甾體激素類藥物的分析課件2

1、第十三章 生物制品分析概論 第1頁，共102頁。第一節(jié) 概 述藥物的三大類:第2頁，共102頁。一、生化藥物與基因工程藥物的定義生化藥物: 一般系指以下三種途徑獲得的藥物：其一，從 動物、植物及微生物分離純化；其二、生物 化學(xué)半合成；其三，現(xiàn)代生物技術(shù)制取。該類 藥物主要包括：生命基本物質(zhì)及其衍生物、降 解物、大分子結(jié)構(gòu)修飾物等。例： 氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶、輔酶、多糖、核苷酸和脂等。第3頁，共102頁。續(xù)定義基因工程藥物: 在確定了對某種疾病具有預(yù)防和治療作用 的蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上,分離、純化或人工合 成控制該蛋白質(zhì)合成的基因，并利用重組 DNA技術(shù)進(jìn)行改造，最后將該基因?qū)肟?以大量生產(chǎn)的受

2、體細(xì)胞中進(jìn)行繁殖或表達(dá) ，從而大規(guī)模生產(chǎn)出具有預(yù)防和治療疾病 作用的藥用蛋白質(zhì)。第4頁，共102頁。二、生化藥物與基因工程藥物的種類（一）生化藥物的種類第5頁，共102頁。種類（續(xù)）氨基酸及其衍生物類藥物1、單氨基酸例如：亮氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、色氨酸、丙氨酸、賴氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、天門冬氨酸、精氨酸、蘇氨酸等等。2、氨基酸衍生物例如：N-乙酰上-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸乙酯鹽酸鹽、S氨基甲酰半胱氨酸、S-甲基半胱氨酸等等。3、復(fù)合氨基酸注射液例如：3S、6S、9S、11S、13S、14S、15S、17S、18S復(fù)合氨基酸注射液。S代表氨基酸的種類。 第6頁，

3、共102頁。種類（續(xù)）藥用活性多肽1、垂體多肽：例如： 促胃液素(5肽)、催產(chǎn)素(9肽)等。2、消化道多肽：例如：胃泌素(14肽，17肽和34肽三種)3、下丘腦多肽：例：促甲狀腺素釋放激素(3肽) 。4、腦多肽：例：新啡肽(25肽)，-內(nèi)啡肽(3l肽)等。5、激肽類：例：血管緊張肽I(10肽)、(8肽)、(7肽 )等活性肽。6、其它肽類：例：谷胱甘肽(3肽)、1胸腺素(28肽) 。 第7頁，共102頁。種類（續(xù)）藥物蛋白質(zhì)1、蛋白激素類藥物：例如：胰島素、生長激素 、催產(chǎn)素。2、天然蛋白質(zhì)類藥物：例如：血清白蛋白、干 擾素。3、蛋白質(zhì)類藥物制劑：例如：明膠海綿、氧化 聚明膠。 第8頁，共102

4、頁。種類（續(xù)）酶與輔酶類藥物1、助消化酶類：例：胃蛋白酶、胰酶、胰脂肪酶。2、蛋白水解酶類：例：溶菌酶、胰DNA酶、膠原蛋白酶。3、凝血酶及抗栓酶：例：牛凝血酶、纖溶酶、尿激酶。4、抗腫瘤酶：例：L-天門冬酰胺酶、組氨酸酶、精氨酸 酶。5、其它酶類：例：超氧化物歧化酶(SOD)、RNA酶、DNA酶 、青霉素酶。6、輔酶類藥物：輔酶對酶的催化反應(yīng)起著促進(jìn)作用。 例：輔酶、輔酶、輔酶A、輔酶Q10、黃素單核苷酸。第9頁，共102頁。種類（續(xù)）多糖類藥物該類藥物來源廣泛，以黏多糖為主，其特點為：（1）、由糖苷鍵將單糖連接而成多糖。（2）、因單糖結(jié)構(gòu)糖苷鍵位置不同，使多糖種類繁多， 藥理功能各異。如抗

5、凝、降血脂、抗病毒、抗腫 瘤、增強(qiáng)免疫功能和抗衰老等多方面的生理活性。例如：肝素、硫酸軟骨素A和C、刺參多糖、銀耳多糖、 人胎盤脂多糖、殼聚多糖。第10頁，共102頁。種類（續(xù)）脂質(zhì)類藥物1、磷脂：如腦磷脂、卵磷脂。2、降血脂：如天然亞油酸、亞麻酸、多價不飽和脂肪酸 （PUFA）、前列腺素PGE1、PGE2、PGF2a、 PGI2。3、膽酸：如去氧膽酸、鵝脫氧膽酸、豬脫氧膽酸。4、固醇：如膽固醇、麥角固醇、-谷固醇。5、卟啉：如血紅素、膽紅素、原卟啉。 第11頁，共102頁。種類（續(xù)）核酸及其降解物和衍生物類藥物1、核酸：例如，從小牛胸腺或魚精中提取的DNA可用于 治療精神遲緩、虛弱和抗輻射。

6、2、多聚核苷酸：例如，多聚胞苷酸、聚肌苷酸等是干擾素 的誘導(dǎo)劑，用于抗病毒、抗腫瘤。3、核苷、核苷酸及其衍生物：例，ATP、cAMP、CDP-膽 堿、AMP、肌苷等。也可將它們進(jìn)行化學(xué)修飾 后用于治療腫瘤和病毒感染。治療腫瘤的如6-巰 基嘌呤、2-脫氧核苷?？共《镜娜?，環(huán)胞苷、 5-碘苷。 第12頁，共102頁。（二）、基因工程類藥物的種類第13頁，共102頁。三、生化藥物與基因工程藥物的特點1、共同特點： 均來自生物體,是生物體的基本生化成分,具有生物活性或生理功能,對疾病具有針對性強(qiáng)、毒副作用小、易于人體吸收。2、分子量大且不是定值 小部分藥物（如：氨基酸、輔酶）屬化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的小分子化合

