高效液相色譜基線的各種問題

1、高效液相色譜基線的各種問題L、基線漂移原因解決方法1、柱溫波動。（即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差檢測器、 電導(dǎo)檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。）1、控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器圖2、流動相不均勻。（流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移。）2、使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動相在使用前進行脫氣，使用中使用氨氣。3、流通池被污染或有氣體3、用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用 1N的硝酸。（不要用鹽酸）4、檢測器出口阻塞。（高壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線）4、取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手

2、冊更換流通池窗。5、流動相配比不當(dāng)或流速變化5、更改配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速。6、柱平衡慢，特別是流動相發(fā)生變化時6、用中等強度的溶劑進行沖洗，更改流動相時，在分析前用10-20倍體積的新流動相對柱子進行沖洗。7、流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成7、檢查流動相的組成。使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級的溶劑8、樣品中有強保留的物質(zhì)（高 K值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個逐步升高的基線。8、使用保護柱，如有必要，在進樣之間或在分析過程中，定期用強溶劑沖洗柱子。9、使用循環(huán)溶劑，但檢測器未調(diào)整。9、重新設(shè)定基線。當(dāng)檢測器動力學(xué)范圍發(fā)生變化時，使用新的流動相。10、

3、檢測器沒有設(shè)定在最大吸收波長處。10、將波長調(diào)整至最大吸收波長處M、基線噪音（規(guī)則的）原因解決方法1、在流動相、檢測器或泵中有空氣1、流動相脫氣。沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣。2、漏液 圖2、見第三部分。檢查管路接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正 常的噪音。如有必要，更換泵密封。3、流動相混合不完全 3、用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑4、溫度影響（柱溫過高，檢測器未加熱）4、減少差異或加上熱交換器5、在同一條線上有其他電子設(shè)備5、斷開LC、檢測器和記錄儀，檢查干擾是否來自于外部，加以更正。6、泵振動6、在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器N、基線噪音（不規(guī)則的）原因解決方法1、漏液 圖1

4、、見第三部分。檢查接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的 噪音。如有必要，更換密封。檢查流通池是否漏液。2、流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成2、檢查流動相的組成。3、流動相各溶劑不相溶 3、選擇互溶的流動相4、檢測器/記錄儀電子元件的問題4、斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查并更正。5、系統(tǒng)內(nèi)有氣泡 5、用強極性溶液清洗系統(tǒng)6、檢測器內(nèi)有氣泡 6、清洗檢測器，在檢測器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器7、流通池污染（即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音。）7、用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池8、檢測器燈能量不足8、更換燈9、色譜柱填料流失或阻塞9、更換色譜柱10、流動相混合不均勻或混合器工作不正常10

5、、維修或更換混合器，在流動相不走梯度時，建議不使用泵的混合裝置O、寬峰原因解決方法1、流動相組成變化 1、重新制備新的流動相2、流動相流速太低 2、調(diào)節(jié)流速3、漏液（特別是在柱子和檢測器之間）3、見section 3。檢查接頭是否松動、泵是否漏液、是否有鹽析出以及不正常的噪音。如果 必要更換密封。4、檢測器設(shè)定不正確4、調(diào)整設(shè)定5、柱外效應(yīng)影響a、柱子過載b、檢測器對反應(yīng)時間或池體積響應(yīng)過大c、柱子與檢測器之間的管路太長或管路內(nèi)徑太大d、記錄儀響應(yīng)時間太長5、 a、 小體積進樣（例如：10ul而不是100ul）以1: 10或1: 100的比例稀釋樣品b、減少響應(yīng)時間或使用更小的流通池c、 使用

6、內(nèi)徑為0.007-0.01的短管路d、減少響應(yīng)時間6、緩沖液濃度太低 6、增加濃度7、保護柱污染或失效 7、更換保護柱8、更換同樣類型的色譜柱。如果新柱子可以提供對稱的色譜峰，則用強溶劑沖洗舊柱子。9、柱入口塌陷 9、打開柱入口，填補塌陷或更換柱子10、呈現(xiàn)兩個或多個未被完全分離的物質(zhì)的峰10、選擇其它類型的色譜柱以改善分離效果11、柱溫過低11、提高柱溫。除非特殊情況，溫度不宜超過 75 C12、檢測器時間常數(shù)太大12、使用較小的時間常數(shù)P、分離度降低原因解決方法1、流動相污染或變質(zhì)（引起保留時間變化）1、重新配置流動相2、保護柱或分析柱阻塞圖2、去掉保護柱進行分析。如果必要則更換保護柱。如

7、果分析柱阻塞，可進行反沖。如果問題仍然存在色譜柱可能被強保留的污染物損壞，建議使用恰當(dāng)?shù)脑偕绦?。如果問題仍然存在，進口可能阻塞了，更換入口處的篩板或更換色譜柱。Q、所有的峰面積都太小一原因解決方法1、檢測器衰減設(shè)定過高1、減少衰減的設(shè)定2、檢測器時間常數(shù)設(shè)定太大 2、設(shè)定較小的時間常數(shù)3、進樣量太少 3、增大進樣量4、記錄儀連接不當(dāng) 4、使用正確的連接R、所有的峰面積都太大原因解決方法1、檢測器衰減設(shè)定過低1、采取較大的衰減2、進樣過多 2、減少進樣量3、記錄儀連接不正確 3、正確連接記錄儀HPLC日常維護辦法之四：進樣閥的問題以下問題在使用進樣閥過程中有可能發(fā)生。A、手動進樣閥，轉(zhuǎn)動不靈原

