獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)課件

1、第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)2022/7/29第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第1頁，共144頁。使用獸藥的目的防治食品動(dòng)物疾病促進(jìn)生長(zhǎng)提高飼料利用率傳統(tǒng)的獸藥是指用于預(yù)防和治療畜禽疾病的藥物。但是, 隨著集約化養(yǎng)殖生產(chǎn)的開展,一些化學(xué)的、生物的藥用成分被開發(fā)成具有某些功效的動(dòng)物保健品或飼料添加劑, 也屬于獸藥的范疇。獸藥的主要用途有防病治病、促進(jìn)生長(zhǎng)、提高生產(chǎn)性能、改善動(dòng)物性食品的品質(zhì)等。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第2頁，共144頁。獸藥的使用情況據(jù)19661974年統(tǒng)計(jì),美國大約已有78%80%的食品動(dòng)物,在其一生中或多或少服用過藥物。目前,不少國家所有的食品動(dòng)物幾乎都接受過某種化學(xué)治療劑或預(yù)防劑。在集約化畜

2、牧業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的同時(shí),用于促進(jìn)生長(zhǎng)、同步發(fā)情等非治療用途的藥物的品種和數(shù)量也在不斷地增加,用作治療或預(yù)防的獸藥及化學(xué)藥品被廣泛地用作飼料添加劑,以促進(jìn)生長(zhǎng),提高飼料的轉(zhuǎn)化率,控制生殖周期及繁殖性能,增進(jìn)飼料的適口性及改善動(dòng)物性食品對(duì)人的口味。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第3頁，共144頁。獸藥的殘留獸藥殘留是指動(dòng)物性產(chǎn)品的任何可食部分含有獸藥母化合物或其代謝物。獸藥最高殘留限量（MRL）：是指某種獸藥而在食物中或食物表面產(chǎn)生的的最高允許獸藥殘留量（單位g/kg, 以鮮重計(jì)）。獸藥殘留主要是由于各種正常用藥和藥物濫用造成的,另外,休藥期過短, 是造成動(dòng)物性食品獸藥殘留過量的另一個(gè)重要原因。休藥期：是指自

3、末次給藥到動(dòng)物允許屠宰或其動(dòng)物性產(chǎn)品（乳、蛋等）獲準(zhǔn)上市的間隔時(shí)間。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第4頁，共144頁。獸藥的危害由于糧食生產(chǎn)及發(fā)展畜牧業(yè)的需要，大量應(yīng)用藥物及化學(xué)藥品，人類一生中不斷與食物中的藥物及化學(xué)殘留物接觸，無疑會(huì)引起過敏、致畸、致突變及致癌等不良反應(yīng)。由于飼料藥物添加劑特別是亞治療劑量的各類抗生素在畜牧生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用,畜產(chǎn)品中殘留的藥物對(duì)于環(huán)境及公眾健康構(gòu)成的潛在危害已成為嚴(yán)重的問題,給獸藥行業(yè)的發(fā)展帶來了惡劣影響。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第5頁，共144頁。立法機(jī)構(gòu)由于獸藥用量增大,特別是飼料藥物添加劑(簡(jiǎn)稱藥物添加劑)的廣泛應(yīng)用,伴隨產(chǎn)生的食品動(dòng)物(food prodcin

4、g animals)組織和產(chǎn)品中藥物殘留對(duì)消費(fèi)者的健康和環(huán)境的潛在危害也日趨嚴(yán)重,因此獸藥及藥物添加劑的管理越來越受到各國農(nóng)業(yè)及衛(wèi)生部門的重視,動(dòng)物性食品中的獸藥殘留問題已得到國際有關(guān)組織高度重視,并為減少獸藥殘留對(duì)公眾健康的危害作了不少的工作,采取了許多控制殘留的措施。獸藥在食品中的殘留問題受到了食品法典委員會(huì)(CAC)、食品添加劑法典委員會(huì)等有關(guān)國際性組織的高度重視。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第6頁，共144頁。立法為防止動(dòng)物性食品中可能出現(xiàn)的藥物殘留損害人體健康,1984年在CAC的倡導(dǎo)下由聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)聯(lián)合發(fā)起組織了食品中獸藥殘留立法委員會(huì)(CCRVDF)

5、。CCRVDF的主要宗旨是:為控制食品中的獸藥殘留,篩選并建立適用于全球的獸藥及其他化學(xué)物殘留的分析方法和取樣方法;對(duì)獸藥殘留進(jìn)行毒理學(xué)評(píng)價(jià);按制訂世界或地區(qū)性法規(guī)標(biāo)準(zhǔn) (Codex Standart)的8個(gè)步驟,制定動(dòng)物組織及產(chǎn)品中獸藥最高殘留限量(MRL)法規(guī)及休藥期法規(guī)。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第7頁，共144頁。一、常見獸藥按用途分類抗微生物藥抗寄生蟲藥激素類藥物生長(zhǎng)促進(jìn)劑抗菌藥：磺胺藥、呋喃類藥、喹諾酮類抗病毒藥：干擾素抗蠕蟲藥抗原蟲藥殺蟲藥抗生素：青霉素、鏈霉素、氯霉素第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第8頁，共144頁。1、抗微生物藥抗微生物藥是指對(duì)病原微生物(細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等)具抑

6、制或殺滅作用,主要有用于全身感染的抗生素、磺胺藥及其他化學(xué)合成抗菌藥。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第9頁，共144頁。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可分類為:(1)氨基糖苷類： 鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素、安普霉素等。(2) -內(nèi)酰胺類： 青霉素、頭孢菌素等。(3)四環(huán)素類： 土霉素、金霉素、多西環(huán)素等。(4)氯霉素類： 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等。 (5)大環(huán)內(nèi)酯類： 紅霉素、吉他霉素、泰樂菌素等。(6)林可胺類： 林可霉素、克林霉素。(7)多肽類： 桿菌肽、黏菌素等。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第10頁，共144頁。(8)多烯類：兩性霉素、制霉菌素等。(9)磺胺類及抗菌增效劑： 磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧

7、啶、磺胺異唑、磺胺甲基異唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶等。(10)硝基呋喃類：呋喃西林、呋喃他酮、呋喃要因、呋喃唑酮等。(11)喹諾酮類：萘啶酸、吡哌酸、嗯喹酸、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、奧比沙星、沙拉沙星、馬波沙星等。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第11頁，共144頁。2、抗寄生蟲藥抗寄生蟲藥是指能殺滅或驅(qū)除動(dòng)物體內(nèi)外寄生蟲的藥物。畜禽寄生蟲病的危害性極大,會(huì)給國民經(jīng)濟(jì)造成無法估量的巨大經(jīng)濟(jì)損失。寄生蟲病不僅引起大批畜禽死亡,而且嚴(yán)重影響動(dòng)物生長(zhǎng)率,使乳、肉、蛋、毛、革等畜產(chǎn)品質(zhì)量下降,數(shù)量減少。某些人畜共患寄生蟲病,還能直接威脅人類的健康和生命安全。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第12頁，共144頁。根據(jù)藥

8、物作用的特點(diǎn)，抗寄生蟲藥可分為:(1)抗蠕蟲藥： 苯并咪唑類、咪唑并噻唑類、有機(jī)磷酸酯類、四氫嘧啶類、水楊酰苯胺類、阿維菌素類、哌嗪衍生物等。(2)抗原蟲藥： 聚醚類離子載體抗生素、三嗪類、二硝基類、氯羥吡啶。(3)殺蟲藥： 有機(jī)磷化合物、擬除蟲菊酯類化合物等。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第13頁，共144頁。3、激素與其他生長(zhǎng)促進(jìn)劑(1)性激素動(dòng)物生產(chǎn)中使用的性激素,包括雌性激素(如:雌二醇、己烯雌酚(己烷雌酚、甲地孕酮、雌烯酮等)和雄性激素(如:甲基睪丸酮、丙酸睪酮、氯睪酮)。(2)生長(zhǎng)激素 是由動(dòng)物腦垂體分泌的天然蛋白質(zhì)激素,主要通過促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和脂肪分解來促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng),增加瘦肉率,提高飼料