7、物，大部分為大分子的物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、多糖類等)，其分子量一般幾千至幾十萬。對大分子的生化藥物而言，即使組分相同，往往由于分子量不同而產(chǎn)生不同的生理活性。所以，生化藥物常需進(jìn)行分子量的測定。 第14頁，共102頁。特點（續(xù)）3結(jié)構(gòu)確證難 由于有效結(jié)構(gòu)或分子量不確定，其結(jié)構(gòu)的確證很難沿用元素分析、紅外、紫外、核磁、質(zhì)譜等方法加以證實，往往還要用生化法如氨基酸序列等法加以證實。 4、全過程質(zhì)量控制 該類藥物對熱、酸、堿、重金屬等均較敏感，往往需要對原料藥、生產(chǎn)過程和產(chǎn)品進(jìn)行全過程質(zhì)量控制，且要求比其它藥物更為嚴(yán)格。5需檢查生物活性 在制備多肽或蛋白質(zhì)類藥物時，有時因工藝條件的變化，導(dǎo)致蛋

8、白質(zhì)失活。因此，對這些生化藥物，除了用通常采用的理化法檢驗外。尚需用生物檢定法進(jìn)行檢定，以證實其生物活性。 第15頁，共102頁。特點（續(xù)）6需做安全性檢查由于生化藥物的性質(zhì)特殊。生產(chǎn)工藝復(fù)雜，易引入特殊雜質(zhì)。故生化藥物常需做安全性檢查，如熱原檢查、過敏試驗、異常毒性試驗等。 7需做效價測定 該類藥物多數(shù)可通過含量測定，以表明其主藥的含量。但對酶類藥物需進(jìn)行效價測定或酶活力測定，以表明其有效成分含量的高低。 第16頁，共102頁。第二節(jié) 質(zhì)量檢驗的基本程序與方法 一、鑒別試驗 真?zhèn)舞b別方法 化學(xué)藥物:化學(xué)方法、物理學(xué)方法生化藥物與基因工程藥物:化學(xué)方法、物理學(xué)方法、生 物學(xué)方法。且需要標(biāo)準(zhǔn)品或

9、 對照品進(jìn)行對照實驗。 第17頁，共102頁。（一）、理化鑒別 1、化學(xué)鑒別法 利用藥物與某試劑在一定條件下反應(yīng)，生成有顏色的產(chǎn)物或沉淀進(jìn)行鑒別。 例如，溶菌酶的鑒別采用呈色法：溶茵酶分子中的四個肽鍵上的氮原子能與銅離子(Cu2+)絡(luò)合，生成有顏色的絡(luò)合物，肽鍵越多，產(chǎn)生的顏色越深。第18頁，共102頁。理化鑒別(續(xù)) 2、紫外分光光度法 由于很多生物大分子均有共軛系統(tǒng),可產(chǎn)生特征可見紫外吸收，使較多藥物能夠用紫外分光光度法的特征吸收進(jìn)行鑒別。 例如， 0.0lmol/L的三磷酸腺苷二鈉的鹽酸水溶液在257nm的波長處有最大吸收。用A250nm/A260nm的值0.17-0.27進(jìn)行鑒別。 第

10、19頁，共102頁。理化鑒別(續(xù)) 3、高效液相色譜法 利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時間和肽圖譜的一致性進(jìn)行鑒別。 例如， 重組人生長激素的鑒別： 1）供試品與對照品的主峰保留時間一致。 2）供試品與對照品的肽圖譜保持一致性。 第20頁，共102頁。（二）、生化鑒別 1、酶法 由于酶催化化學(xué)反應(yīng)的高度專一性，利用特定的酶僅能催化特定的化學(xué)反應(yīng)，可以有效地鑒別該藥物。 例如，尿激酶是專屬性較強(qiáng)的蛋白水解酶，根據(jù)尿激 酶能激活牛纖維蛋白溶酶原而具有相同作用的 鏈激酶不能激活牛纖維蛋白溶酶原而加以區(qū)別， 并用直接觀察溶解纖維蛋白作用的氣泡上升法作 為判斷指標(biāo)。 第21頁，共102頁。生化鑒

11、別(續(xù)) 2、電泳法 基于生物大分子分子量的較大差異和荷電的差異，在電泳法中具有不同的遷移距離，從而鑒別生化藥物。例如，肝素的鑒別采用糖凝膠電泳法：肝素是由D-硫 酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子間組成的酸性粘 多糖，其水溶液帶強(qiáng)負(fù)電荷，于瓊脂凝膠板上， 在電場作用下，向正極方向移動，與肝素國家標(biāo) 準(zhǔn)品對照，其移動位置應(yīng)對應(yīng)。第22頁，共102頁。生化鑒別(續(xù)) 3、樣品脫鹽后用等電點聚焦法測定 基因工程藥物往往有多個等電點，利用等電點聚焦從而形成多個區(qū)帶，基于該區(qū)帶的一致性鑒別藥物。 （三）生物鑒別法 利用生物體進(jìn)行試驗來鑒別藥物。 例如，用家兔驚厥試驗來鑒別胰島素，它是通過胰島素的降血糖作用進(jìn)

12、行鑒別的。當(dāng)劑量過大，血糖降低至一定水平(約30)，家兔即發(fā)生驚厥，迅速靜注50葡萄糖注射液，補(bǔ)充血糖、驚厥停止，說明驚厥是胰島素所致低血糖而引起的。 第23頁，共102頁。 生物藥物鑒別應(yīng)該注意以下三點： （1）藥物的取樣：由于生物藥物多數(shù)為大分子藥物，有的化學(xué)結(jié)構(gòu)不明確，有的分子量不是定值，使質(zhì)量控制較為困難。在大量的樣品中取少量供試品進(jìn)行分析，應(yīng)考慮取樣的科學(xué)性、真實性和代表性，其基本原則是均勻、合理。 （2）鑒別結(jié)果評價：由于生化藥物的復(fù)雜性和不確定性，通常鑒別不是由一項試驗完成，而是采用一組試驗項目綜合評價一種藥物。 （3）目前仍存在相當(dāng)一部分生化藥物沒有找到有效的鑒別方法。 第24