8、因解決方法1、轉(zhuǎn)子密封損壞 1、更換或調(diào)整轉(zhuǎn)子密封2、轉(zhuǎn)子太緊2、調(diào)整轉(zhuǎn)子的松緊度B、手動進樣閥，載樣困難原因解決方法1、進樣閥安裝不當(dāng) 1、重新安裝2、定量環(huán)阻塞 2、清洗或更換定量環(huán)3、進樣器污染 3、清洗或更換進樣器4、管路阻塞 4、清洗或更換管路C、自動進樣閥，不能轉(zhuǎn)動原因解決方法1、無壓力（或電源） 1、提供恰當(dāng)?shù)膲毫Γ娫矗?、轉(zhuǎn)子太緊2、調(diào)整轉(zhuǎn)子的松緊度3、進樣閥安裝不當(dāng)3、重新安裝D、自動進樣閥，其它問題原因解決方法1、阻塞1、清洗或更換阻塞部件2、機械故障2、見隨機維修手冊3、控制器故障 3、維修或更換控制器液相色譜基線有很多的毛刺，但總體上還是水平的，問這是什么原因?qū)е碌?

9、懸賞分：5 -解決時間：2006-7-20 21:14液相色譜基線有很多的毛刺，但總體上還是水平的，問這是什么原因?qū)е碌? 問題補充：我所用的是液相色譜，配紫外檢測器，色譜柱是新的，儀器也沒有振動。毛刺是因信號頻率的波動而引起， 是比色譜峰的有效值頻率更高的基線擾動。 毛刺的存在并 不影響色譜峰的分辨，但對檢測限有一定影響。規(guī)則的毛刺還算是正常，你把基線放寬，就相當(dāng)于靈敏度變高。先給儀器充分的穩(wěn)定時間再看看。如果真的是色譜系統(tǒng)出了問題，一般是這幾個方面的（不管是氣相還是液相都有用）：.氫氣，空氣，載氣純度不高會影響。.玻璃襯管是否臟.色譜柱是否臟，處理一下或換一個新的試一試二.檢測器清洗一下，

10、可能有未燃燒完的雜質(zhì).是否漏氣.進樣口是否該換一個墊子.儀器是否產(chǎn)生較大振動.信號接收器是否已懷或者接觸不良甚至還有過因為工作站出問題導(dǎo)致的毛刺小弟初次使用液相色譜，基線波動非常厲害怎么回事小弟科室一臺電化學(xué)液相色譜閑置兩年沒人用過，今天小弟初次使用時調(diào)節(jié)流速為0.5mL?min工作電壓設(shè)為+ 700 mV ,濾波0。1 Hz，增益5nA發(fā)現(xiàn)基線抖得很厲害，很有規(guī)律，就是每當(dāng)泵“篤” 一聲時就出現(xiàn)一個波峰，大概0.8nA高，也不出現(xiàn)基線向上向下漂移，很影響測量，請問是怎么回事，謝謝八 八 八/ /可能是色譜柱進了氣泡，又或者色譜柱還未被流動相跑平衡（如果是柱子進氣泡的話，會出現(xiàn)一組很有規(guī)律的峰

11、）其實基線的波動是難免的，只要波動在允許的范圍之內(nèi)的話，就不會影響測量你問題說的很詳細，但是你還是沒說：你的柱子有沒有恒溫箱。首先我懷疑柱溫波動。（即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。 通常影響示差檢測器、 電導(dǎo)檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。 ）解決方法：控制好柱子和流 動相的溫度。-其次，我懷疑是流動相，流動相有氣泡。流動相條件變化引起的基線波動大于溫度導(dǎo)致的波 動。解決方法：使用 HPLC級的溶劑流動相在使用前進行脫氣，有條件可以在線脫氣。如果你的泵壓也波動的話，檢查系統(tǒng)是否漏液，如果不漏液，就基本上是確定是有氣泡了。其他原因解決方法1、在流動相、檢測器或泵中有空氣

12、 1、流動相脫氣。沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣。2、漏液圖2、檢查管路接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有 必要，更換泵密封。3 J流動相混合不完全二3 J用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑二4、溫度影響（柱溫過高，檢測器未加熱）4、減少差異或加上熱交換器5、在同一條線上有其他電子設(shè)備5、斷開LC、檢測器和記錄儀，檢查干擾是否來自于外部，加以更正。6、泵振動6、在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器最近在論壇里發(fā)現(xiàn)很多蟲友在HPLC試驗中經(jīng)常受到基線波動或基線漂移的困擾，下面就我本人在實驗中積累的或從別處了解到的一些經(jīng)驗總結(jié)如下，歡迎大家指正。.液相系統(tǒng)沒有平衡好， 柱子里的流動相

13、一直在變化，在檢測器里面的吸收就會一直變化，導(dǎo)致基線波動的發(fā)生；梯度時如果其實比例的流動相平衡時間過短也會造成基線波動；.實驗室環(huán)境不穩(wěn)定（比如溫度忽高忽低，氣流不斷變化等），這對于沒有柱溫箱或只有單向溫度變化的 HPLC儀器的影響尤其明顯；即使有比較好的柱溫箱時，也要注意別讓空調(diào)的出風(fēng)口一直對照儀器吹，那樣基線也可能會波動； 此外實驗室有電磁干擾時，也有可能會導(dǎo)致此問題的發(fā)生；.檢測器的流通池被污染，造成吸收的不恒定，此時需要清洗流通池；.檢測器燈能量不足時，吸收會變得不穩(wěn)定，這時基線一般也不穩(wěn)定，特別是在低波長 處尤為明顯；.當(dāng)使用低波長檢測時， 有時流動相會使用兩相或以上的等度，這時混合