9、轉(zhuǎn)化率。目前在畜牧業(yè)生產(chǎn)中使用的主要有牛生長(zhǎng)激素(BST)和豬生長(zhǎng)激素(PST)。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第14頁，共144頁。(3)甲狀腺素,類甲狀腺素及抗甲狀腺素。(4)人工合成的蛋白質(zhì)同化激素 人工合成的蛋白質(zhì)同化激素可促進(jìn)動(dòng)物腦下垂體生長(zhǎng)激素的分泌。與抗生素一樣,伴隨著激素活性物質(zhì)在畜禽生產(chǎn)中的使用種類和數(shù)量的不斷增加,反對(duì)使用的呼聲也越來越高。(5)鎮(zhèn)靜劑和-腎上腺素阻斷劑 為了控制被運(yùn)輸及等待屠宰的動(dòng)物的緊張,有些畜牧業(yè)會(huì)非法使用鎮(zhèn)靜劑和腎上腺素阻滯劑。因?yàn)樨i對(duì)于它們所處環(huán)境的突然變化特別敏感,隨之產(chǎn)生的新陳代謝和緊張會(huì)影響肉的質(zhì)量。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第15頁，共144頁。二、常

10、見獸藥殘留的種類與危害 1. 抗生素類藥物多為天然發(fā)酵產(chǎn)物, 是臨床應(yīng)用最多的一類抗菌藥物, 如青霉素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、螺旋霉素、鏈霉素、土霉素、金霉素等。青霉素類最容易引發(fā)超敏反應(yīng), 四環(huán)素類、鏈霉素有時(shí)也能引起超敏反應(yīng)。輕至中度的超敏反應(yīng)一般表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)血壓下降、皮疹、身體發(fā)熱、血管神經(jīng)性水腫、血清病樣反應(yīng)等, 極度超敏反應(yīng)可能導(dǎo)致過敏性休克, 甚至死亡。長(zhǎng)期攝入含氨基糖苷類殘留超標(biāo)的動(dòng)物性食品, 可損害聽力及腎臟功能。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第16頁，共144頁。2. 磺胺類藥物主用于抗菌消炎, 如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶, 磺胺瞇, 菌得清、新諾明等。近年來, 磺

11、胺類藥物在動(dòng)物性食品中的殘留超標(biāo)現(xiàn)象, 在所有獸藥當(dāng)中是最嚴(yán)重的。長(zhǎng)期攝入含磺胺類藥物殘留的動(dòng)物性食品后, 藥物可不斷在體內(nèi)蓄積?；前奉愃幹饕栽渭耙宜峄前返男问浇?jīng)腎臟排出, 在尿中濃度較高, 其溶解度又較低, 尤其當(dāng)尿液偏酸性時(shí), 可在腎盂、輸尿管或膀眈內(nèi)析出結(jié)晶, 產(chǎn)生刺激和阻塞, 造成泌尿系統(tǒng)損傷。引起結(jié)晶尿、血尿、管型尿、尿痛、尿少甚至尿閉。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第17頁，共144頁。3. 硝基呋喃類藥物主用于抗菌消炎, 如呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。通過食品攝入超量硝基呋喃類殘留后, 對(duì)人體造成的危害主要是胃腸反應(yīng)和超敏反應(yīng)。劑量過大或腎功能不全者, 可引起嚴(yán)重毒性反應(yīng), 主要

12、表現(xiàn)為周圍神經(jīng)炎、藥熱、嗜酸性白細(xì)胞增多、溶血性貧血等。長(zhǎng)期攝入可引起不可逆性末端神經(jīng)損害, 如感覺異常、疼痛及肌肉萎縮等, 我國尚未制定硝基呋喃類藥物殘留檢測(cè)國家標(biāo)準(zhǔn)。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第18頁，共144頁。4. 抗寄生蟲類藥物主要用于驅(qū)蟲或殺蟲, 如苯并咪唑、左旋咪唑、克球酚、吡喹酮等。而常用的苯并咪唑類抗寄生蟲藥物有丙硫苯咪唑、丙氧咪唑、噻苯咪唑、甲苯咪唑、丁苯咪唑等。食用殘留有苯并咪唑類藥物的動(dòng)物性食品, 對(duì)人主要的潛在危害是其致畸作用和致突變作用。對(duì)于妊娠期的孕婦有可能發(fā)生胎兒畸形, 如短肢、兔唇等; 對(duì)所有消費(fèi)者來說, 可能由于其致突變作用使消費(fèi)者發(fā)生癌變和性染色體畸變, 從而

13、其后代有發(fā)生畸形的危險(xiǎn)。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第19頁，共144頁。5. 激素類藥物主要用于提高動(dòng)物的繁殖和加快生長(zhǎng)發(fā)育速度, 使用于動(dòng)物的激素有性激素和皮質(zhì)激素。而以性激素(包括多種內(nèi)源性性激素、人工合成的類似性激素的類固醇化合物、人工合成的具有性激素某些特性的非類固醇化合物) 最常用, 如孕酮、睪酮、雌二醇、甲基睪酮, 丙酸睪酮、苯甲酸雌二醇、己烯孕酮等。正常情況下, 動(dòng)物性食品中天然存在的性激素含量是很低的, 因而不會(huì)干擾消費(fèi)者的激素代謝和生理機(jī)能。但攝入性激素殘留超標(biāo)的動(dòng)物性食品, 可能會(huì)影響消費(fèi)者的正常生理機(jī)能, 并具有一定的致癌性, 可能導(dǎo)致兒童早熟、兒童發(fā)育異常、兒童異性趨向等。

14、第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第20頁，共144頁。在畜牧業(yè)中,激素常作為飼料添加劑或埋植于動(dòng)物皮下,達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育(促生長(zhǎng)幅度可以提高10%40%),增加體重,促進(jìn)動(dòng)物發(fā)情等目的,結(jié)果導(dǎo)致動(dòng)物食品中激素殘留。當(dāng)大量使用性激素及其衍生物以后,這類化合物可在動(dòng)物體內(nèi)殘留,而且很穩(wěn)定,不易分解,給人類健康帶來危害。我國、歐盟和美國等已禁止對(duì)食品動(dòng)物使用己烯雌酚及其鹽、酯制劑;禁止將甲基睪丸酮、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍、苯甲酸雌二醇及其鹽、酯制劑作為動(dòng)物促生長(zhǎng)劑使用。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第21頁，共144頁。獸藥中經(jīng)常使用的合成激素是類固醇藥物。人工合成的類固醇激素具有內(nèi)源性激素(雌二醇,睪丸激素,孕酮

15、)相似的結(jié)構(gòu)。歐盟因這類藥物殘留會(huì)影響健康而禁用。1982年,一批有雌激素活性的人工合成代謝制劑,即1,二苯乙烯類藥物被禁止使用。除了激素類外,某些運(yùn)動(dòng)抑制劑和咔唑心安等腎上腺素阻斷劑,也曾經(jīng)被用作減少家畜、家禽的運(yùn)動(dòng)量,達(dá)到減低機(jī)體能量物質(zhì)消耗,增加能量積累的目的。如在長(zhǎng)途運(yùn)輸或應(yīng)激條件下使用利血平這類制劑可以避免家畜體力過分消耗,防止騷動(dòng)和外傷,減低運(yùn)輸和應(yīng)激損失。此外,使用此類制劑可以使產(chǎn)蛋雞和肉雞安全渡過高溫季節(jié),減低其能耗,從而達(dá)到催肥和增加產(chǎn)蛋率的作用。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第22頁，共144頁。另外,尚有一類人工合成的、具有同化作用的增強(qiáng)劑。如玉米赤霉醇(zeranol)等間羥基