13、頁，共102頁。二、雜質(zhì)檢查 1、一般雜質(zhì)檢查 生化藥物的一般雜質(zhì)檢查項目包括氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度或溶液的顏色、水分及干燥失重、熾灼殘渣等。其檢查的原理及方法與化學(xué)藥物中的一般雜質(zhì)檢查相同。 第25頁，共102頁。雜質(zhì)檢查（續(xù)） 2特殊雜質(zhì)檢查 特殊雜質(zhì)主要是指從生產(chǎn)工藝中引入或原料中帶入的雜質(zhì)。許多生化藥物是從生物組織中提取或用微生物發(fā)酵法制得，藥物中易殘存一些雜質(zhì)或其他成分。 例如，胰蛋白酶是從動物胰中提取制得的一種蛋白水 解酶，在制備過程中，易帶入雜質(zhì)糜蛋白酶，根據(jù) 糜蛋白酶的特性可以選用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯為 底物作糜蛋白酶的限度檢查。 第

14、26頁，共102頁。三、安全性檢查 （一）、熱原檢查和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 詳見第十二章藥物制劑分析（P302-303） （二）、異常毒性試驗 異常毒性試驗是用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規(guī)定體重的某種試驗動物，觀察其急性毒性反應(yīng)。反應(yīng)的判斷以試驗動物死亡與否為終點。 第27頁，共102頁。安全性檢查（續(xù)） 中國藥典規(guī)定的異常毒性試驗，實際上是一個限度試驗。在此劑量條件下，一般供試品不應(yīng)使試驗動物中毒致死；如果出現(xiàn)試驗動物急性中毒而死亡，則反映該供試品中含有的急性毒性物質(zhì)超過了正常水平，因此，本試驗又稱異常毒性檢查法。 試驗動物：小白鼠。試驗方法：尾靜脈注射法、皮下注射法、腹腔注射法

15、及口 服給藥法。 第28頁，共102頁。安全性檢查（續(xù)） 例如，玻璃酸酶的異常毒性檢查方法如：取體重17 22g的健康小白鼠5只，分別由皮下注射每1ml中含玻 璃酸酶10000單位的氯化鈉注射液0.25ml，48h內(nèi)不得 發(fā)生皮下組織壞死或死亡如有一只小白鼠發(fā)生組織 壞死或死亡，應(yīng)按上述方法復(fù)試，全部小白鼠在48h 內(nèi)不得有組織壞死或死亡現(xiàn)象。 第29頁，共102頁。安全性檢查（續(xù)） (三)、過敏試驗 過敏試驗是檢查異性蛋白的試驗。試驗動物：豚鼠。試驗方法：皮膚過敏試驗、腹腔注射試驗。 原因：藥物中夾雜有異性蛋白，在臨床使用時易引起病人 多種過敏反應(yīng)（如，皮膚紅斑、血壓下降、休克和 死亡等）。

16、因此，有可能存在異性蛋白的藥物、應(yīng) 作過敏試驗。 第30頁，共102頁。安全性檢查（續(xù)） 例如，蛋白制劑細(xì)胞色素C在制備中可能摻入雜蛋白，中國藥典規(guī)定該溶液及注射液應(yīng)做過敏試驗。方法：取本品適量，加滅菌注射用水稀釋成每lml中含細(xì)胞色素C 7.5mg的溶液，作為致敏液與供試品溶液。另取體重為250350g的健康豚鼠6只，連續(xù)3次隔日腹腔注射致敏液0.5ml， 2周后，再自股(耳)靜脈注射供試品溶液lml，注射后15min內(nèi)，均不得出現(xiàn)過敏性反應(yīng)。如有豎毛、呼吸困難、噴嚏、干嘔或咳嗽三聲等現(xiàn)象中的兩種或兩種以上者，或有抽搐、虛脫或死亡等現(xiàn)象之一者，應(yīng)判為陽性。第31頁，共102頁。安全性檢查（續(xù)

17、） (四)、降壓物質(zhì)檢查法 降壓物質(zhì)是指某些藥物中含有的能導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)，包括組胺、類組胺或其他導(dǎo)致血壓降低的物質(zhì)。 試驗動物：貓(或狗) 。試驗方法：血壓法檢查藥物中所含的降壓物質(zhì) 。 雜質(zhì)的來源:在用動物臟器或組織為原料制備生化藥物的過程中，正常組織內(nèi)存在的組胺及部分氨甚酸脫羧形成的組胺、酪胺等胺類物質(zhì)，均為這類雜質(zhì)的來源。 第32頁，共102頁。安全性檢查（續(xù)） (五)、無菌試驗 無菌試驗是檢查藥品及敷料是否染有活菌的一種方法，是藥典中較重要的檢查項目之一。 原因:由于許多生化藥物是在無茵條件下制備的，且不能高溫滅菌。因此，無菌檢查就更有必要。中國藥典中幾乎所有的注射用藥均做無菌檢查