14、器的很小的混合比例的誤差都會被放大，很有可能會使基線發(fā)生波動，這時將流動相按比例混合到一個通 道里時，一般都會使情況改善很多；.流動相里的有機相的截止波長最好要大于檢測波長20nm以上，這一點切記，比如甲醇的截止波長是 210nm ,乙睛是190nm。當(dāng)使用230nm以下的檢測波長時，如果條件允 許，最好使用乙睛，可以避免基線波動，其余類推；.儀器出現(xiàn)問題也會造成基線波動，比如（1）流動相過濾頭堵塞、入口主動閥濾芯污染、單向閥被污染物堵塞、泵頭有氣泡、比例閥出故障、系統(tǒng)流路漏液，比如管路裂開、peek接頭沒完全連上色譜柱而導(dǎo)致的泄露等；.沒有脫氣機的儀器，當(dāng)流動相未脫氣或脫氣未徹底時，基線也會

15、波動；有脫氣機的每 次使用前都要檢查一下是否正常工作；.當(dāng)大家使用梯度作為組分洗脫方式的時候，有條件的最好使用超純水，磷酸鹽、三乙 胺等固體液體加入試劑也最好使用HPLC級別的，因為在梯度中隨著有機相（洗脫力較強）的不斷增加，流動相系統(tǒng)里的雜質(zhì)會在基線上反映出來，導(dǎo)致出現(xiàn)鬼峰或基線波動；.流動相中的有機相和緩沖液的比例一定要注意調(diào)配好，緩沖液的比例不能過大，要 不然會出現(xiàn)緩沖鹽在柱子里析出的情況，這樣不但會造成基線波動的發(fā)生，甚至?xí)斐缮V柱毀壞；.當(dāng)色譜柱被污染時，也會造成基線波動，這里尤其要注意的是大家在做合成中控實 驗的時候，最好不要用合成的原始反應(yīng)液直接進樣，因為原液里面有很多非極性或

16、極性很小的化合物，一旦進入到反相色譜柱里和非極性的C18發(fā)生相互作用，很可能就洗脫不下來使色譜柱變性或者慢慢的被洗脫下來，造成以后的分析出現(xiàn)不穩(wěn)定的鬼峰或者基線波動；.一些比較老的液相儀對電壓要求很高，電壓有點起伏檢測器就會反映教明顯，比如 老的惠普和島津等儀器，這時需要配一個穩(wěn)壓電源來解決此問題；此外儀器和電腦之間連接的數(shù)據(jù)線出問題或老化也可能會使基線波動。當(dāng)然上面說了這么多的原因，個人認為還不是很全面，有些沒考慮到得地方還請大家不吝補 充，以致共同進步，謝謝！高效液相色譜儀（HPLC）現(xiàn)已成為有機化學(xué)分析的重要手段之一。同樣，在食品分析中，無論是殘留分析還是成分分析，HPLC也已成為不可或

17、缺的分析儀器。和其它分析儀器一樣， 你若想讓 HPLC很好地為你工作、得到可靠的數(shù)據(jù)，首先你要保養(yǎng)好它，使它處于一個良好的待機狀態(tài)，這樣你操作它進行分析時就可以比較順利地獲得理想的結(jié)果。而且良好規(guī)范的操作習(xí)慣可以延長儀器使用壽命。 大家在學(xué)?；蚪邮軆x器公司培訓(xùn)的時候， 老師或工程師 會提出很多的操作注意事項。但要是總結(jié)歸納一下，最重要的有三點：脫氣、過濾和沖洗。本文圍繞這三點進行討論，給新從事HPLC分析的工作者一點操作建議，希望能對正確的操作儀器有一點幫助。更歡迎有經(jīng)驗的專家介紹使用經(jīng)驗，提出好建議。一一、脫氣流動相脫氣對于避免 HPLC系統(tǒng)出問題，順利得到一個理想的數(shù)據(jù)是一個很有效的措施。

18、HPLC系統(tǒng)內(nèi)是不希望有氣泡存在的。HPLC泵在輸送液體時要產(chǎn)生很大的力量，由于氣體的壓縮比與液體相比大的多，因而當(dāng)氣泡存在時，你將觀察到瞬間的流速降低和系統(tǒng)壓力下 降。如果這個氣泡足夠大，液相泵將不能輸送任何溶劑，而且如果壓力低于預(yù)先設(shè)定的壓力低限，泵將停止工作。有些泵設(shè)計可以很好地排除氣泡，而也有一些泵設(shè)計當(dāng)氣泡存在時將停止運轉(zhuǎn)。當(dāng)一個氣泡通過輸液泵時，由于系統(tǒng)壓力大，氣泡通常會溶解在流動相溶液中， 隨流動相通過柱子。 但是到達檢測器流通池時系統(tǒng)壓力又恢復(fù)到了大氣壓，因而氣泡可能在檢測器流通池中又顯現(xiàn)，在色譜圖上會出現(xiàn)不規(guī)律的毛刺。為解決這個問題，有些儀器公司設(shè)計一個反壓控制器，這樣可以在

19、檢測器出口提供足夠的壓力保持氣泡始終溶解在流動相中 直到它們流出檢測器。當(dāng)然，這個壓力不能超過流通池所能承受的壓力極限，否則可能損壞檢測器。紫外/可見光（UV/VIS ）檢測器的液相色譜圖中的噪音毛刺通常是氣泡進入并通過 流通池的征兆。有些檢測器對空氣的存在也非常敏感，但表現(xiàn)出的征兆與 UV/VIS不同，例如有報導(dǎo)說，當(dāng)使用熒光（FL）檢測器時，流動相中溶解氧的存在可能會使一些化合物失去 熒光性。此外，對于利用待測物質(zhì)在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)引起電流變化而進行檢測的 電化學(xué)（EC）檢測器，對流動相中的溶解氧的存在也非常靈敏。此外，氣泡的存在有時還 會導(dǎo)致保留時間不重現(xiàn)。 所以，必須注意消除流

