果膠酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)序號(hào)實(shí)驗(yàn)三I實(shí)驗(yàn)名稱I特定產(chǎn)物工業(yè)生產(chǎn)菌種發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)間2010年13日-23日 實(shí)驗(yàn)室 基礎(chǔ)生物2 （121）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握菌種選育、菌種發(fā)酵條件的優(yōu)化和微生物酶制劑酶活測(cè)定的基本方法；2、了解酶學(xué)性質(zhì)的研究.3、了解影響果膠酶對(duì)果汁澄清效果的各種因素二、實(shí)驗(yàn)與原理1、果膠酶概況（1）、果膠質(zhì)：是高等植物細(xì)胞壁內(nèi)及細(xì)胞壁間的結(jié)構(gòu)性多糖，是一類高分子碳 水化合物，它的存在往往給果蔬加工等工藝帶來許多麻煩和損失。（2）、果膠酶：是指能分解果膠質(zhì)的多種酶的總稱，廣泛存在于高等植物和微生 物中。（3）、產(chǎn)生果膠酶的微生物：細(xì)菌、放線菌、酵母和霉菌，但目前商品果膠酶多 數(shù)來自霉菌。

2、（4）、果膠酶的應(yīng)用：主要是用于果膠的分解，在水果加工、葡萄酒生產(chǎn)、麻類 脫膠和飼料等方面有著廣泛的應(yīng)用。2、果膠酶的酶活測(cè)定方法（1）、粘度降低法：利用粘度計(jì)測(cè)量在一定溫度、酶濃度和一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，標(biāo) 準(zhǔn)果膠溶液的粘度降低值。（2）、脫膠作用時(shí)間法：以脫膠作用的時(shí)間來測(cè)定果膠酶的酶活力。（3）、次亞碘酸法：用滴定法定量測(cè)定半乳糖醛酸的生成量，以表示果膠酶的活 力。（4）、還原糖法（DNS法）：根據(jù)果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸，后者是一種 還原糖，與3, 5 -二硝基水楊酸共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定 的范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色呈比例關(guān)系，可利用比色法在540nm進(jìn)行 測(cè)定

3、。3、微生物發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)品受以下條件制約：（1）、培養(yǎng)基成分：C源、N源、無機(jī)鹽、水和生長(zhǎng)因子（2）、培養(yǎng)條件：溫度、pH、溶解氧等（3）、附加條件：誘導(dǎo)物、表面活性劑等4、酶催化反應(yīng)的進(jìn)行受多種因素的影響：底物濃度、酶濃度、溫度、pH、激活 劑、抑制劑三、設(shè)備與材料（一）、培養(yǎng)基1、菌種篩選使用培養(yǎng)基（1）、基本培養(yǎng)基：果膠1%、磷酸氫二鈉0.5%、蛋白胨1%、pH4.5、瓊脂2.0%。（2）、分離培養(yǎng)基：果膠0.5%、磷酸氫二鈉0.5%、瓊脂2.0%、H4.5。（3）、發(fā)酵培養(yǎng)基果膠1%、磷酸氫二鈉0.5%、蛋白胨1%、pH4.5。2、黑曲霉Asp-2固體發(fā)酵培養(yǎng)基菌種斜面培養(yǎng)基（查氏培養(yǎng)基

4、）：NaNO3 0.2%、K2HPO4 0.1%、KC10.05%、MgSO40.05%、FeSO4 0.001%、蔗糖 3%、瓊脂 2.5%、自然 pH。3、種子培養(yǎng)基：麩皮 3.0%、橘子粉 2.0%、硫酸銨 0.5%、葡萄糖 1%、KH2PO4 0.1%、pH4.5。4、固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮 10g、橘子粉 2.5g、（NH4）SO4 0.1g（0.8% 干料計(jì)）、葡萄糖 0.125g（1%十料計(jì)）、水15ml。（二）、試劑1、酶活測(cè)定使用試劑（1）、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液：稱取檸檬酸15.652g，檸檬酸鈉7.5g，溶解定 容至 1000ml，用 0.1M NaOH 或 0.1M HC