18、。 第33頁，共102頁。安全性檢查（續(xù)） 無菌試驗的基本步驟a)、制備培養(yǎng)基： 為細(xì)菌生長、繁殖提供所必需的營 養(yǎng)物質(zhì)碳源、氮源、維生素、礦物質(zhì)等。b)、選擇對照用菌液：供對照試驗用。c)、具體檢查：如接種、培養(yǎng)等操作。 d)、結(jié)果判斷：得出陰性或陽性的結(jié)論。 第34頁，共102頁。安全性檢查（續(xù)） (六)、基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污染物檢查 可能雜質(zhì):殘留DNA、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素、蛋白質(zhì)突 變體、蛋白質(zhì)裂解物等。 主要污染物:微生物、熱原、病毒等。 主要檢查項目: 1）外源性DNA 2）宿主細(xì)胞蛋白質(zhì) 3）細(xì)菌內(nèi)毒素 4）其它有關(guān)雜質(zhì)第35頁，共102頁。安全性檢查（續(xù)） (七)、致

19、突變試驗 致突變試驗一般包括：微生物回復(fù)突變試驗、哺乳動 物培養(yǎng)細(xì)胞染色體畸變試驗、嚙齒動物微核試 驗、微生物電極法的致突變試驗。(八)、生殖毒性試驗 生殖毒性試驗一般包括：一般生殖毒性試驗、致畸敏感 期毒性試驗、圍生期毒性試驗。第36頁，共102頁。四、含量（效價）測定 含量表示方法：通常有以下兩種方法 1）百分含量表示。適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥物或經(jīng) 水解后變成小分子的藥物。 2）生物效價或酶活力單位表示。適用于酶類、蛋白質(zhì) 類等藥物。 第37頁，共102頁。第三節(jié) 常用定量分析方法與應(yīng)用 定量分析方法 生化藥物和基因工程藥物常用的定量分析方法包括以下四類：第38頁，共102頁。定量分析方

20、法（續(xù)）3）生物檢定法：以藥物對生物體的作用效果為依據(jù)， 從而測定效價或活性。第39頁，共102頁。定量分析方法（續(xù)）第40頁，共102頁。一、理化分析法 （一）、化學(xué)分析法基本原理： 基于分析組分的化學(xué)、物理性質(zhì)，將其溶解、揮發(fā)或轉(zhuǎn)化為易于與體系分離的純物質(zhì)，再對其進(jìn)行質(zhì)量測定，從而獲得所分析樣品中被測組分的含量。 1、重量法第41頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） 常用方法： 第42頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） 2、滴定法 常用方法： 酸堿滴定法、氧化還原滴定法、絡(luò)合滴定法。 基本原理： 若樣品中被測組分與標(biāo)準(zhǔn)滴定液能夠定量地、快速地發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，且該反應(yīng)具有較強(qiáng)的選擇性和適當(dāng)?shù)慕K點指示

21、方法，我們將可以利用該滴定反應(yīng)測定相應(yīng)的化學(xué)組分。 第43頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） (二)、電化學(xué)分析法 常用方法： 離子選擇性電極分析法、化學(xué)生物傳感器分析法、極譜分析法、微電流電位法。 基本原理： 當(dāng)表面涂有敏感物質(zhì)的電極與被測藥物接觸時,將發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生具有一定特征的電信號。電化學(xué)分析將利用該電信號與藥物濃度成比例的關(guān)系進(jìn)行藥物定量分析。 第44頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） (三)、光譜分析法 1、比色法 樣品中被測組分在可見紫外光區(qū)沒有明顯的特征吸收，但它能夠與顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)，生成在可見光區(qū)具有明顯特征吸收的有色物質(zhì)?；谠撎卣魑盏膹?qiáng)弱，從而定量測定樣品中的被測組

22、分。 2、紫外分光光度法 若樣品中被測組分或被測組分轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物在紫外光區(qū)具有明顯的特征吸收，基于該吸收分析測定被測組分。 第45頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） 比色法與紫外分光光度法的比較： 實際上，它們均是相同一類分析方法。通常比色法要進(jìn)行衍生化，產(chǎn)生在可見光區(qū)有明顯吸收的有色物質(zhì)，而紫外光譜法通常不需要衍生化，若衍生化，也只是產(chǎn)生在紫外光區(qū)有明顯吸收的物質(zhì)。 第46頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） 例如：粘多糖硫酸軟骨素的比色法測定、蛋白質(zhì)和糜蛋白 酶的分光光度法測定第47頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） 3、熒光分光光度法 具有共軛大環(huán)的分子均能產(chǎn)生特征熒光光譜，利用熒光強(qiáng)度與濃度的

23、比例關(guān)系對生物大分子進(jìn)行定量分析。 由于很多生物大分子均有熒光吸收，因此熒光分光光度法是該類物質(zhì)非常重要的一種定量分析方法。 第48頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） (四)、色譜分析法 1、高效液相色譜（High Performance Liquid Chromato- graphy i.e. HPLC）在生化藥物分析中，常用的HPLC有三種： a）反相高效液相色譜（reversed phase HPLC i.e. RP-HPLC） b) 高效離子交換色譜(High Performance Ion Exchange Chromatography i.e. HPIEC) c)高效凝膠過濾色譜(H

24、igh Performance Gel Filtration Chromatography i.e. HPGFC). 第49頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） (1)、反相高效液相色譜（RP-HPLC） 特 點 可以總結(jié)為以下5個方面:a）固定相：柱填料為C4、C8和C18烷基硅烷鍵合相。這些直鏈飽和烷烴是通過共價結(jié)合到硅膠載體上。最常用的為C18烷基鍵合相，即ODS。b）流動相: 為極性二元或三元組合溶劑，常用的為甲醇水，乙腈水，或甲醇、乙腈分別與緩沖液構(gòu)成的多元組合溶劑。第50頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） c）樣品中極性大的組分先洗脫出柱，極性小的組分后流出色譜柱。d）鍵合固定相不易被極