20、動相中的空氣，并且還應(yīng)避免空氣由管路 （如PTFE管）滲透進 流動相中。如果適當(dāng)?shù)仃P(guān)注在使用之前脫去流動相中溶解進的空氣，上述這些問題均能避免，或把影響降至最低。常用的脫氣方法有如下幾種：利用氮氣在液體中溶解度比空氣低的特性，在 0.1MPa壓力下，以約60 mL/min 流速通入 流動相儲液容器中1015min ,可以很有效地從流動相中排除溶解的空氣， 能排除接近80% 的氧氣。采用一個高效分布式噴射流裝置， 一體積的氨氣可從流動相中將等體積的幾乎全部氣體排除。這意味著1L氨氣通過1L流動相就可完成排氣這個工作。這種脫氣方法雖然好，但我們國內(nèi)氨氣價格較高，很少有實驗室采用此方法。.二加熱回流

21、法。此法的脫氣效果較好。 在操作時要注意冷凝塔的冷卻效率，否則溶劑會丟失，混合流動相的比例會有變化。.抽真空脫氣法。此法可使用真空泵，降壓至0.050.07MPa即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會使混合溶劑組成發(fā)生變化，從而影響到實驗的重現(xiàn)性，因此多用于單溶劑體系的簡單分析。.超聲波脫氣法。將欲脫氣的流動相置于超聲波清洗器中，用超聲波震蕩1020min。此法的脫氣效果最差。.在線脫氣法?，F(xiàn)在商品的 HPLC儀器，均可配在線脫氣機。在線脫氣使用簡單，低故障，有效。建議購買儀器時一定要購買，有的公司是作為選購件，所以與儀器公司談配置時應(yīng)與公司確認。二、過濾任何顆粒物進入 HPLC系統(tǒng)后都會在柱

22、子入口端被篩板擋住，最后的結(jié)果是將柱子堵塞，表現(xiàn)出的特征是系統(tǒng)壓力增加并使色譜峰變形。因此，要采取各種預(yù)防措施，包括操作步驟和商品儀器自身的各種過濾設(shè)計，努力防止或減少顆粒物進入HPLC系統(tǒng)中，從而延長儀器和色譜柱的使用壽命，并提高數(shù)據(jù)的可靠性。在 HPLC系統(tǒng)中，顆粒物的主要 來源有三個途徑：流動相、被測樣品和儀器系統(tǒng)部件的磨損物。1、流動相如果流動相均由高效液相色譜級溶劑組成，流動相沒有必要過濾。這是因為高效液相色譜級的有機溶劑，例如乙睛、甲醇等，在制造的工藝過程中都已經(jīng)過了0.2科m微孔濾膜過濾。同樣的，無論你是買的HPLC級的水還是在實驗室使用超純水凈化系統(tǒng)制備的水，最后一步也是通過0

23、.2 m微孔濾膜。然而，如果有任何一種緩沖液中加入了固體物，例如磷酸 鹽，流動相過濾將是必要的一個步驟。雖然緩沖鹽可能是可溶解的、高純的，但它還是可能 含有顆粒物質(zhì)，例如在蓋試劑瓶的塑料內(nèi)蓋時，塑料瓶蓋子與瓶口邊緣擠壓就會產(chǎn)生塑料顆粒。在這種情況下，添加的一種固體物可能完全溶解了，但是少量雜質(zhì)顆粒存在于流動相中成為殘渣。流動相通過0.45 m微孔濾膜過濾對于從流動相中除去所有顆粒物是一個有效 方法。0.2 m微孔濾膜也可以用，但是它們就這個應(yīng)用而言并不比0.45 m微孔濾膜更有效，而且它的過濾速度會更慢，特別是當(dāng)實驗室使用的試劑和水的質(zhì)量不太好時。建議實驗室在編寫制定他們流動相制備標(biāo)準(zhǔn)操作程序

24、（SOPs）時規(guī)定，可以借鑒國際上同類實驗室的規(guī)定，即：流動相制備僅采用HPLC級液體時不需要過濾，反之所有流動相組成在使用前必須過濾。=在連接儲液瓶和泵的輸液管的末端入口采用下沉式過濾器（常見材質(zhì)有熔融一 玻璃砂芯濾板和微孔金屬的兩種）也是很重要的。這個過濾器的規(guī)格為10 dm的微孔物質(zhì)，所以它不能取代流動相過濾步驟，但是它能除去系統(tǒng)中的塵土并保證儲液瓶、輸液管使用的可靠性。2、被測樣品液相系統(tǒng)中的第二個顆粒物來源是被測樣品。一些實驗室在將他們的樣品放置在自動進樣器盤（或手動進樣）以前，所有樣品都先通過一個0.45 m針筒式過濾器過濾。這是一個有效除去被測樣品中顆粒物的方法。但是這個過程也有

25、一點需要關(guān)注：你使用了針筒式過濾器就不可能100%得到通過過濾器的被測樣品，總會有或多或少的丟失。 丟失來自這樣幾方面：過濾器濾膜的吸附、過濾器濾出的顆粒物上的吸附、針筒式濾膜過濾器與針筒連接處的滲漏等。如果有丟失，過濾后液體中被測物的含量或濃度與原基本樣液的含量或濃度還相同嗎？ 這個問題一般需要通過實驗確認。確認這步是要增加工作量和費用的。過濾器的使用是一種消耗，每個過濾器的價格從幾元到十幾元。但在做食品中殘留物分析時，由于基質(zhì)大多比較復(fù)雜，所以過濾這步已成為不可或缺的一步。在實際分析工作中，一般檢測每一組樣品 會帶一個外標(biāo)、一個添加回收或是質(zhì)控樣品，所以，只要最終檢測時得到的信噪比能滿足檢