5、l 調(diào)節(jié) pH 至 3.0。（2）、底物0.25%果膠溶液：稱取0.25g果膠，用上述緩沖液溶解，在電爐 上加熱至完全溶解，用緩沖液定容至100mL，儲(chǔ)存于4C，7天內(nèi)有效。（3）、DNS試劑：稱取酒石酸鉀鈉182.0g、溶解于500 mL水中，加熱（不超過 50C),于熱溶液中依次加入3-5二硝基水楊酸6.3g,氫氧化鈉21.0g,苯酚5.0g, 無水硫酸鈉5.0g，攪拌均勻至溶解，冷卻后定容至1000 mL,儲(chǔ)存于棕色瓶中， 室溫保存，710天后過濾使用。、儀器、燒杯、三角瓶、試管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、試劑瓶、研缽等、天平、滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、電爐、恒溫水浴鍋、記時(shí)器(精

6、確 到秒)、分光光度計(jì)等。四、實(shí)驗(yàn)方法步驟(一)、果膠酶產(chǎn)生菌的分離稀釋涂布平板法1、菌種的采集要獲得產(chǎn)生果膠酶的菌種，可從富含果膠酶作用底物的場(chǎng)所去采集。胞外酶的穩(wěn) 定性和最適反應(yīng)條件通常和菌的最適生長(zhǎng)條件一致，因此要篩果膠酶時(shí)，只要到 相應(yīng)的環(huán)境中采樣即可。(果樹下面的土壤里)2、倒平板配制分離培養(yǎng)基 高壓滅菌30min冷卻至約50 C 倒56塊平板/100mL 冷 卻備用3、制備土壤稀釋液稱取土樣10g,放入90mL無菌水中(帶玻璃珠)，搖動(dòng)10min,靜置10min, 制備得到10-1 土壤稀釋液；用無菌吸管吸出1mL 土壤懸液，加入盛有9mL無菌水的大試管中，充分混 勻，制備得到10

7、-2 土壤稀釋液；再從中吸出1mL加入盛有9mL無菌水的大試管中，混勻后得到10-3 土壤稀 釋液；以此類推，分別制備得到10-4、10-5、10-6、10-7 土壤稀釋液。4、涂布用無菌吸管分別吸取10-3、10-4、10-5、10-6和10-7 土壤稀釋液各0.1mL, 對(duì)號(hào)放入已經(jīng)寫好記號(hào)的平板中央，用無菌玻璃涂棒涂勻。5、富集培養(yǎng)采集到的樣品中如果所需的菌很少，需要先經(jīng)過富集培養(yǎng)，使所需的菌大量繁殖，而不需要的菌則不生長(zhǎng)或少生長(zhǎng)，以利于篩選。培養(yǎng)時(shí)控制培養(yǎng)的溫度、pH和營(yíng)養(yǎng)成分等。6、菌種的分離培養(yǎng)基里含有果膠，能利用該底物生長(zhǎng)的菌種就是所需要的產(chǎn)果膠酶菌種。7、純化挑取其中透明圈較大

8、的單菌落，劃線于平板，37倒置培養(yǎng)23d；如發(fā)現(xiàn)雜菌需再一次進(jìn)行純化直到獲得純培養(yǎng)。（二）、果膠酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵1、配置發(fā)酵培養(yǎng)基40mL/瓶。2、分別挑取細(xì)菌和霉菌菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。3、37C、200r/min 搖瓶發(fā)酵約 72h。（三）、果膠酶的活性測(cè)定（1）、待測(cè)酶液的制備將發(fā)酵液離心，取上清液用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋10倍（2）、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線半乳糖醛酸溶液（ml）0.00.20.40.60.81.01.2半乳糖醛酸（mg）0.00.20.40.60.81.01.2緩沖液（ml）2.01.81.61.41.21.00.8DNS (ml)3333333定容總體積（ml）202020