16、苯酸丙酯和克侖特羅等受體激動(dòng)劑,它們可以使動(dòng)物組織發(fā)生重新分布,特別是精瘦肉增加和脂肪減少,提高肉的品質(zhì)去迎合消費(fèi)者的喜好。然而,這些物質(zhì)作為藥物有明確的適應(yīng)證,如果在動(dòng)物源食品中殘留就有可能對(duì)機(jī)體造成損害。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第23頁，共144頁。二、食物中獸藥殘留(1)獸藥殘留食品動(dòng)物在應(yīng)用獸藥(包括藥物添加劑)后,獸藥的原形及其代謝物、與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)等有可能蓄積或殘存在動(dòng)物的細(xì)胞、組織或器官內(nèi),或進(jìn)入泌乳動(dòng)物的乳、或產(chǎn)蛋家禽的蛋中,這就是殘留,又稱殘留物或殘毒。動(dòng)物性食品中除了獸藥殘留外,還可能發(fā)生農(nóng)藥殘留、意外污染物或環(huán)境污染物等其他化學(xué)物殘留,本章的重點(diǎn)為獸藥殘留。獸藥殘留是指動(dòng)

17、物產(chǎn)品的任何食用部分所含獸藥的母體化合物及其代謝物，以及與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)的殘留。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第24頁，共144頁。(2)獸藥殘留的來源在食品動(dòng)物體內(nèi)或動(dòng)物性食品中發(fā)現(xiàn)的違章殘留,大都是由用藥錯(cuò)誤造成的,其原因主要有:不正確地應(yīng)用藥物,如用藥劑量、給藥途徑、用藥部位和用藥動(dòng)物的種類等不符合用藥指示,這些因素有可能延長(zhǎng)藥物殘留在體內(nèi)的時(shí)間,從而需要增加休藥的天數(shù);在休藥期結(jié)束前屠宰動(dòng)物;屠宰前用藥掩飾臨床癥狀,以逃避屠宰前檢查; 以未經(jīng)批準(zhǔn)藥物作為添加劑飼喂動(dòng)物;第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第25頁，共144頁。藥物標(biāo)簽上的用法指示不當(dāng),造成違章殘留物;飼料粉碎設(shè)備受污染或?qū)⑹⑦^抗菌藥物的容器

18、用于貯藏飼料;接觸廄舍糞尿池中含有抗生素等藥物的廢水和排放的污水(如豬經(jīng)常攝入這種污水);任意以抗生素藥渣喂豬或其他食品動(dòng)物等濫用抗生素,是出現(xiàn)抗生素殘留的主要原因。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第26頁，共144頁。美國食品藥物管理局(FDA)和美國獸醫(yī)中心(CVM)的調(diào)查結(jié)果表明,引起違章藥物殘留的常見原因?yàn)?不遵守休藥期;使用未經(jīng)批準(zhǔn)的藥物;未做用藥記錄;飼料加工或運(yùn)送錯(cuò)誤;盛放它種藥物的貯存容器未充分清洗干凈等。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第27頁，共144頁。(3)獸藥殘留的種類(形式)第一類是以游離或結(jié)合形式存在的原藥及其主要代謝物(除高親脂性化合物外),因代謝和排泄迅速,不會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)蓄積。但

19、這些物質(zhì)可能具有毒性作用,而且被人攝入后在體內(nèi)可生成高度活化的中間產(chǎn)物(親電子基團(tuán)、自由基等),因而對(duì)消費(fèi)者具有潛在的危害性。第二類是共價(jià)結(jié)合代謝物,因其從機(jī)體排出相對(duì)較慢,它們的存在對(duì)于靶動(dòng)物有潛在的毒性作用,而對(duì)于消費(fèi)者,由于結(jié)合殘留在人體內(nèi)不可能再活化,其生物利用率和含量均低,可能只顯示很低的毒性。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第28頁，共144頁。殘留毒理學(xué)意義較大的獸藥按其用途分類主要包括:抗生素類、合成抗菌素類、抗寄生蟲類藥、生長(zhǎng)促進(jìn)劑和殺蟲劑等?？股睾涂咕亟y(tǒng)稱抗微生物藥物,是最主要的獸藥添加劑和獸藥殘留,約占藥物添加劑的60%。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第29頁，共144頁。(4)影響食

20、品動(dòng)物組織中藥物殘留的因素經(jīng)內(nèi)服或注射給藥的動(dòng)物,其組織中存在的藥物及其代謝物或降解產(chǎn)物的殘留。組織中藥物殘留隨藥物種類、劑量、給藥途徑、藥物及其代謝物特性的不同而異。在有些情況下,飼料也會(huì)影響動(dòng)物組織中的藥物殘留,但藥物休藥期的執(zhí)行情況是影響組織殘留的最重要因素。屠宰后胴體加工過程也是影響藥物殘留檢出率的因素之一。烹調(diào)和貯藏溫度亦影響殘留藥物在組織中的穩(wěn)定性。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第30頁，共144頁。對(duì)于大多數(shù)抗微生物藥來說,藥物從動(dòng)物體內(nèi)消除屬一級(jí)動(dòng)力學(xué),而大多數(shù)組織中藥物殘留抗微生物活性的喪失是一個(gè)零級(jí)動(dòng)力學(xué)過程。這表示藥物殘留量越多,它們從食用組織中消除所需的時(shí)間就越長(zhǎng)。如果藥物添加

21、劑是親脂性的,那么它們會(huì)蓄積在脂肪組織中,而且其消除速度明顯比親水性藥物慢。實(shí)際上,存在于家禽食用組織、牛肉、羊肉、乳和蛋中的藥物殘留的種類和發(fā)生率差異較大。這是動(dòng)物屠宰前或其乳和蛋上市前停止用藥時(shí)間長(zhǎng)短的一種反映。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第31頁，共144頁。三、獸藥殘留的危害動(dòng)物性食品中的獸藥殘留對(duì)人體健康的影響,主要表現(xiàn)為變態(tài)反應(yīng)與過敏反應(yīng)、細(xì)菌耐藥性、致畸作用、致突變作用和致癌作用,以及激素(樣)作用等多方面。(1)變態(tài)反應(yīng)與過敏反應(yīng)雖然許多抗菌藥物被用作治療藥或飼料藥物添加劑,但是只有少數(shù)抗菌藥物能致敏易感的個(gè)體,如青霉素、磺胺類藥、四環(huán)素及某些氨基糖苷類抗生素等。這些藥物具抗原性,能

22、刺激機(jī)體內(nèi)抗體的形成。由于青霉素具強(qiáng)抗原性,而且在人和動(dòng)物中廣泛應(yīng)用,所以青霉素具有最大的潛在危害性。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第32頁，共144頁。變態(tài)反應(yīng)癥狀多種多樣,輕者表現(xiàn)為紅疹,嚴(yán)重時(shí)甚至發(fā)生危及生命的綜合征?？咕幬餁埩羲碌淖儜B(tài)反應(yīng),在人所發(fā)生的食物耐受不良現(xiàn)象中所占的比例甚小,流行病學(xué)資料表明,在允許使用量的范圍內(nèi),青霉素只對(duì)人群中的極少數(shù)個(gè)體產(chǎn)生危害作用。如某些人在食用了含有10、4.2、0.06和0.03I/mL青霉素的牛奶后,發(fā)生了廣泛性瘙癢、紅疹、頭痛等過敏反應(yīng);食用了急宰前3天使用過青霉素的鮮豬內(nèi)后(每克豬肉中含有0.45I的青霉素),病人出現(xiàn)廣泛性紅疹。經(jīng)調(diào)查,病人在以