26、出限要求，可將這步視為系統(tǒng)誤差而忽略。二3、儀器系統(tǒng)部件的磨損物 最后，在 HPLC系統(tǒng)中顆粒物的另一個主要來源是輸液泵密封墊和進樣閥旋轉(zhuǎn)軸的磨損。 關(guān)于輸液泵密封墊的磨損更換有兩種不同建議。第一種建議認為，在一般實驗室中輸液泵密封墊通常使用壽命為六個月到一年，因此建議半年或一年更換這些密封墊，實驗室應(yīng)基于上述觀點制定定期預(yù)防性維護計劃。該觀點認為：與輸液泵密封墊顆粒堵塞柱子而更換新柱子的費用相比，更換密封墊的費用低些。 一些輸液泵有玻璃砂芯或篩網(wǎng)，可在流路中濾掉從泵密封墊磨損下來的顆粒物，防止這些顆粒物隨流動相流至柱頭。若有這種裝置應(yīng)查閱輸液泵操作手冊，查看推薦的這種過濾器清洗或更換的間隔。

27、另一種建議則認為，原裝密封墊的密封效果最好，更換以后容易引起流動相滲漏。所以，只要不漏液就不要輕易更換密封墊。兩種說法都有其道理，具體如何操作，建議與儀器公司工程師溝通，各公司的儀器還是有些不同的。自動進樣器旋轉(zhuǎn)軸的密封隨著使用時間也會磨損，但是在我的經(jīng)驗中， 即便是高負荷的運轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)軸密封墊也可以使用幾年。如果你的自動進樣器系統(tǒng)有計數(shù)進樣閥轉(zhuǎn)動次數(shù)的功能，你可以設(shè)定一個警鈴當(dāng)預(yù)設(shè)閥轉(zhuǎn)動次數(shù)已達到時提醒你。曾有一種說法，進樣器最多轉(zhuǎn)動20,000次，這僅僅是進樣10000個；但這似乎不是實驗室涉及的常規(guī)樣品分析使用壽命，它們的實際使用壽命會更長。旋轉(zhuǎn)軸密封磨 損后會滲液，比較明顯的特征是同一樣品

28、多次進樣后，峰面積值差別比較大（ RSD5% ）。當(dāng)然，輸液泵的密封墊和旋轉(zhuǎn)軸的密封墊磨損將 增加更多研磨物在流動相中，加速對這些部件的損傷。 此外，如果你日常運行的流動相有緩沖鹽，如磷酸緩沖鹽，密封墊的磨損會更快。無論顆粒物源于何物，實驗時都要將其除去。推薦在HPLC系統(tǒng)中采用一個 0.45或0.5 m的在線多孔過濾器，接在自動進樣器和柱子 之間，即使已使用了保護柱。這個在線過濾器將成為擋板代替柱頭的濾板，而且如采用一個玻璃砂芯濾板，既便宜，更換又方便（幾分鐘就可更換）。若采用在線過濾， HPLC系統(tǒng)檢測每批樣品開始前記錄下壓力值，當(dāng)壓力上升一定值，例如 25%或增加500psi ,應(yīng)該更換

29、 玻璃砂芯濾板了，更換以后沖洗幾分鐘系統(tǒng)將恢復(fù)到原來的壓力值。三、沖洗使HPLC系統(tǒng)良好運行的第三個要點是保持系統(tǒng)的清潔。你需要關(guān)注流動相流經(jīng)該系統(tǒng)的 所有地方，對于這些地方經(jīng)常性的沖洗，將使你的系統(tǒng)保持在“ Ready”狀態(tài)。1、流動相儲液瓶首先要經(jīng)常清洗流動相儲液瓶，或者每做一批新樣品更換一次流動相。一個臟的儲液瓶將會污染注入的流動相。建議儲液瓶中緩沖液使用時間不要超過一周，而有機溶劑使用時間不要超過一個月。也有人建議儲液瓶中保持用溶劑充滿，直到更換分析方法儲液瓶需更換新溶劑（流動相組成發(fā)生變化）時，將舊溶劑倒掉更換新溶劑，這樣勝于將溶劑用完。但這對于分析樣品量少的實驗室而言似乎有些浪費。

30、儀器公司的工程師建議儲水瓶的水要天天換，每周瓶子還應(yīng)該用異丙醇清洗一次。有的實驗室則在水里加入0.11 mM的甲酸抑制微生物的生長。這些做法看起來有些繁瑣，但卻能起到“磨刀不誤砍柴工”作用。2、泵接下來要沖洗的是泵。千萬不要一分析完沖幾分鐘后就停泵，特別是當(dāng)流動相中含有難揮發(fā)的緩沖液（如磷酸鹽）時。如果儀器不是連續(xù)使用，當(dāng)流動相蒸發(fā)時，難揮發(fā)物就會粘在活 塞密封墊的表面，難揮發(fā)物將形成固形物沉淀。這是泵密封墊磨損和單向閥滲漏的主要原因 之一。所以，無論使用長短，在停泵以前一定要用非緩沖液流動相沖洗泵在半個小時以上， 要是流動相中有難揮發(fā)緩沖鹽則建議沖洗的時間應(yīng)該更長些。3、自動進樣器自動進樣器