9、20202020OD (540nm)（3）、酶活的測(cè)定操作步驟空白管樣品管A樣品管B步驟1吸取1.8mL果膠底物溶液吸取1.8mL果膠底物溶液吸取1.8mL果膠底物溶液步驟237C保溫5分鐘37C保溫5分鐘37C保溫5分鐘步驟3加入待測(cè)酶液0.2ml加入待測(cè)酶液0.2ml步驟437C精確保溫30min37C精確保溫30min37C精確保溫30min步驟5加入3mLDNS試劑終加入3mLDNS試劑終加入3mLDNS試劑終止反應(yīng)止反應(yīng)止反應(yīng)步驟6混合均勻混合均勻混合均勻步驟7加入0.2ml待測(cè)酶液，沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min步驟8流水冷卻流水冷卻流水冷卻步驟9加蒸餾水1

10、5mL混勻加蒸餾水15mL混勻加蒸餾水15mL混勻步驟10OD540nm 比色OD540nm 比色OD540nm 比色二、實(shí)驗(yàn)報(bào)告（一）、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及現(xiàn)象1、標(biāo)準(zhǔn)曲線半乳糖醛酸（mg）0.00.20.40.60.81.01.2OD 值（540nm）0.0000.0850.2410.4050.5500.7030.850半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線2、酶活測(cè)定值菌種類型細(xì)菌霉菌OD 值（540nm）0.0830.0870.0070.0070.0830.1030.0020.002平均OD值0.0890.0045酶活計(jì)算（細(xì)菌）（1.3623*OD+0.0484）*N*1000酶活E=6.159umol/ml0.

11、2*194.14*10（二）、實(shí)驗(yàn)總結(jié)和分析1、注意事項(xiàng)（1）、接種時(shí)的注意事項(xiàng)接種方式是液體一固體，用滅菌的移液管或10ml量筒接種或大槍頭；接種后振 蕩接種瓶，使菌種充分與固體培養(yǎng)基混合。（2）、酶活測(cè)定注意事項(xiàng)試管上編號(hào)：貼上用圓珠筆寫上編號(hào)的膠布，以防止保溫或沸水加熱時(shí)脫落； 移液槍的使用：向試管內(nèi)加入待測(cè)酶液或DNS時(shí)，槍頭不要觸碰管壁，也不要 伸入液面下，連續(xù)吸取同一種溶液時(shí)可以不用更換槍頭；精確記時(shí)：每一管加入酶液的時(shí)間要做記錄，每管之間間隔的時(shí)間要合理；避免試管進(jìn)水：煮沸和用流水沖洗時(shí)；（3）、UV2000型分光光度計(jì)的使用注意事項(xiàng)提前半小時(shí)接通電源，打開機(jī)器開關(guān)使儀器通電，自

12、檢；將對(duì)照液及測(cè)定液分別裝入比色杯3/4體積并用鏡頭紙擦干外壁，放入樣品室； 調(diào)節(jié)測(cè)定所用波長(zhǎng)；讀數(shù)完畢，打開儀器蓋板，關(guān)閉開關(guān)，將比色杯沖洗干凈、浸泡于30%酒精中。2、實(shí)驗(yàn)總結(jié)實(shí)驗(yàn)菌種的采集不成功，沒有到要求的地方采集，也可能是溫度較低不適宜 菌體生長(zhǎng)；菌種分離純化時(shí)可能是無菌操作不嚴(yán)格，導(dǎo)致平板上面雜菌滋生，沒 有分離出目的菌種，各方面的操作都有不嚴(yán)謹(jǐn)之處，最后得到的酶活性較低，實(shí) 驗(yàn)做的不是很成功。3、參考文獻(xiàn)【1】、陳守文主編.酶工程.北京：科學(xué)出版社，2008【2】、沈萍.范秀容.李廣武 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)2000【3】、于龍江主編.發(fā)酵工程原理與技術(shù)應(yīng)用.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.6【4】、田國(guó)政酒曲根霉糖化性質(zhì)的研究期刊論文-湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)（自然 科學(xué)版）2003（02）【5】、劉建軍.姜魯燕