25、性流動相洗脫，同時，由于固定相的非極性和強(qiáng)的化學(xué)惰性，使樣品易于洗脫，保持了色譜柱的可逆性和長壽命。e)易于程序化改變流動相的組分濃度，即梯度洗脫法，從而分析組分性質(zhì)相差較大的復(fù)雜體系。 第51頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） 示例：基因工程藥物生白能的含量測定 固定相：ODS120T 流動相：A液：三氟乙酸水（0.1%） B液：三氟乙酸水溶液（1%）乙腈（90：10） 緩沖液: pH=7.0的磷酸緩沖液洗脫方式: 梯度洗脫，其程序為： 第52頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） 定量方法：外標(biāo)法、 其外標(biāo)物為對照品。 tR =21.236min 為主成分生白能； tR =13.639min 為添

26、加劑人血白蛋白。第53頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） (2)、高效離子交換色譜（HPIEC） 基本原理 離子交換色譜是以離子交換樹脂作為固定相，樹脂上具有固定離子基團(tuán)和可交換離子基團(tuán)，當(dāng)流動相帶著已電離化的組分通過固定相時，組分離子與樹脂上可交換的離子基團(tuán)進(jìn)行可逆交換，在流動過程中不斷發(fā)生可逆交換，根據(jù)組分離子對樹脂親和力不同而得到分離。 特 點 可以歸納為以下4個方面: a）可在所有的PH值范圍內(nèi)使用。對于廣泛選擇各種緩沖液洗脫體系更為有利。 第54頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） b) 填料的使用壽命長，易于可逆再生。有效防止了污染柱的性能下降或報廢。 c) 很少有非特異性吸附，對于保持

27、樣品生物活性較為有利。基于此原因，離子色譜廣泛應(yīng)用于分離或分析可離解的生物化合物，如氨基酸、多肽、核酸、核苷和各種堿基以及蛋白質(zhì)。 d) 流動相多為水溶液。在以水為流動相的離子交換色譜中，組分的保留值和分離度主要通過控制流動相的PH值和離子強(qiáng)度來調(diào)節(jié)。組分的分離是采用鹽濃度增大的梯度洗脫方法。 第55頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） (3)、高效凝膠過濾色譜（HPGFC） 基本原理 固定相為多孔性凝膠，流動相為緩沖水溶液。被分離的樣品組分分子依據(jù)其大小（或分子量）不同滲入凝膠孔的深度不同，洗脫的難易程度也不同，從而按組分的分子大?。ɑ蚍肿恿浚┓植级蛛x測定。 特 點 a）組分的保留時間分布由組

28、分分子大小分布決定。體積越小的組分分子，滲入凝膠孔越深，洗脫越困難，因此，大分子優(yōu)先于小分子被洗脫。 第56頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） b）流動相為固定比例的緩沖水溶液。有時加入少量的能與水互溶的有機(jī)改性劑或表面活性劑。 c）活性蛋白質(zhì)可以回收。 d）HPGFC廣泛應(yīng)用于生物藥物大分子的分子量分布測定。它是測定蛋白質(zhì)分子量的一種重要方法。 第57頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） 2、灌注色譜（Perfusion Chromatography）基本原理 灌注色譜的分離介質(zhì)為高度交聯(lián)的具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子物質(zhì),它具有80150nm的大擴(kuò)散孔和600800nm的貫穿孔。流動相流經(jīng)介質(zhì)時，存在兩

29、種方式：一種，在淺表面的大擴(kuò)散孔中的擴(kuò)散作用，另一種為直接通過內(nèi)表面的貫穿孔而流動。由于貫穿孔的大孔徑使后者為主要的分離方式。分子結(jié)構(gòu)和大小的不同使其與內(nèi)表面孔的相互作用存在差異，從而達(dá)到分離測定的目的。第58頁，共102頁。理化分析法（續(xù)） 特 點 a）分離柱內(nèi)表面積大量增加,使柱容量增大、分辨率提高。 b）流動相流速的增加對柱效的影響極小,因此生物大分子可以實現(xiàn)快速分離純化與測定。 c）由于柱效高、分離時間短和生物活性降低少，因此，灌注色譜主要用于基因工程藥物和其它大分子藥物的分離純化與分析。第59頁，共102頁。二、酶 法 （1）分析原理是以酶催化某化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過對酶促反應(yīng)速度的測

30、定或?qū)ι晌餄舛鹊臏y定而檢測相應(yīng)物質(zhì)含量。 酶是具有專一性催化功能的蛋白質(zhì)。利用酶的特性測定藥物的含量，與其他分析方法相比有許多獨特的特點，具體體現(xiàn)在以下六個方面： （2）測定方法具有很強(qiáng)的專一性，常用于復(fù)雜組分中結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)比較相近的同類物質(zhì)的分析鑒定。 第60頁，共102頁。酶法（續(xù)） （3）樣品一般不需要很復(fù)雜的預(yù)處理，操作簡單。 （4）樣品和試劑用量少，測定快速準(zhǔn)確、靈敏度高。 （5）反應(yīng)條件溫和，一般不需要強(qiáng)酸強(qiáng)堿。 （6）酶不易于保存，結(jié)構(gòu)很不穩(wěn)定，易于受外界條件的影響而發(fā)生結(jié)構(gòu)改變或變性而引起酶失活。 在實際分析中，影響酶應(yīng)用的兩個最顯著的因素為“強(qiáng)的專屬性”和“不穩(wěn)定性”

31、。 第61頁，共102頁。酶法（續(xù)） （一）、酶活力測定法1、基本概念酶的活性單位(國際單位IU) 在25下，以最適的底物濃度、最適的緩沖液離子強(qiáng)度以及最適的pH值諸條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一個微摩爾底物的酶量定為一個活性單位。酶的比活性即定為一毫克酶的活性單位。 酶活力（酶活性） 酶活力是指酶催化某化學(xué)反應(yīng)的能力，其表征指標(biāo)為酶催化該化學(xué)反應(yīng)的速度。而速度用單位時間內(nèi)反應(yīng)底物的減少或產(chǎn)物的增加量來確定。分析對象是作為藥物的酶。 第62頁，共102頁。酶法（續(xù)） a）終點法：在適當(dāng)條件下，把酶和底物混合，測定生成一定量產(chǎn)物所需的時間。 b）反應(yīng)速率法：該類方法是通過測定酶促反應(yīng)的速率從而表征酶活力