31、也要按規(guī)定清洗。現(xiàn)在的儀器多配有自動進樣器的沖洗液瓶，通常只要注意及時更換、補充沖洗液即可。自動進樣器用的洗滌液也要采用與流動相相同的方式處理，并根據(jù)溶劑的有效期和規(guī)定，清洗儲液瓶或更換洗滌液。現(xiàn)在的自動進樣器設(shè)置、操作都很簡單， 如果時間允許（特別是利用夜間運行），每次分析完后設(shè)置進 1、2針純?nèi)軇ㄈ缂状肌⒁揖Γ?，也是一個好做法。4、色譜柱對柱子的污染是隨使用時間而增加。通常表現(xiàn)是：運行走基線時在記錄的色譜圖中基線噪音增加，泵壓也增加。解決這個問題的最有效方法就是在每一批樣品分析結(jié)束后或準(zhǔn)備卸下柱 子時用大量的流動相沖洗柱子（例如，甲醇、乙睛和水）。用梯度沖洗效果更好，具體的比例要根據(jù)柱子

32、的說明書和性質(zhì)而定。15J檢測器如果是正常使用，檢測器將依據(jù)其性質(zhì)并按照說明書規(guī)定進行洗。例如UV/VIS檢測器或FL檢測器，在對柱子和系統(tǒng)進行沖洗時也就一同對檢測器流通池中污染物進行了清洗。但 是蒸發(fā)光檢測器或質(zhì)譜儀則需要按照說明書進行定期清洗。這些檢測器在使用時會有難揮發(fā)污染物沉積，如質(zhì)譜儀離子源的噴針、毛細管、錐孔板、預(yù)四極等部件，因而需要定期清洗。 而且對聯(lián)有這些檢測器的系統(tǒng)沖洗時，最好與這些檢測器斷開，以減少對檢測器的污染?？傊?，實驗室日常使用的液相色譜儀要是能認真做好這三項工作一一脫氣、過濾和沖洗，你的儀器可以得到良好的預(yù)防性維護，使用時就會感到比較順手。當(dāng)然，在實際操作時遇到的問

33、題并沒有這么簡單，但這三個良好習(xí)慣將是正確操作、使用 HPLC系統(tǒng)的基礎(chǔ)。 感謝各位的關(guān)注，好的資料大家一起分享如果流動相均由高效液相色譜級溶劑組成，流動相沒有必要過濾。這是因為高效液相色譜級的有機溶劑，例如乙睛、甲醇等，在制造的工藝過程中都已經(jīng)過了0.2科m微孔濾膜過濾。同樣的，無論你是買的HPLC級的水還是在實驗室使用超純水凈化系統(tǒng)制備的水，最后一步也是通過0.2 m微孔濾膜。我感覺還是要過濾的，進口的甲醇，乙睛真的可以不要過濾了，國產(chǎn)的就得過濾啊，里面螞蟻都有哦。四液相色譜常見問題及處理方法HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法1、樣品量不足，解決辦法為增加樣品量2、樣品未從柱子中流出。

34、可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動相或柱子3、樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器4、檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可。5、檢測器時間常數(shù)太大。解決辦法為降低時間參數(shù)6、檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。7、檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。8、記錄儀測壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可。9、流動相流量不合適。調(diào)整流速即可。10、檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。為什么HPLC柱柱壓過高柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問 題，您可按下面步驟檢查問題的起因。1、拆去保護預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護柱的問

35、題，若柱壓仍高，再檢查；2、把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再 檢查；3、將柱子的進出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱子，（此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進入流動池）。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查；4、更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將 篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進樣器與保護柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，SGE提供的Rheodyne 7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？1、篩板堵塞或柱失效

36、，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。|2、存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子如何解決HPLC進行分析時保留時間發(fā)生漂移或急速變化漂移現(xiàn)象1、溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定2、流動相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等3、柱子未平衡好，需對柱子進行更長時間的平衡 快速變化現(xiàn)象1.流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定2、泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。3、流動相不合適，解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內(nèi)進行適當(dāng)混合 HPLC儀器問題1、我的HPLC泵壓明顯的偏高，請問可能的原因？ 一答：流速設(shè)定過

37、高；流動相或進樣中有機械雜質(zhì)，造成保護柱、柱前篩板或在線過濾器阻塞；流動相粘度過大；柱溫過低；緩沖鹽結(jié)晶；壓力傳感器故障。2、基線不穩(wěn)，上下波動或漂移的原因是什么，如何解決？答：a.流動相有溶解氣體；用超聲波脫氣15-30分鐘或用充氮氣脫氣一b.單向閥堵塞；取下單向閥，用超聲波在純水中超20分鐘左右，去處堵塞物c.泵密封損壞，造成壓力波動；更換泵密封 d.系統(tǒng)存在漏液點；確定漏液位置并維修 二| f.柱后產(chǎn)生氣泡；流通池出液口加負壓調(diào)整器 一g.檢測器沒有設(shè)定在最大吸收波長處；將波長調(diào)整至最大吸收波長處h.柱平衡慢，特別是流動相發(fā)生變化時；用中等強度的溶劑進行沖洗，更改流動相時， 在分析前用1

38、0-20倍體積的新流動相對柱子進行沖洗。3、接頭處為何經(jīng)常漏液，如何處理？答：接頭沒有擰緊；擰松后再緊，手緊接頭以手勁為限，不要使用工具，不銹鋼接頭先用手 擰緊，再用專用扳手緊 1/4-1/2圈，注意接頭中的管路一定要通到底，否則會留下死體積。 接頭被污染或磨損；建議更換接頭。接頭不匹配，建議使用同一品牌的配件。4、進樣閥漏液是如何造成的？答：a.轉(zhuǎn)子密封損壞；更換轉(zhuǎn)子密封b.定量環(huán)阻塞；清洗或更換定量環(huán)c.進樣口密封松動；調(diào)整松緊度d.進樣針頭尺寸不合適，一般是過短；使用恰當(dāng)?shù)倪M樣針（注意針頭形狀） e.廢液管中產(chǎn)生虹吸；清空廢液管譜圖問題1、問：造成峰拖尾的原因是什么，如何消除？ 答：a.