23、前曾用過青霉素治療。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第33頁，共144頁。四環(huán)素類藥物（主要是金霉素和土霉素）引起的變態(tài)反應(yīng)比青霉素少的多。由四環(huán)素類藥物引起的型變態(tài)反應(yīng)（過敏或蕁麻疹）已見報(bào)道，然而這種病例非常少見。最常見的四環(huán)素不良作用有皮膚損傷和光敏性皮炎,一般認(rèn)為是變態(tài)反應(yīng)。肉中的金霉素殘留不能耐受烹調(diào)溫度,在燒煮過程中轉(zhuǎn)變?yōu)椴痪咧旅糇饔玫漠惤鹈顾亍Ｍ撩顾乜赡苻D(zhuǎn)變?yōu)?和-阿樸氧四環(huán)素。據(jù)報(bào)道,烹調(diào)溫度能使金霉素和土霉素分解,因而認(rèn)為肉中四環(huán)素類藥物殘留對(duì)消費(fèi)者是安全的。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第34頁，共144頁。氨基糖苷類抗生素如鏈霉素、雙氫鏈霉素、新霉素能與特定組織(如腎)中的成分緊密結(jié)合,因

24、而需要30天以上的休藥期才能使藥物從組織中明顯消除。此外,氨基糖苷類抗生素能耐受很高的烹調(diào)溫度。因此,烹調(diào)不能成為一種避免變態(tài)反應(yīng)發(fā)生的有效措施。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第35頁，共144頁。人對(duì)磺胺藥過敏反應(yīng)表現(xiàn)形式不同,而且大多數(shù)與人的治療用藥有關(guān)。皮膚和黏膜上可出現(xiàn)磺胺藥的過敏性損傷,一般真皮損傷的發(fā)生率為1.5%2.0%。在應(yīng)用磺胺藥治療后,可觀察到類似血清病樣的癥狀（白細(xì)胞減少）；藥物熱通常是一種不良作用；磺胺藥的其他不良作用尚有造血系統(tǒng)紊亂,包括急性溶血性貧血、粒細(xì)胞缺乏癥、再生障礙性貧血、血小板減少和嗜酸性細(xì)胞增多等。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第36頁，共144頁。(2)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物

25、的耐藥性細(xì)菌耐藥性是指有些細(xì)菌菌株對(duì)通常能抑制其生長(zhǎng)繁殖的某種濃度的抗菌藥物產(chǎn)生了耐受性。細(xì)菌耐藥性是受染色體或質(zhì)粒上的基因控制。染色體型耐藥性是在抗菌藥物存在或不存在的條件下,由某種細(xì)菌自發(fā)突變產(chǎn)生的,這種情況較少見,而且只對(duì)某一特定的抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。大多數(shù)細(xì)菌的耐藥性屬質(zhì)粒型耐藥性,它由R-質(zhì)?？刂?。R-質(zhì)粒是指細(xì)菌細(xì)胞染色體外的所有遺傳因子,又稱R-因子,即耐藥因子。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第37頁，共144頁。細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生的耐藥性是人們關(guān)注的問題研究表明,隨著抗菌藥物的不斷應(yīng)用,細(xì)菌中的耐藥菌株數(shù)量也在不斷地增加。動(dòng)物在反復(fù)接觸某一種抗菌藥物的情況下,其體內(nèi)的敏感菌受到選擇性的

26、抑制,從而使耐藥菌株大量繁殖。在某些情況下,動(dòng)物體內(nèi)耐藥菌株又可通過動(dòng)物性食品傳播給人,而給臨床上感染性疾病的治療造成困難。雖然一般可采用替代藥品,但在尋找替代藥品的過程中,耐藥菌感染往往會(huì)延誤正常的治療過程,而且替代藥品的毒性可能更高、價(jià)格更貴,或療效更低。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第38頁，共144頁。獸醫(yī)臨床上用作治療藥物的抗菌藥物很多,飼料中也經(jīng)常添加一些抗菌藥物,以改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能。不論已知的抗生素,還是臨床上尚未用作治療藥物的新抗菌藥物,有些人都將其用作飼料藥物添加劑。人們擔(dān)心各種抗生素的應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象,即多種耐藥性,又稱多抗性。由于進(jìn)入食物鏈的各種多抗性細(xì)菌

27、的轉(zhuǎn)移,給人和動(dòng)物帶來了潛在的危害。1968年已有一些學(xué)者提出,只能將非治療用藥物用作飼料藥物添加劑的建議。超級(jí)細(xì)菌第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第39頁，共144頁。美國、英國、法國、日本、前蘇聯(lián)和瑞士等國家生產(chǎn)了一些畜禽專用的抗生素等,采取這些措施的最終目的是為了避免產(chǎn)生多抗性菌株,或者至少使菌株保持對(duì)治療藥物的敏感性。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第40頁，共144頁。(3)特殊毒性作用主要包括:致畸作用、致突變作用、致癌作用和生殖毒性作用等。致畸物:在妊娠關(guān)鍵階段對(duì)胚胎或胎兒產(chǎn)生毒性作用造成先天畸形的藥物或化學(xué)藥品。致突變作用又稱誘變作用。誘變劑(致變物)是指損害細(xì)胞或機(jī)體遺傳成分的化學(xué)物。許多致突變

28、物亦具有致癌活性。例如,人工合成的化學(xué)物質(zhì)多環(huán)烴,以及天然物如黃曲霉毒素及有關(guān)的化合物,既具有致突變作用,又具有致癌作用。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第41頁，共144頁。由于藥物及環(huán)境中的化學(xué)藥品可引起基因突變或染色體畸變而造成對(duì)人群的潛在危害,因此越來越引起人們的關(guān)注。如苯并咪唑類抗蠕蟲藥,通過抑制細(xì)胞活性,可殺滅蠕蟲及其蟲卵,故抗蠕蟲作用范圍廣泛。然而,其抑制細(xì)胞活性的作用使其具有潛在的致突變性和致畸性。許多試驗(yàn)結(jié)果表明,此類藥物不僅對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,而且對(duì)食品動(dòng)物可誘發(fā)各種畸形,并肯定了畸胎生成的一般規(guī)律。以綿羊與牛,大鼠與兔子相比,每一種動(dòng)物均有其特異的種屬敏感性或耐受性。與成年動(dòng)物的急性中毒劑

29、量比較,相當(dāng)?shù)偷膭┝考纯烧T發(fā)畸胎生成。雌性動(dòng)物妊娠的特定時(shí)期(胚胎細(xì)胞分化和胎兒組織形成期)對(duì)致畸物較敏感,也只有在胚胎發(fā)育的特定時(shí)期內(nèi),藥物的致畸作用與其劑量相關(guān)。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第42頁，共144頁。(4)激素(樣)作用大約在30多年前,具性激素樣活性的化合物已作為同化劑用于畜牧業(yè)生產(chǎn),以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng),提高飼料轉(zhuǎn)化率。由于用藥動(dòng)物的腫瘤發(fā)生率有上升的趨勢(shì),因而引起人們對(duì)食用組織中同化劑殘留的關(guān)注。1979年在美國禁用己烯雌酚作為牛、羊以及雞的促生長(zhǎng)劑之后,一些國家也相繼禁止應(yīng)用同化劑,尤其是雌激素同化劑。激素同化劑的法定埋植部位應(yīng)該是屠宰時(shí)廢棄的動(dòng)物組織，如耳根部,因?yàn)槊绹葒乙?guī)定

30、食品動(dòng)物的耳朵在屠宰時(shí)應(yīng)廢棄,而深部肌內(nèi)注射同化劑則屬非法用藥。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第43頁，共144頁。隨著人民生活水平的提高,人們對(duì)動(dòng)物性食品的消費(fèi)量越來越多,也造成了一些現(xiàn)代病如肥胖兒、早熟兒等。兒童的早熟除與生活水平的提高(動(dòng)物性食品攝入量較多)有關(guān)外,也不能不考慮在動(dòng)物性食品中可能會(huì)存在各種來源的性激素;包括在食品中添加激素或不適當(dāng)?shù)剌^大劑量用于養(yǎng)殖業(yè)的人工合成同化性激素。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第44頁，共144頁。(5)一般毒性作用以一般毒性作用較為嚴(yán)重的克侖特羅為例。瘦肉精-克侖特羅對(duì)體內(nèi)物質(zhì)代謝影響較大,可抑制脂肪生成,并促進(jìn)其分解；促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成,減少其降解,從而加速肌肉