32、，有兩種方法實現(xiàn)該速率的測定。其一、間斷一定時間或連續(xù)測定反應(yīng)指示量（如吸光度）的變化；其二、反應(yīng)間隔一定時間，停止反應(yīng)，測定底物減少或產(chǎn)物增加的量。 酶活力測定的常用方法 第63頁，共102頁。酶法（續(xù)） 2、酶促反應(yīng)的條件及影響因素 酶促反應(yīng)的動力學(xué)，滿足于Michaelie-Menten方程（米氏方程），其表達(dá)式為：其中，在一定底物濃度S時反應(yīng)的速率； Km米氏常數(shù)； 在底物飽和時的最大反應(yīng)速率?；谠摲匠蹋梢源_定酶促反應(yīng)速率與底物濃度S之間的定量關(guān)系。第64頁，共102頁。酶法（續(xù)） 條件選擇的基本要求為： 所有待測定的酶分子都應(yīng)該能夠正常地發(fā)揮它的作用。即，反應(yīng)系統(tǒng)中除了待測定的酶

33、濃度是影響速度的唯一因素外，其它因素都處于最適于酶發(fā)揮催化作用的水平。 由于酶的不穩(wěn)定性，易于失活，因此，反應(yīng)條件的選擇就顯得極其重要，主要的影響因素是底物、溫度和PH值。 第65頁，共102頁。酶法（續(xù)） （1）、底物a）、底物的性質(zhì)應(yīng)在物理化學(xué)性質(zhì)上與產(chǎn)物不同，以便于產(chǎn)物的測定。b）、底物的濃度應(yīng)足夠的高。將使酶反應(yīng)的速度不受其影響。此時，反應(yīng)速率僅與酶量成正比，從而由速率測定確定酶含量。一般選擇S=100Km。 c）、大多數(shù)酶具有相對專一性，在可被酶作用的各種底物中一般選擇Km小的底物，這樣可以減少酶的用量。 基于酶促反應(yīng)條件選擇的基本要求，主要考慮的影響因素有以下幾方面： 第66頁，共

34、102頁。酶法（續(xù)） （2）溶液PH 溶液PH對酶促反應(yīng)將產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，在測定時，不但要選擇適宜的反應(yīng)PH，而且要將反應(yīng)維持在該PH值。其影響主要表現(xiàn)在以下幾方面： a）它可能改變酶的活性中心的解離狀況，升高或降低酶的活性； b）可能破壞酶的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象導(dǎo)致酶失效； c）可能作用于反應(yīng)系統(tǒng)的其它組成成分，從而影響酶反應(yīng)，甚至改變可逆反應(yīng)進(jìn)行的方向。 第67頁，共102頁。酶法（續(xù)） （3）溫度 酶反應(yīng)對溫度十分敏感，因為溫度能直接影響化學(xué)反應(yīng)速度本身，也能影響酶的穩(wěn)定性，還可能影響酶的構(gòu)象和酶的催化機(jī)制。一般而言，溫度變化1，酶反應(yīng)速度可能相差5左右。因此，實驗中溫度變動應(yīng)控制在0.1以內(nèi)。酶

35、反應(yīng)溫度通常選用25、30或37。（4）、輔助因子 有些酶需要金屬離子，有些酶則需要相應(yīng)的輔酶物質(zhì)。為了提高酶在反應(yīng)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，有些也需要某些相應(yīng)的物質(zhì)。 第68頁，共102頁。酶法（續(xù)） （5）、空白和對照實驗 空白實驗用于消除背景，噪音和其它一些未知影響因素對測定結(jié)果的影響。該實驗可通過不加酶、或不加底物，或二者都加(但酶需預(yù)先經(jīng)過失效處理)來實現(xiàn)。 對照實驗：在濃度與測定量之間無準(zhǔn)確的關(guān)系，或計量關(guān)系易受條件影響時，通常用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑進(jìn)行測定，從而確定濃度與測定量之間的計量關(guān)系。第69頁，共102頁。酶法（續(xù)） 3、測定方法 測定方法按取樣和檢測方式可分為取樣測定法和連續(xù)測定法。

36、 （1）取樣測定法 在酶反應(yīng)開始后不同的時間，從反應(yīng)系統(tǒng)中取出一定量的反應(yīng)液，并用適當(dāng)?shù)姆椒ㄍＶ蛊浞磻?yīng)后，再根據(jù)產(chǎn)物和底物在化學(xué)性質(zhì)上的差別，選用適當(dāng)?shù)臋z測方法進(jìn)行定量分析，求得單位時間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法,即為取樣測定法。 第70頁，共102頁。酶法（續(xù)） a）加入酶的變性劑，使其酶失去專一性的催化活性。 b）由于酶對溫度極為敏感，往往可以采用加熱使酶失活，從而停止反應(yīng)。 停止酶促反應(yīng)的常用方法： c）基于酶促反應(yīng)對溶液PH較敏感，若反應(yīng)必須在適當(dāng)?shù)腜H范圍，否則反應(yīng)將停止，且無其它副反應(yīng)時，就可以采用改變PH的辦法終止反應(yīng)。 第71頁，共102頁。酶法（續(xù)） 例如，三氯醋酸是一種高效專一