39、篩板阻塞；反沖色譜柱、更換進口篩板 b.色譜柱塌陷；填充色譜柱c.有干擾物質(zhì)的存在；使用更長的色譜柱、改變流動相或更換色譜柱二e.流動相PH值不合適；調(diào)整 PH值，對于堿性化合物，低 PH值更有利于得到對稱峰 f.樣品與填料表面的溶化點發(fā)生反應(yīng)；加入離子對試劑或堿性揮發(fā)性修飾劑或更改色譜柱2、問：造成峰分叉的原因是什么，如何消除？答：保護柱或分析柱污染； 取下保護柱再進行分析。 如果必要更換保護柱。 如果分析柱阻塞， 拆下來清洗。如果問題仍然存在，可能是柱子被強保留物質(zhì)污染，運用適當(dāng)?shù)脑偕胧?。如果問題仍然存在，入口可能被阻塞，更換篩板或更換色譜柱。 樣品溶劑不溶于流動相； 改變樣品溶劑，如果

40、可能采取流動相作為樣品溶劑。3、問：K值增加時，拖尾更嚴(yán)重，這是為什么？ 答：反相模式，二級保留效應(yīng)；a.加入三乙胺（或堿性樣品）b.加入乙酸（或酸性樣品）c.加入鹽或緩沖劑（或離子化樣品）d.更換一支柱子4、問：保留時間的波動有幾種可能的原因？答：溫控不當(dāng)；調(diào)節(jié)好柱溫。流動相組分變化；防止流動相蒸發(fā)、反應(yīng)等，做梯度時尤其要 注意流動相混合的均勻。色譜柱沒有平衡；在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱。 液相色譜常用符號與術(shù)語表ACN 乙睛 AcetonitrileAUFS 滿量程的吸光度單位 Absorbance units, full scaleAs峰不對稱因子B二元流動相中的強溶劑；例

41、如：反相HPLC的甲醇/水混合液中的甲醇BSA牛血清白蛋白（一種蛋白質(zhì)）Bovine serum albuminCAF咖啡因（中性溶質(zhì)）CaffeineCRF色譜響應(yīng)因子 Chromatographic response function ;色譜圖總分離度的定量指標(biāo)dc色譜柱內(nèi)徑（cm）DMOA 二甲基辛胺 DimethyloctylamineDNB 2,4-二硝基甲酰（基）2, 4-Dinitrobenzoyldp色譜柱填料的粒度（cm）DRYLAB液相資源公司（LC Resources INC.）的計算機模擬軟件。DRYLAB I用于等度預(yù)測,DRYLAB G用于梯度預(yù)測F流動相的流速（m

42、l/min ）FC-113 1 , 1, 2-三氟-1, 2, 2-三氯乙烷GPC 凝膠滲透色譜法Gel-permeation chromatographyHA酸性溶質(zhì)，能電離出 A-Hex 己烷 HexaneHr二相鄰譜帶之間的谷高HVA 高香草酸 Homovanillic acidh 峰高h1,h2相鄰譜峰1和譜峰2的峰高IEC 離子交換色譜法 Ion-exchange chromatographyIP 離子對 Ion-pairIPC 離子對色譜法 Ion-pair chromatographyJ色譜峰強度參數(shù)二K所給譜峰的容量因子，k =（tR-t0）/t0=tR /t0 , tR=t0

43、（1+k ）k梯度洗脫過程中，某溶質(zhì)的k的平均值或有效值kw以水做流動相k的外推值k1,k2相鄰譜峰1和譜峰2的容量因子L色譜柱長度（cm）Lc檢測器流動池光路的長度（cm）M溶質(zhì)的分子量MC 二氯甲烷 Methylene chlorideMDST混合設(shè)計統(tǒng)計技術(shù)Mixture-design statistical technique ; 一種優(yōu)化流動相的軟件MeOH 甲醇 MethanolMTBE 甲基叔丁醛 Methyl-t-butyl etherMW溶質(zhì)的分子量N色譜柱塔板數(shù)NAPA N-乙酰普魯卡因胺N-Acetylprocainamide（堿性溶質(zhì)）N0檢測器的基線噪音ODS十八烷基

44、硅烷 OctadecylsilylP色譜柱的壓力降通常以巴（bar）表示，也用psi;另外，也用作柱極性參數(shù)PA普魯卡因胺 Procainamide （堿性物質(zhì)）PAH 聚芳香煌 Polyaromatic HydrocarbonPESOS優(yōu)化流動相的計算機軟件（美國 Perkin-Elmer產(chǎn)品）pKa溶質(zhì)酸性常數(shù)的負對數(shù)；當(dāng) pH=pKa時，溶質(zhì)中有一半是電離的Rk保留值范圍，Rk=（最末譜峰k ） / （最初譜峰k）RRM相對分離度圖（通常 N=10000 ）Rs相鄰二譜峰的分離度S當(dāng)流動相中的B改變時，測量溶質(zhì)保留值的變化速率的參數(shù)SAL 水楊酸 Salicylic AcidSEC 尺寸

45、排阻色譜法 Size-exclusion chromatographyS/N 信噪比 Signal to noise ratiot分離時間（min）（樣品進樣時t=0 ）tp梯度系統(tǒng)的滯后時間（min ）TBA 四丁基俊離子 Tetrabutylammonium ionTEA 三乙胺 TriethylamineTHF 四氫吠喃 Tetrahydrofurantk在用于校正等度洗脫溶劑強度的流動相離開梯度混合器時，梯度洗脫的時間TLC 薄層色譜法 Thin-layer chromatographyTMA 四甲基俊 Tetramethylammonium （鹽）TMS 三甲基硅烷 Trimethy