31、生長(zhǎng)；還能將體內(nèi)合成脂肪的能量和物質(zhì)用于增加蛋白質(zhì)的合成。由于克侖特羅大量蓄積在動(dòng)物肝臟內(nèi),并在血液中以高濃度存在,如果用克侖特羅作促生長(zhǎng)劑的豬,在宰前沒有休藥期,那么人體在食入100g200g 肝臟或肺臟時(shí),就攝入與治療劑量相當(dāng)?shù)目藖鎏亓_,則很快會(huì)引起心動(dòng)過速、口干、冷汗、肌肉震顫和四肢無力等急性毒性作用。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第45頁，共144頁。四、獸藥殘留的現(xiàn)狀與法規(guī)獸藥殘留主要是由于不合理使用藥物治療動(dòng)物疾病和作為飼料藥物添加劑而引起的。1990年出口日本的1萬噸肉雞,由于檢測(cè)出抗球蟲藥氯羥吡啶的殘留量超標(biāo),要求我國政府銷毀所有產(chǎn)品,給我國造成很大經(jīng)濟(jì)損失。出口到德國的蜂蜜由于農(nóng)藥“

32、殺蟲脒”殘留超標(biāo)而被退貨,接著歐共體、美國、日本也相繼拒絕進(jìn)口我國蜂蜜,使我國蜂蜜在世界市場(chǎng)上的銷售發(fā)生嚴(yán)重因難。1998年4月,從內(nèi)地出口到香港的生豬,其內(nèi)臟食后導(dǎo)致17人中毒。其原因是內(nèi)臟中含有違禁藥“鹽酸克侖特羅”。此外,我國出口的畜禽產(chǎn)品還多次出現(xiàn)安眠酮類、雌性激素、抗生素等藥物殘留超標(biāo)而被取消出口的事件。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第46頁，共144頁。鰻魚養(yǎng)殖和加工是20世紀(jì)90年代以來在我國沿海地區(qū)如廣東、福建、廣西等地區(qū)發(fā)展起來的具有高附加值的“三高”農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè),其規(guī)模和技術(shù)含量在20世紀(jì)90年代中期得到迅速擴(kuò)大和提高。我國的鰻魚及其制品主要銷往日本。日本曾對(duì)我國出口鰻魚進(jìn)行過調(diào)查,發(fā)

33、現(xiàn)抗生素在中國鰻魚養(yǎng)殖中普遍使用,藥物殘留檢出率相當(dāng)高。如果有關(guān)方面不及時(shí)采取有效的控制措施,鰻魚加工企業(yè)、養(yǎng)殖戶、鰻魚飼料加工企業(yè)可能將受到嚴(yán)重的沖擊。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第47頁，共144頁。1995年、1996年,歐盟獸醫(yī)委員會(huì)派員對(duì)我國進(jìn)行了考察和評(píng)估,認(rèn)為我國的獸醫(yī)衛(wèi)生狀況達(dá)不到歐盟的要求,于是做出了從1996年8月1日起,禁止從我國進(jìn)口禽肉的決定。1997年、1998年歐盟又派員來華考察,結(jié)果仍達(dá)不到其要求。目前,我國肉、蛋、奶的出口形勢(shì)仍相當(dāng)嚴(yán)峻。我國已開始重視動(dòng)物性食品中的獸藥殘留問題,制訂了各種獸藥殘留的法律和法規(guī),修訂了動(dòng)物性食品中獸藥殘留最高限量標(biāo)準(zhǔn),并開始建立了全國范

34、圍的獸藥殘留監(jiān)控體系。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第48頁，共144頁。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第49頁，共144頁。第六章 獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第二節(jié) 樣品前處理第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第50頁，共144頁。樣品前處理是指樣品的制備和對(duì)樣品中的待測(cè)組分進(jìn)行提取、凈化、濃縮的過程。樣品前處理的目的是消除基質(zhì)干擾、保護(hù)儀器、提高檢測(cè)方法的靈敏度、選擇性、準(zhǔn)確度、精密度。不同樣品前處理方法的選擇，需要根據(jù)樣品中危害殘留物質(zhì)的特點(diǎn)。殘留分析中的樣品主要是各種食用組織(肌肉、脂肪、肝、腎、皮、血液、蛋、奶及其加工食品)?；铙w檢測(cè)中一般采集血漿、尿液和糞便;屠宰場(chǎng)主要采集某種藥物的靶組織及其他高濃度的樣本,如肝、腎、

35、膽汁、注射部位的組織等。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第51頁，共144頁。食品樣品前處理食品樣品前處理方法的選擇取決于食品危害殘留物質(zhì)分析的特點(diǎn)：(1)基體復(fù)雜,主要有水分、糖類、脂肪、蛋白質(zhì)等。樣品范圍寬,按狀態(tài)分有固態(tài)和液態(tài)。固態(tài)有水果、蔬菜、肉、魚、蛋、家禽、調(diào)味品等碳水化合物食品。液態(tài)有飲料、乳制品等。(2)目標(biāo)化合物檢測(cè)限量越來越嚴(yán)格,如歐盟要求食品中氯霉素檢測(cè)限量要求為0.1g/kg,己烯雌酚要求為0.05g/kg。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第52頁，共144頁。(3)某些殘留危害物質(zhì)在食品樣品中存在的濃度極低,為了防止樣品基體組分的信號(hào)掩蔽痕量被測(cè)物和污染儀器,必須將大多數(shù)基體組成復(fù)雜的樣

36、品進(jìn)行前處理,通過前處理把被測(cè)物質(zhì)從基體中分離出來,經(jīng)過濃縮后再進(jìn)行分析。(4)各目標(biāo)化合物的性質(zhì)如極性、沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性等差異極大。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第53頁，共144頁。(5)可能同時(shí)存在多組分,由于食品中危害殘留物質(zhì)以多組分并存,而且它對(duì)人類健康影響有協(xié)同效應(yīng),例如狄氏劑、DDT等農(nóng)藥與多氯聯(lián)苯共存時(shí),會(huì)使毒性增加一倍。因此,各國十分注重食品中多組分危害殘留物質(zhì)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查,特別對(duì)進(jìn)出口的農(nóng)產(chǎn)品、食品進(jìn)行嚴(yán)格撿驗(yàn)。食品分析中樣品前處理,包括了抽樣、制備和提純。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第54頁，共144頁。一、生物樣品的類型獸藥殘留分析中,最常用的生物樣品是組織樣品,其次是奶、血液和尿液樣品。

37、(1)動(dòng)物組織 肌肉(除去可見的脂肪)中水分約占75%,蛋白質(zhì)(肌漿蛋白、肌原蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白)占19.0%、脂肪(中性脂肪、脂肪酸和磷脂)占2.5%、糖類1.2%,以及一些無機(jī)鹽、維生素和酶類。肌漿蛋白(肌紅蛋白、糖解酶)可溶于水,肌原蛋白(肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白)溶于濃鹽水,膠原蛋白和彈性蛋白(結(jié)締組織)在上述溶劑中均不溶。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第55頁，共144頁。不同種類動(dòng)物的食物構(gòu)成和肌肉的成分,如家禽和牛的肌紅蛋白和脂肪含量存在差異,這些變化會(huì)影響分析方法的回收率或干擾檢測(cè),因此一種動(dòng)物組織的殘留分析方法對(duì)其他動(dòng)物組織樣品不一定適用。例如,用水提取雞肉和牛肉組織中呋喃唑酮,回收

