子女也具有相應(yīng)的血型，這為血型鑒定親子

14、關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。染色體多態(tài)性鑒定：20世紀(jì)80年代，醫(yī)學(xué)家們又開(kāi)創(chuàng)了使用染色體多態(tài)性鑒定親子關(guān)系的技術(shù)，染色體多態(tài)性又稱異態(tài)性（heteromorphism)，是指正常人群中常見(jiàn)的各種染色體形態(tài)的微小變異（如：隨體增大、重復(fù)或缺如，著比粒區(qū)的熒光強(qiáng)度變異等），這種多態(tài)是可以遺傳的。這項(xiàng)技術(shù)就是利用其形態(tài)來(lái)鑒定親子關(guān)系，這要靠技術(shù)人員的主觀判斷，其準(zhǔn)確率也不盡如人意。 DNA鑒定：鑒定親子關(guān)系目前用得最多的是DNA分型鑒定。人的血液、毛發(fā)、唾液、口腔細(xì)胞及骨頭等都可以用于親子鑒定。一個(gè)人有23對(duì)（46條）染色體，同一對(duì)染色體同一位置上的一對(duì)基因稱為等位基因，一般一個(gè)來(lái)自父親，一個(gè)來(lái)自母親。如果檢

15、測(cè)到某個(gè)DNA位點(diǎn)的等位基因，一個(gè)與母親相同，另一個(gè)就應(yīng)與父親相同，否則就存在疑問(wèn)了。利用DNA進(jìn)行親子鑒定，只要作十幾至幾十個(gè)DNA位點(diǎn)作檢測(cè)，如果全部一樣，就可以確定親子關(guān)系，如果有3個(gè)以上的位點(diǎn)不同，則可排除親子關(guān)系，有一兩個(gè)位點(diǎn)不同，則應(yīng)考慮基因突變的可能，加做一些位點(diǎn)的檢測(cè)進(jìn)行辨別。DNA親子鑒定，否定親子關(guān)系的準(zhǔn)確率幾近100%，肯定親子關(guān)系的準(zhǔn)確率可達(dá)到99.99%。 從專業(yè)角度來(lái)講，DNA親子鑒定是根據(jù)遺傳學(xué)原理，用現(xiàn)代生物技術(shù)，對(duì)被鑒定者進(jìn)行特定DNA片段的提取和檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)的計(jì)算分析，得出鑒定結(jié)論的過(guò)程。 DNA親子鑒定的主要方法：DNA是從幾滴血,腮細(xì)胞或培養(yǎng)的

16、組織纖內(nèi)提取而來(lái)，用疇素將DNA樣本切成小段,放進(jìn)喱膠內(nèi),用電泳槽推動(dòng)DNA小塊使之分離-最細(xì)的在最遠(yuǎn), 最大的最近，之後,分離開(kāi)的基因放在尼龍薄膜上,使用特別的DNA探針去尋找基因,相同的基因會(huì)凝聚于一,然后,利用特別的染料,在X光的環(huán)境下,便顯示由DNA探針凝聚于一的黑色條碼。這種肉眼可見(jiàn)的條碼很特別-一半與母親的吻合,一半與父親的吻合.這過(guò)程重覆幾次,每一種探針用于尋找DNA的不同部位并影成獨(dú)特的條碼,用幾組不同的探針,可得到超過(guò)99,9%的父系或然率或分辨率.DNA鑒定的具體步驟：1.破碎細(xì)胞，釋放DNA 血中的DNA與核蛋白結(jié)合，位于血細(xì)胞的細(xì)胞核中，正常情況下是不會(huì)釋放出來(lái)的。為了

17、使DNA從細(xì)胞核中釋放出來(lái)，需要向血細(xì)胞液中加入蒸餾水，并且攪拌，從而使血細(xì)胞膜和核膜脹破。用玻璃棒攪拌可以加速細(xì)胞的破裂。一般510mL的血細(xì)胞液加入20mL蒸餾水?dāng)嚢?min。釋放出來(lái)的大量DNA和RNA往往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，應(yīng)用34層紗布進(jìn)行過(guò)濾，除去一些顆粒較大的雜質(zhì)。2溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA 在濃度較高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚，游離出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入兩倍體積的濃度為2mol/L的NaCl溶液，攪拌1min。注意應(yīng)沿一個(gè)方向攪拌，使DNA充分溶解。3DNA的析出 將溶液中的DNA與其他雜質(zhì)分離，這一步是關(guān)鍵。加蒸餾水降低NaCl溶液濃度，使DNA析出。注意加水太

18、多、溶液過(guò)稀，會(huì)使DNA分子又重新溶解。 用34層紗布對(duì)DNA稀釋液進(jìn)行過(guò)濾，濾去蛋白質(zhì)，收集DNA的黏稠物。如果采用離心法，效果更好。用4 000 r/min轉(zhuǎn)速的離心機(jī)，離心15min，除去上清液(含有蛋白質(zhì))，留下的沉淀物中含有DNA。此時(shí)注意觀察DNA黏稠物的顏色。4.DNA的初步純化如果提取的DNA量不夠多且其中含有較多雜質(zhì)，會(huì)使制取的DNA粗制品不能顯示出DNA的本色白色。需要對(duì)DNA粗制品進(jìn)行簡(jiǎn)單的提純，將DNA黏稠物再溶解，繼續(xù)用2mol/L的NaCl溶液20mL溶解DNA黏稠物，仍舊沿一個(gè)方向不停攪拌3min，使DNA充分溶解，以免損失。用34層紗布進(jìn)行過(guò)濾（或離心），濾去雜質(zhì)，收集含有DNA的濾液。向?yàn)V液中貼壁緩慢加入50mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為95的乙醇，并用玻璃棒朝一個(gè)方向緩慢、均勻地?cái)嚢?，溶液中?huì)出現(xiàn)DNA絲狀物。 DNA的純化還有許多其他方法。例如，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液，使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開(kāi)。隨后，加入氯仿異丙醇混合液（體積比為241），通過(guò)離心將蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)除