46、lsilyltO色譜柱的死時間（min）tR溶質(zhì)的保留時間（min）tG梯度時間（min）,即梯度開始至結(jié)束的時間t1,t2相鄰譜峰1和譜峰2的保留時間（min）ti色譜圖中第一峰的保留時間（ min）tf色譜圖中最末峰的保留時間（min） tg tf-titx （tf-ti）/2UV紫外光Vm色譜柱的死體積（mL）, Vm=t0FVMA 香草扁桃酸 Vanillymandelic acidwm化合物的進樣量w1,w2相鄰譜峰1和譜峰2于半峰高處（W1/2）的寬度（min）W1,W2相鄰譜峰1和譜峰2的基線寬度（min）W1/2半峰高處的譜帶寬度xd,xe,xn溶劑選擇參數(shù)，分別用于測定溶劑的

47、酸度、堿度和偶極性的程度?分離因子，？=k2/k1 ?梯度洗脫期間流動相成分的變化?o溶劑強度參數(shù)?化合物的克分子吸收系數(shù)?流動相的粘度（Pa?s） ?流動相中強溶劑的體積份數(shù) %B二元流動相中強溶劑的體積百分比（v） 液相色譜法簡介氣相色譜不能由色譜圖直接給出未知物的定性結(jié)果，而必須由已知標(biāo)準(zhǔn)作對照定性。當(dāng)無純物質(zhì)對照時，定性鑒定就很困難，這時需借助質(zhì)譜、紅外和化學(xué)法等配合。另外大多數(shù)金屬鹽類和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)還不能分析。此缺點可高效液相色譜法來克服。在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論與技術(shù)，在70年代初建立了高效液相色譜分析法（以HPLC表示）。在常壓下操作的液相色譜，分離一個樣

48、品往往長達幾小時至幾十小時，因此工作效 率很低。人們曾對這種經(jīng)典液相色譜法試用了柱前加壓或柱后減壓的辦法來提高流速，以縮短分離時間，但是結(jié)果失敗了。根據(jù)液相色譜理論，因為隨著載液（流動相）流速的提高， 板高則增大，所以柱效會顯著降低。隨著生產(chǎn)技術(shù)的提高，人們制成了細?。?0?m ）而高效的填充物，從而使柱效大大提高。但是隨著填充物粒度的減小，柱壓降顯著增大，為了得到合理的載液流速，使用了高壓；輸液泵，使流速達到170mL/min 。從而使分析一個多組分樣品只需幾分鐘到幾十分鐘時間。隨著高效固定相、高壓泵和高靈敏度檢測器以及電子技術(shù)和計算機技術(shù)的應(yīng)用，70年代以業(yè)逐步實現(xiàn)了液相色譜分析的高效、高

49、速、高靈敏和自動化操作。因此人們常稱它為高效液相色譜或現(xiàn)代液相色譜，以區(qū)別于經(jīng)典液相色譜。高效液相色譜法的分類與經(jīng)典液相色譜法一致。按固定相的聚集狀態(tài)不同分為液固色譜法和液液色譜法。按分離原理不同分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜法四類。 高效液相色譜所用基本概念：保留值等色譜分析有關(guān)術(shù)語，以及分配系數(shù)、分配比、塔板高度、分離度、選擇性等方面均 與氣相色譜相一致；高效液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率理論也與氣相色譜一致。 因液相色譜以液體代替氣相色譜中的氣體作流動相，則速率議程H=A+B/?+C?。式中：縱向擴散項（分子擴散項）B/?對板高的影響與氣相色譜不同，由于液相色譜中組

50、分分子在流 動相中的擴散系數(shù) Dm僅為氣相色譜中的萬分之一，因此縱向擴散項對板高的影響可以忽略 不計。于是影響液相色譜白主要因素是傳質(zhì)項Quo由圖14可知，氣相色譜（GC）的流動相流速u增大時，板高H顯著增大（即柱效顯著降低），而液相色譜（LC）的流速增大時， 板高增大不顯著（即柱效降低不顯著）。這說明高效液相色譜也有很高的分離效能，此外，氣相色譜的載氣權(quán)數(shù)種，其性質(zhì)差別也不大，對分離效果影響也不大。而液相色譜的載液種 類多，性質(zhì)差別也大，對分離效果影響顯著。因此流動相的選擇很重要，并且在選擇流動相對應(yīng)注意以下幾點：流動相對樣品有適當(dāng)?shù)娜芙舛?，但不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，也不與固定液互溶；流動相的

51、純度要高（至少分析純）、粘度要小，以免帶進雜質(zhì)和組分在流動相中擴散系數(shù)下降；流動相應(yīng)與所用檢測器相匹配，不應(yīng)對組分檢測產(chǎn)生干擾作用。高效液相色譜不但具有高效、高速、高靈敏度的特點，還由于它的流動相（載液）種類比氣相色譜的流動 相（載氣）多，因此可選用兩種或多種不同比例的液體作流動相，從機時可提高選擇性。此 外，液相色譜的微分比氣相色譜易于收集。便于為紅外、核磁等方法確定化合物結(jié)構(gòu)提供純樣品。由于高效液相色譜法具有以上特點，它適于分離、分析沸點高、熱穩(wěn)定性差、分子量 大（大于400）的氣相色譜法不能或不易分析的許多有機物和一些無機物，而這些物質(zhì)占化 合物總數(shù)的7580%。因此它已廣泛用于核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、糖類、脂類、 管類化合物、激素、生物堿、稠環(huán)芳燒、高聚物、金屬螯合物、金屬有機化合物以及多種無 機