38、率在75%以上;同樣的方法提取豬肌肉樣品,回收率僅為10%,改用25%乙腈提取時(shí)回收率明顯提高,推測(cè)呋喃唑酮與豬肉中某種蛋白質(zhì)結(jié)合較強(qiáng)。肝或腎組織為代謝或排泄器官,殘留物濃度高,消除緩慢,因此常被作為殘留檢測(cè)的靶組織。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第56頁，共144頁。(2)尿樣尿液的主要成分是水、尿素及鹽類。它是一種良好的細(xì)菌培養(yǎng)基,因而需立即冷藏或防腐處理。冷藏條件一般可置4 冰箱內(nèi)。若欲在室溫下保存,應(yīng)在收集尿樣后,立即加入防腐劑。常用的防腐劑有甲苯、氯仿或改變尿液的酸堿性,以抑制細(xì)菌的繁殖。加入的防腐劑是否干擾測(cè)定或與被測(cè)組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng),應(yīng)由實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,以便選取合適的防腐措施。第六章獸藥殘留檢

39、測(cè)技術(shù)第57頁，共144頁。在所有體液樣品中,尿樣最容易獲得,并且樣品量多,內(nèi)含藥物(母體藥物及代謝物)濃度高;正常尿液中僅含微量蛋白質(zhì),不需去蛋白處理。尿中藥物大多呈結(jié)合狀態(tài),主要以葡萄苷酸和硫酸酯結(jié)合物存在,因此無論直接測(cè)定或萃取分離之前,都必須將結(jié)合態(tài)的藥物水解,使藥物游離出來。尿樣pH變化范圍大,分析前需調(diào)節(jié)到一致的pH值。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第58頁，共144頁。(3)血樣血液采集好之后,由于激活了一系列凝血因子,血中的纖維蛋白原形成纖維蛋白,血液逐漸凝固,上層析出澄清的黃色液體稱為血清(serum)。分離血清時(shí),可將凝結(jié)后的血液置離心機(jī)中離心,將上層血清轉(zhuǎn)入另外容器中保存,得到的

40、血清,一般可占全血量的40%左右。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第59頁，共144頁。若采血后立即將血液轉(zhuǎn)入有抗凝劑(常用肝素)的容器中,并輕輕搖勻,則血液不再凝結(jié),放置后血細(xì)胞會(huì)緩緩沉降,12h沉降完全,上層的黃色液體稱為血漿(plasma)。離心使上層血漿與下層血細(xì)胞充分分離,將血漿轉(zhuǎn)移至另一容器內(nèi)供分析。血液通過抗凝獲得的血漿量,一般比血清稍多,接近全血量的50%。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第60頁，共144頁。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第61頁，共144頁。若抗凝血不離心,保持血漿和血細(xì)胞混合在一起,則稱為全血(whole blood)。全血樣品可冷凍貯存或直接供分析。全血樣品放置或自貯存處取出解凍之

41、后,可明顯分為上、下兩層,上層為血漿,下層為血細(xì)胞,但輕微搖動(dòng)即可混勻。血漿和血清的化學(xué)成分與組織液相近,測(cè)定血漿或血清中藥物濃度,比全血更能反映作用部位藥濃的變化,測(cè)定方法一般也可互相通用。因?yàn)閺目鼓苽溲獫{的速度較快,并且分離出的血漿量比血清多,所以應(yīng)用血漿比較方便;若血漿中含有抗凝劑對(duì)測(cè)定有影響,則應(yīng)使用血清樣品。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第62頁，共144頁。通常藥物在血漿中均與血漿蛋白(白蛋白、球蛋白、糖蛋白、脂蛋白)發(fā)生一定程度的結(jié)合,一些藥物甚至蛋白結(jié)合率可達(dá)90%以上。因此在萃取之前,必須將結(jié)合態(tài)的藥物游離出來。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第63頁，共144頁。(4)奶樣牛奶的含水量約

42、87%,蛋白質(zhì)(以酪蛋白為主)為3.3%,脂肪(甘油三酯)為3.7%,糖類(乳糖)為4.7%,以及一些無機(jī)鹽、維生素和酶類(過氧化物酶、脂肪酶等)。奶是一種復(fù)雜的非均相體系。乳脂球的主要成分為乳脂,表面包以由酪蛋白、類脂、酶、無機(jī)鹽和水分構(gòu)成膜,使乳球能穩(wěn)定地懸浮在奶中并保護(hù)內(nèi)部的乳脂免遭脂肪酶的水解,當(dāng)劇烈振蕩時(shí)球膜被破壞,脂肪球即相互黏合析出。奶中還含有大量由酪蛋白或脂蛋白構(gòu)成的膠束體系,當(dāng)酸化或加熱時(shí),膠束結(jié)構(gòu)解體,蛋白質(zhì)沉淀析出。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第64頁，共144頁。非解離性的或極性較低的藥物易由血漿向奶中擴(kuò)散,導(dǎo)致奶中殘留。與血漿樣品類似,奶中的藥物可與蛋白質(zhì)結(jié)合。因此在萃取之

43、前,必須將結(jié)合態(tài)的藥物游離出來。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第65頁，共144頁。(5)蛋禽蛋包括蛋黃和蛋清。蛋黃的含水量約50%、蛋白質(zhì)16.5%、脂肪33%、糖類0.2%,以及一些無機(jī)鹽、維生素和酶類(淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶、肽酶和過氧化氫酶)蛋清含水量達(dá)88%,蛋白質(zhì)10.5%和極少量的碳水化合物和脂肪。與蛋清相比較,蛋黃基本上為疏水性環(huán)境,低極性藥物的殘留較多。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第66頁，共144頁。如果需要分別測(cè)定蛋黃和蛋清中的殘留,最好將剛產(chǎn)出后的蛋分離蛋黃和蛋清,避免藥物由蛋黃向蛋清擴(kuò)散。與尿液類似,蛋成分的pH變化范圍大,分析前需調(diào)節(jié)pH值。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第67頁，共14

44、4頁。二、樣品制備和貯存樣品的制備方法，依據(jù)法規(guī)要求的不同和食品本身特性的差異而不同。有的要以全樣計(jì),有的以脂肪計(jì)。一般來說是取可食部分制備樣品(除非有其他要求)。如對(duì)于肉類有的國家法枧規(guī)定要以脂肪計(jì)算食品安全危害物的量,有的要求以全樣來計(jì)算。對(duì)于原料性的食品, 如蔬菜、水果應(yīng)除去明顯腐爛的葉、漿果等;有皮和核的水果還應(yīng)除去皮和核,堅(jiān)果要去殼;玉米應(yīng)除掉玉米殼和穗軸,蛋要去殼;魚要去頭、尾、翅、鱗、內(nèi)臟和非食用的魚骨。對(duì)于加工食品,一般按照原樣制備實(shí)驗(yàn)室樣品(如濃縮產(chǎn)品、脫水食品)。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第68頁，共144頁。為保證取樣的準(zhǔn)確性、減少污染和便于保存,對(duì)組織樣品宜分取一個(gè)完整解剖

45、部分,如一個(gè)肝葉或一側(cè)完整的腎,小動(dòng)物應(yīng)摘取完整的臟器,并立即密封。樣品被絞碎或勻漿后進(jìn)行縮分。生物樣品采樣后除立即分析外,都需要在適當(dāng)條件下保存,目的是避免被測(cè)組分發(fā)生分解或產(chǎn)生其他化學(xué)變化。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第69頁，共144頁。貯存冷凍保存是最常用的方法,一般冷凍溫度為-20,此時(shí)生物樣品如血漿、尿液和組織樣品均被凍凝,可以終止樣品中酶的活性,又可以貯存樣品。在某些情況下若收集的樣品來不及冷凍處理,可先將其置冰屑中,然后再行冷凍貯存,臨用前再融化并放至室溫后供測(cè)定。目前發(fā)現(xiàn),即使在-20 時(shí),圍繞某些生物大分子(如糖蛋白)周圍的水分子仍具有足夠的勢(shì)能可保持其流動(dòng)性。將影響藥物的穩(wěn)定性