37、的蛋白質(zhì)變性劑和沉淀劑，其缺點是在紫外光區(qū)有吸收. 高氯酸沒有上述缺點，并且用氫氧化鉀中和、冷卻后，KCIO4還可沉淀除去，但它不適于對酸和氧化劑敏感的測定對象。 第72頁，共102頁。酶法（續(xù)） （2）連續(xù)測定法 根據(jù)底物與產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)方面的差異，在反應(yīng)過程中實時、在線測定底物或產(chǎn)物的變化量,即為連續(xù)測定法。 特 點 a)準(zhǔn)確性和測定效率均高于取樣測定法。 b)對檢測技術(shù)和實驗儀器均要求較高，既要求檢測要快速，又要求準(zhǔn)確性和靈敏度要高，有時甚至要時間分辨。 c)實時在線檢測是當(dāng)今分析檢測技術(shù)發(fā)展的方向，因此連續(xù)測定法為當(dāng)前重要的檢測技術(shù)。 第73頁，共102頁。酶法（續(xù)） （3）檢測方

38、法 第74頁，共102頁。酶法（續(xù)） 4、反應(yīng)速度的測定與要求 酶活力測定的目的，就是要通過酶反應(yīng)速度的測定，求得酶的濃度或含量，因此，測定的要求即為反應(yīng)速度必須和酶濃度間有線性的比例關(guān)系。反應(yīng)速率的測定是通過 “酶反應(yīng)進(jìn)程曲線”而實現(xiàn)，其曲線的鈄率即為酶反應(yīng)速率。酶反應(yīng)進(jìn)程曲線和酶濃度曲線的特點 僅在反應(yīng)的初始階段，反應(yīng)速度與酶濃度間才會出現(xiàn)良好的線性關(guān)系，該線性關(guān)系才能應(yīng)用于酶濃度測定，該反應(yīng)體系才是該酶濃度測定的適宜體系。 第75頁，共102頁。酶法（續(xù)） 第76頁，共102頁。酶法（續(xù)） a) 制備兩條曲線：酶反應(yīng)進(jìn)程曲線和酶濃度曲線。從前者求得反應(yīng)初速度，根據(jù)初速度繪制酶濃度曲線，并

39、通過后者來檢驗酶反應(yīng)測定系統(tǒng)是否適宜。 c)在較多的時候，初始進(jìn)程曲線并不是明顯的直線，此時曲線的初始鈄率即為酶的活性。此時，反應(yīng)時間的測定也就要盡可能準(zhǔn)確。 酶濃度測定的具有要求 b)初始測定點（包括零時點）應(yīng)盡可能多（至少3-5個點），以保證在較低的產(chǎn)物濃度時準(zhǔn)確測定酶的活性。 第77頁，共102頁。酶法（續(xù)） （二）、酶分析法 酶分析法是一種以酶為分析工具的分析方法，分析對象即為與酶反應(yīng)有關(guān)的非酶物質(zhì)。 分析對象：底物、輔酶、酶活化劑、酶抑制劑。 分析方法 a)動力學(xué)分析法：可以應(yīng)用于底物、輔酶、酶活化劑、 酶抑制劑。 b)總變量分析法：實際上，即就是終點法，或者稱為平 衡法，該方法僅能

40、應(yīng)用于底物濃度的測定。 校正曲線：上述兩類方法測定濃度均需使用校正曲線。 第78頁，共102頁。酶法（續(xù)） 基本原理 選擇適宜的反應(yīng)控制條件，使被測物（底物、輔酶、活化劑、抑制劑等其中之一）的濃度為影響酶促反應(yīng)速率的唯一因素，此時酶反應(yīng)速度僅與被測物濃度存在確定的比例關(guān)系，通過測定該反應(yīng)速度就可確定被測物的濃度。 1、動力學(xué)分析法 第79頁，共102頁。酶法（續(xù)） 注 意 a）動力學(xué)分析中通常使被測物以外的其它組分處于恒定和最適。上述的“唯一因素”，在實際應(yīng)用中，往往很難達(dá)到要求，僅能使其它影響因素盡可能減小，使被測物濃度成為影響酶促反應(yīng)速度的主要因素。 b) 校正系統(tǒng)與測定系統(tǒng)應(yīng)完全相同。在

41、測定未知樣品時，所采用的反應(yīng)、測定系統(tǒng)和制備標(biāo)準(zhǔn)校正曲線時所用的系統(tǒng)應(yīng)完全相同，而且待測樣品的濃度還應(yīng)控制在這一曲線范圍以內(nèi)。 第80頁，共102頁。酶法（續(xù)） 動力學(xué)測定法的四種測定系統(tǒng) a）被測物是酶的底物 從米氏方程可知，當(dāng)?shù)孜餄舛萐 Km時，酶反應(yīng)速度與底物濃度成正比，即kS，酶反應(yīng)相對底物而言為一級反應(yīng)，因此測定酶反應(yīng)速度可以得知其濃度。 b）被測物是輔酶 需要輔酶(NAD)、輔酶 (NADP)、輔酶A(CoA)之類輔酶的反應(yīng)可看作是雙底物反應(yīng)。當(dāng)另一類底物濃度足夠高時，反應(yīng)變?yōu)閱蔚孜锓磻?yīng), 反應(yīng)速度將與輔酶濃度成正比。 第81頁，共102頁。酶法（續(xù)） 示 例 :以CoA的測定為例

42、基于它是酮戊二酸脫氫酶的輔酶的特點,即-酮戊二酸 + CoA + NAD+ 琥珀酰-CoA + NADH + CO2 當(dāng)?shù)孜?酮戊二酸和NAD處于足夠高的濃度時，反應(yīng)速度與CoA的濃度成正比。此反應(yīng)可通過NADH在340nm處特征峰吸收度的變化來測定。 第82頁，共102頁。酶法（續(xù)） c）被測物為活化劑 當(dāng)其他條件最適且一定時，活化劑在低濃度范圍內(nèi)，酶反應(yīng)速度隨活化劑濃度增大而升高，并在一定范圍內(nèi)具有線性比例關(guān)系。 用動力學(xué)方法測定時應(yīng)注意兩個問題、活化劑濃度超過一定水平后常導(dǎo)致抑制. 、對于某一種酶，相似的離子往往也能表現(xiàn)出活化作用，因此測定不專一，易受到干擾。 第83頁，共102頁。酶法