46、。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第70頁，共144頁。對(duì)于一些易代謝的藥物,如磺胺類、聚醚類、同化激素,它們的肝和腎臟樣品不宜長(zhǎng)期存放,理想的冷凍溫度應(yīng)為-40-80 。為防止含酶樣品中被測(cè)組分進(jìn)一步代謝,采樣后必須立即終止酶的活性。常采用的方法有:液氮中快速冷凍、微波照射、勻漿及沉淀、加入酶活性阻斷劑(通常加入氟化鈉)等。某些生物樣品中的藥物易被空氣氧化,如兒茶酚類中的阿樸嗎啡,具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu),易被空氣氧化產(chǎn)生醌類雜質(zhì),若收集的血漿樣品不加抗氧劑直接在-15 冷藏,僅能穩(wěn)定4周;但加入抗壞血酸后,則可穩(wěn)定10周。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第71頁，共144頁。冷凍時(shí),若使用玻璃容器貯存樣品,需注意防止

47、溫度驟降使容器破裂,造成樣品損失或污染。而塑料容器常含有高沸點(diǎn)的增塑劑,可能釋放到樣品中造成污染,而且還會(huì)吸留某些藥物,引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物還會(huì)被玻璃容器表面吸附,影響樣品中藥物的定量回收,因此,必要時(shí)應(yīng)將玻璃容器進(jìn)行硅烷化處理。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第72頁，共144頁。三、樣品均勻化對(duì)于血漿、奶、尿液樣品,可置渦旋混合器上混勻,以免造成測(cè)定誤差。對(duì)于肌肉、組織、糞便等半固體樣品都存在均勻化這一問題。其中肌肉和組織樣品可置勻漿機(jī)中均質(zhì),糞便樣品可加入少量甲醇或其他液體攪勻。同時(shí)還應(yīng)注意取樣的代表性問題。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第73頁，共144頁。四、去蛋白處理生物樣品如肝臟、

48、腎臟、血漿等含有大量的蛋白質(zhì),它們能結(jié)合藥物,因此對(duì)于某些藥物的測(cè)定,必須先將與蛋白結(jié)合的藥物游離之后再作進(jìn)一步處理。為什么要除去蛋白？因?yàn)樯飿悠泛写罅康牡鞍踪|(zhì),蛋白質(zhì)在測(cè)定過程中會(huì)形成泡沫、渾濁或出現(xiàn)沉淀而干擾測(cè)定。蛋白質(zhì)還會(huì)污染儀器或惡化測(cè)定條件,如直接進(jìn)樣用液相色譜分析含蛋白質(zhì)的體液樣品時(shí),蛋白質(zhì)會(huì)沉積在色譜柱上,這不僅影響柱效,而且大大縮短色譜柱的使用壽命。目前已有很多去蛋白方法可供使用,但使用各種方法之前應(yīng)了解該方法是否會(huì)導(dǎo)致生物樣品中的藥物發(fā)生分解或影響藥物的提取等。注意方法選擇第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第74頁，共144頁。通常去蛋白過程是將蛋白質(zhì)變性處理后,把與蛋白結(jié)合的藥物解

49、離出來,離心分離以除去蛋白。通常除蛋白的方法是在含蛋白樣品中加入適當(dāng)?shù)某恋韯┗蜃冃詣?使蛋白質(zhì)脫水而沉淀(如有機(jī)溶劑、中性鹽),有的是由于蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而析出(如一些酸類:三氯醋酸、高氯酸、磷酸、苦味酸),離心后取上清液用于分析。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第75頁，共144頁。1、有機(jī)溶劑沉淀甲醇、乙腈、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有機(jī)溶劑,尤以甲醇和乙腈為最常用。甲醇與蛋白形成絮狀沉淀易于離心分離,得到澄清的上清液;乙腈與蛋白形成致密沉淀,易離心除去,沉淀效率較甲醇高。使用時(shí)應(yīng)加入足量的沉淀劑,通常加入量為樣品體積的1.52倍。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第76頁，共144頁。2、酸性沉淀常用的酸性

50、沉淀劑有三氯醋酸和高氯酸,其他還有鎢酸、鉬酸、磷鎢酸、磷鉬酸和苦味酸等。酸性沉淀劑能同蛋白質(zhì)的陽離子形成不溶鹽而沉淀,必要條件是溶液的pH要低于蛋白的等電點(diǎn)。加入沉淀劑之后立即形成白色沉淀(必要時(shí)可加熱使沉淀完全),離心后可得到澄明的上清液。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第77頁，共144頁。三氯醋酸(常用10%溶液)沉淀蛋白的作用很強(qiáng),因此最常使用,但應(yīng)注意試劑中含有的雜質(zhì),將它們引入離心后的上清液中,可能會(huì)干擾藥物的分析。其次應(yīng)注意,當(dāng)上清液再用乙醚等有機(jī)溶劑萃取時(shí),三氯醋酸則連同溶入其內(nèi)的雜質(zhì)會(huì)進(jìn)入有機(jī)相,也可能干擾藥物的分析。采用高氯酸作為蛋白沉淀劑時(shí),其優(yōu)點(diǎn)是殘留在上清液中的ClO4-可加入

51、鉀鹽除去。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第78頁，共144頁。3、無機(jī)鹽沉淀一些無機(jī)鹽如硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等,能使蛋白質(zhì)膠體脫水并中和其電荷,使蛋白質(zhì)失去膠體性質(zhì)而沉淀下來。無機(jī)鹽中以硫酸銨最常用。常用的重金屬鹽類有汞鹽、銅鹽和鋅鹽等,它們能與蛋白質(zhì)形成不溶鹽而沉淀析出。如可用HgCl2作為蛋白沉淀劑處理血漿樣品,離心后用比色法測(cè)定上清液中的水楊酸濃度。采用蛋白沉淀劑,只要加入足量,一般可除去98%以上的蛋白。蛋白沉淀后是否與之相結(jié)合的藥物能游離釋出,目前尚缺乏系統(tǒng)的研究資料,僅觀察到少數(shù)現(xiàn)象。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第79頁，共144頁。4、透析法透析法與超濾法也是除去樣品中蛋白的方法。透析法很費(fèi)

52、時(shí),溶質(zhì)透過膜的程度與被測(cè)物的性質(zhì)、溫度有關(guān),膜需常常更新,很難自動(dòng)化,因此透析法一般不用于常規(guī)分析,而用于藥物在生物樣品中蛋白結(jié)合率的研究。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第80頁，共144頁。5、超濾法超濾法是另一種除去樣品中蛋白和其他大分子的方法,也是一種薄膜分離技術(shù)。與蛋白沉淀法相比,其優(yōu)點(diǎn)是適用于小量樣品,不稀釋試樣,也不改變?cè)嚇拥膒H,尤其適于含對(duì)酸堿不穩(wěn)定的化合物的樣品,用于樣品的濃縮、脫鹽、不同分子尺寸的分離。如果待測(cè)物易被某種酶分解,那么超濾除去該酶后就避免了待測(cè)物的分解。在殘留分析中超濾法常用于牛奶、血液中游離藥物濃度和藥物-血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定。超濾法的缺點(diǎn)是待測(cè)物可能被結(jié)合在濾膜

53、上而影響回收率,而且一些能與大分子蛋白結(jié)合的藥物也會(huì)隨著蛋白質(zhì)被除去而丟失。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第81頁，共144頁。五、冷凍干燥冷凍干燥是貯存和預(yù)處理某些生物樣品的有效方法,適合于處理量大的樣品。例如,一些樣品中所含藥物水溶性很強(qiáng)(不容易被有機(jī)溶劑萃取),可凍干后再進(jìn)行液-固萃取。凍干法也適用于一些含揮發(fā)性藥物的樣品以及對(duì)熱不穩(wěn)定的樣品。此外,還有一些生物樣品中的藥物需進(jìn)行衍生化,若采用常規(guī)的液-液萃取,在一定溫度下?lián)]發(fā)去有機(jī)溶劑后再進(jìn)行衍生化,則在加熱過程中會(huì)導(dǎo)致藥物分解或隨溶劑一起揮發(fā),因此也宜將這些樣品經(jīng)凍干處理后再行衍生化。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第82頁，共144頁。生物樣品凍干時(shí)

54、,可先將其置干冰-丙酮浴中、液氮中或其他低溫條件下,半固體樣品如糞便、組織等冷凍時(shí)間約110min。冷凍后水分在樣品表面形成“冰殼”,增加了揮發(fā)面積,再將其放入凍干機(jī)內(nèi)減壓,冰則直接升華,和其他揮發(fā)性雜質(zhì)一起被除去,使樣品干燥。凍干后的樣品通?？芍苯蛹尤胗袡C(jī)溶劑萃取。凍干時(shí)應(yīng)注意某些揮發(fā)性強(qiáng)的藥物可能揮發(fā)損失。操作步驟第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第83頁，共144頁。六、結(jié)合物水解以結(jié)合狀態(tài)存在的藥物大多存在于尿中,但也存在于肝臟和血液中。常用的結(jié)合物水解的方法有:(1)酸水解酸水解通常使用無機(jī)酸,如尿樣中結(jié)合物水解可加入適量的鹽酸液。加入鹽酸的濃度、酸化時(shí)間以及是否需要加熱等,隨藥物而異,但最終應(yīng)

55、通過實(shí)驗(yàn)確定。水解后的樣品呈強(qiáng)酸性,必要時(shí)可用堿液調(diào)整pH后再進(jìn)行萃取。藥物在體內(nèi)經(jīng)代謝反應(yīng)之后,形成葡糖苷酸及硫酸酯等結(jié)合物第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第84頁，共144頁。(2)酶水解酶水解是專一性很強(qiáng)的水解結(jié)合物的方法。通常使用的水解酶是-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可專門水解藥物的葡萄糖醛酸苷,后者水解藥物的硫酸酯。也可用兩者的混合物,將生物樣品中藥物的葡萄糖醛酸苷及硫酸酯同時(shí)水解。尿液中通常存在以上兩種結(jié)合物,因此混合酶水解法具有實(shí)用價(jià)值。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第85頁，共144頁。目前已有葡糖苷酸/硫酸酯混合酶可供使用,應(yīng)用時(shí)必須按不同酶試劑的要求,控制一定的pH(一般pH4.57.0

56、),于樣品中加入酶之后,厭氧溫育16h左右。若要分別測(cè)定藥物的葡萄糖醛酸苷和硫酸酯,則應(yīng)分別使用對(duì)應(yīng)的葡糖苷酸酶及芳基硫酸酯酶來進(jìn)行水解。優(yōu)點(diǎn)：與酸水解相比,酶水解反應(yīng)比較溫和,一般不會(huì)引起被測(cè)藥物分解；缺點(diǎn)：酶試劑較貴、水解所需時(shí)間較長(zhǎng),使實(shí)驗(yàn)費(fèi)用增加,此外酶試劑還會(huì)帶入黏液蛋白等雜質(zhì),可能導(dǎo)致樣品乳化或造成色譜柱阻塞。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第86頁，共144頁。(3)溶劑解某些藥物或內(nèi)源化合物的硫酸酯,可隨加入的萃取溶劑,在萃取過程中發(fā)生分解,通常稱為溶劑解。溶劑解也是分解結(jié)合物較溫和的一種方法。例如尿中的甾體激素硫酸酯結(jié)合物,在pH為1條件下加入乙酸乙酯萃取時(shí),則發(fā)生分解,釋放出的甾體激

57、素被萃入乙酸乙酯中。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第87頁，共144頁。七、樣品提取和凈化1、液-液萃取液-液萃取是經(jīng)典的提取方法之一,它基于被測(cè)組分在不相溶的兩種溶劑中的分配。與其他方法相比,液-液萃取法仍是目前最常用的樣品處理方法,其原因是:通過萃取可將被測(cè)組分自大量?jī)?nèi)源性物質(zhì)中分離出來,減少雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾;操作簡(jiǎn)單快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用;可將萃取液蒸發(fā),使組分富集;可一次進(jìn)行同類組分的萃取。提取凈化濃縮色譜分析第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第88頁，共144頁。液-液萃取的溶劑選擇液-液萃取常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、苯、甲苯、正己烷。溶劑選擇應(yīng)注意

58、以下幾點(diǎn):溶劑的極性，根據(jù)相似相溶原理,極性組分易溶于極性溶劑,反之亦然,應(yīng)根據(jù)被測(cè)組分的極性選擇相似極性的溶劑。實(shí)際萃取被測(cè)組分時(shí),還常于萃取溶劑中加人第二種溶劑,以調(diào)整極性,使達(dá)到選擇性萃取。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第89頁，共144頁。溶劑的沸點(diǎn)，萃取分離后的有機(jī)相通常需置溫水浴中通壓縮空氣(或氮?dú)?使揮發(fā),將被測(cè)組分濃集,因此萃取溶劑的沸點(diǎn)就不應(yīng)接近或高于水的沸點(diǎn),否則揮發(fā)困難。溶劑的毒性，使用對(duì)人體有害的溶劑萃取時(shí),應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。在常用溶劑中,乙酸乙酯既安全又無毒,對(duì)不同極性的被測(cè)組分均有較高的萃取回收率,又易于揮發(fā),萃取物中混入的內(nèi)源雜質(zhì)量少,是較理想的首選溶劑。第六章獸藥殘留檢

59、測(cè)技術(shù)第90頁，共144頁。溶劑與水的互溶性有的溶劑如乙醚,萃取后可混入大約1.2%的水分,因此伴隨帶入一些水溶性雜質(zhì)。乙醚萃取能力強(qiáng),又易于揮發(fā)濃縮,為常用萃取溶劑,除去混入水分的方法是加入無水Na2SO4脫水,減少混入的水溶性雜質(zhì)量。萃取時(shí)于水相中加入有機(jī)相后,一般只萃取一次。特殊情況下(如雜質(zhì)不易除去),則必須將第一次萃取分出的含藥有機(jī)相,再用一定pH的水溶液反萃取,最后再從水相將藥物萃回到有機(jī)相中。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第91頁，共144頁。萃取溶劑與水的比例萃取過程中加入的有機(jī)溶劑并非越多越好,而應(yīng)適量。一般有機(jī)相與水相容積比以1:1或2:1為佳,據(jù)被測(cè)組分的性質(zhì)及方法需要,有時(shí)也增

60、加有機(jī)相的比例。另外,萃取時(shí)若往水相中加入少量比重大的有機(jī)溶劑(如氯仿),而該溶劑對(duì)藥物的溶解度又比較大,則可將藥物從水相中濃集于小體積的有機(jī)相中,若萃取時(shí)使用的是尖底試管,則富含藥物的有機(jī)相沉積于管尖部位,可直接取樣分析,或?qū)⑵浞蛛x出來。第六章獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)第92頁，共144頁。離子對(duì)試劑一些酸性或堿性較強(qiáng)的有機(jī)藥物在體液中呈離解狀態(tài),成為親水性極強(qiáng)的帶電荷離子,即使控制pH也不能抑制它們的電離,不能用有機(jī)溶劑將其自體液中提取出來。對(duì)于上述呈離解狀態(tài)的藥物,可加入離子對(duì)試劑,使它們形成具有一定脂溶性的離子對(duì)絡(luò)合物,用有機(jī)溶劑將其從水相中萃取出來。陽離子藥物配對(duì)的離子對(duì)試劑則為陰離子,其中以