43、（續(xù)） d）被測物是抑制劑 不可逆抑制劑對酶反應(yīng)產(chǎn)生的抑制程度隨抑制劑濃度呈線性增加，而且酶反應(yīng)的最終抑制程度由抑制劑的絕對量決定. 不可逆抑制劑 可逆抑制劑在底物濃度一定時，在低的抑制劑濃度范圍內(nèi)，酶反應(yīng)速度隨抑制劑濃度升高呈線性降低。 可逆抑制劑第84頁，共102頁。酶法（續(xù)） 基本原理 根據(jù)被測物質(zhì)的性質(zhì)，選擇適宜的分析工具酶對該物質(zhì)進(jìn)行作用，然后在反應(yīng)完成后，借助物理化學(xué)方法測出其總變化量，并參考反應(yīng)的平衡點，計算出被測物的實際含量或濃度的一種分析方法。僅適用于底物的測定。 2、總變量分析法(終點法或平衡法) 第85頁，共102頁。酶法（續(xù)） 分析方法的幾個重要問題 、被測底物的濃度應(yīng)

44、很小，并控制反應(yīng)于一級反應(yīng)水平。防止過多的產(chǎn)物生成，避免逆反應(yīng)。 、其它因素應(yīng)盡量處于最適水平，雙底物反應(yīng)的另一底物應(yīng)具有足夠高的濃度。 反應(yīng)本身要求酶的用量要高，以保證較快地達(dá)到終點，但由于酶的價格昂貴，因此適宜用量即為一個重要問題。 、酶的用量要適宜。一般而言，工具酶用量可控制在l-2Km單位(U/m1)左右。而終點法的測定時間多控制在2-l0min。第86頁，共102頁。酶法（續(xù)） （三）、酶法應(yīng)用示例 示例一、胰蛋白酶效價測定 基本原理 胰蛋白酶能專一地水解肽鍵、酰胺鍵及酯鍵。目前底物采用專屬性較高的N-苯甲酰L精氨酸乙酯，在胰蛋白酶作用下水解為N-苯甲酰L精氨酸。通過底物在253nm

45、處體系吸光度的變化速率來表達(dá)酶促反應(yīng)的速率，從而用該連續(xù)測定法測定胰蛋白酶的效價。 測定方法：請參見教材p341 第87頁，共102頁。酶法（續(xù)） 示例二、胃蛋白酶的活力測定 基本原理 胃蛋白酶催化血紅蛋白水解生成不被三氯醋酸所沉淀的氨基酸，同時基于三氯醋酸使血紅蛋白變性而沉淀的性質(zhì)，使蛋白水解反應(yīng)終止。從而利用取樣測定法（或終止反應(yīng)法）測定胃蛋白酶的活性，其水解產(chǎn)物氨基酸濃度的變化速度將根據(jù)水解產(chǎn)物中酪氨酸在275nm處的紫外吸收進(jìn)行測定。測定方法：請參見教材p342 第88頁，共102頁。三、電 泳 法 在電解質(zhì)溶液中，不同的帶電粒子在電場作用下，以不同的遷移速度向其所帶電荷相反的方向進(jìn)行

46、電極遷移?；诓煌Ｗ拥奶囟ㄟw移速度，使組分分離成狹窄的組分帶，從而分析檢測相應(yīng)的物質(zhì)。 （一）電泳法的基本原理和分類 遷移速度服從于下述方程：v = ueE其中，v為離子移動速度，E為電場強(qiáng)度，ue為電泳遷移率。 基本原理第89頁，共102頁。電泳法（續(xù)） 遷移速度服從于下述方程：v = ueE其中，v為離子移動速度，E為電場強(qiáng)度，ue為電泳遷移率。 電泳遷移率ue，在介質(zhì)一定時，其值僅與帶電粒子的性質(zhì)有關(guān)，為其特性常數(shù)，據(jù)此對物質(zhì)進(jìn)行分析鑒定。 分 類 第90頁，共102頁。電泳法（續(xù)） 在電場作用下，溶液中的同種分子具有相同的泳動速度，不同種類的分子其泳動速度不同。電場將逐漸密集同種分子

47、，而與其他電泳速度不同的物質(zhì)之間形成明顯的界面，從而進(jìn)行分離鑒定。 基本原理特 點 a)、在溶液中電泳，無惰性支持介質(zhì)。 b)、不同種類物質(zhì)之間形成界面，這種界面可以是完全分離的，也可以是部分分離的。 1、自由界面電泳(Moving-boundary Electrophoresis) 第91頁，共102頁。電泳法（續(xù)） 惰性介質(zhì)支持的溶液組分，在電場作用下，基于不同組分與惰性介質(zhì)的物理相互作用的差異以及不同組分的電學(xué)性質(zhì)差異，使不同組分在該介質(zhì)上具有不同的泳動速度，形成各自組分的區(qū)帶，從而分離、分析溶液組分。 基本原理2、區(qū)帶電泳(Zone Electrophoresis) 特 點 a)、存在惰性支持介質(zhì)。 b)、電泳最終會使不同組分形成明顯的分離區(qū)帶，具有較好的分離性。 第92頁，共102頁。電泳法（續(xù)） HPCE是離子或荷電粒子以電場為驅(qū)動力，在毛細(xì)管中按其淌度或（和）分配系數(shù)不同進(jìn)行高效、快速分離的一種電泳新技術(shù)。基本原理3、高效毛細(xì)管電泳(High Performance Capillary Electrophoresis, i.e. HPCE) 特 點 a)、高效、快速、樣品用量少 。 b)、容易自動化、操作簡便、溶劑消耗少、環(huán)境污染小第93頁，共102頁。電泳法（續(xù)） 用濾紙作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。 測定方法