醫(yī)檢細胞因子及其受體檢測

1、第二十五章細胞因子及其受體檢測 陶 洪 群1學習要點：生物學檢測方法的種類、原理和技術要點免疫學檢測方法的種類分子生物學檢測方法的種類比較三種細胞因子檢測方法的優(yōu)缺點檢測細胞因子受體的常用方法2細胞因子:是由活化的免疫細胞及某些基質(zhì)細胞表達并分泌的活性物質(zhì)，其主要生物學功能是介導和調(diào)節(jié)免疫應答及炎癥反應，其化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)或多肽。 生物學作用:抗感染和抗腫瘤; 免疫調(diào)節(jié)作用; 刺激造血細胞增殖分化; 參與和調(diào)節(jié)炎癥反應發(fā)揮效應的特點:非特異性;多效性;重疊性;拮抗性; 協(xié)同性;增強性;網(wǎng)絡性3 細胞因子的種類 -六大類（按功能分類）： 白細胞介素（interleukins，ILs） 干擾素(i

2、nterferon，IFN) 腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF） 集落刺激因子(colony- stimulating factor，CSF) 趨化因子（chemokines） 生長因子（growth factor，GF）4細胞因子檢測方法生物學檢測法免疫學檢測法 臨床上最常用分子生物學檢測法5第一節(jié) 生物學檢測法基本原理:結果以活性單位(U/ml)表示6 原理:利用某一細胞因子可促進相應指示細胞分裂、增殖,將不同濃度的細胞因子（標準品或待測樣品）與指示細胞共同孵育一定的時間，檢測細胞的增殖情況，從而估計細胞因子的活性水平。一、細胞增殖法白細胞介素的測定7指示細

3、胞：短期培養(yǎng)細胞；依賴細胞株（系）；依賴細胞株是指人們?yōu)闄z測某一種細胞因子而篩選的，該細胞株的分裂增殖只依賴于某一種細胞因子的存在，并在一定濃度范圍內(nèi)與細胞增殖程度呈正相關。若培養(yǎng)基中缺乏這種細胞因子，依賴株則不能存活。 IL-2指示細胞：CTLL（小鼠殺傷性T細胞系） 指示細胞8技術要點 依賴細胞株的準備 細胞因子作用于依賴細胞株 測定細胞增殖程度 細胞因子活性單位的計算 細胞因子的生物活性單位是指使相應細胞達到最大程度增殖的50時所需細胞因子的含量為一個活性單位 。 待測樣品50最大程度增殖的稀釋度 細胞因子活性（U/ml） 標準品的細胞因子活性單位 標準品50最大程度增殖的稀釋度9直接計

4、數(shù)法 簡便、直觀,但費時、主觀因素影響大、難以標準化和自動化 3H-TdR摻入法 通過細胞DNA合成的增加間接判斷 MTT比色法 以細胞的代謝物作為細胞增殖指示物間接判斷 代謝產(chǎn)物可被二甲基亞砜或酸化的異丙醇所溶解而顯色，測定波長為570nm，參考波長為630nm。細胞增殖檢測方法10 IL-2依賴的CTLL用10FCS-RPMI1640洗滌2次， 每次1000rpm, 5min, 除去原培養(yǎng)液中的IL-2 調(diào)整活細胞數(shù)110ml 96孔平底培養(yǎng)板中每孔加入100l不同稀釋度標準IL-2和待測樣品 每孔加100l CTLL懸液 37CO2孵箱，培養(yǎng)1824h 每孔加H-TdR 4-6h 用細胞

5、收集儀收獲于玻璃纖維紙上 于液閃儀中測射線的cpm值 IL-2生物活性的測定 11 基本原理：對指示細胞具有破壞作用的細胞因子，若與細胞共育將會導致細胞死亡(細胞毒性反應)。因此，待測細胞因子作一系列稀釋后加至指示細胞培養(yǎng)體系，以檢測培養(yǎng)細胞的死細胞數(shù)作為判斷指標，死細胞數(shù)量與細胞因子的活性呈正比。二、靶細胞殺傷或抑制法主要用于腫瘤壞死因子（TNF）的生物活性測定 TNF敏感株：小鼠成纖維細胞株L929和WEHI 164.13 12技術要點靶細胞的準備 TNF作用于靶細胞 細胞毒性反應程度測定 TNF活性計算 導致50%細胞死亡的樣品最大稀釋度TNF活性單位（U/ml） 標準品TNF活性單位

6、導致50%細胞死亡的標準品最大稀釋度13細胞毒反應程度測定：檢測死亡的細胞:51Cr釋放法、臺盼蘭染色檢測剩余活細胞的數(shù)量間接判斷 3H-TdR摻入法、MTT比色法、 結晶紫染色法:活細胞染色而死細胞不著色， 檸檬酸鈉緩沖液脫色，測A570nm14取對數(shù)生長期的L929細胞，以001胰蛋白酶消化用培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至2105mL。培養(yǎng)板中每孔加入100L細胞懸液，置37，5C02溫箱孵育24h。 每孔分別加入100L稀釋樣品或標準品 各孔加入10L放線菌素D，371214h。 離心棄上清，并用PBS洗細胞一次。 每孔加入025結晶紫 100uL，室溫下染色10min。 離心棄上清，用PBS洗一

7、次。 室溫下晾干，每孔加入100uL檸檬酸鈉緩沖液 570nm波長下測OD值。 TNF生物學活性測定15常用于IFN等的測定，IFN可誘導細胞產(chǎn)生抑制病毒RNA和DNA合成的酶，保護細胞不受病毒感染從而抑制細胞病變。三、細胞病變抑制法Wish、Hep2 人干擾素L929 小鼠干擾素A549 大鼠干擾素MDBK 多種屬的IFN-和IFN-VSV、EMCV等常用于檢測抗病毒活性的細胞株常用于攻擊細胞的病毒最常用的檢測系統(tǒng)： Wish細胞-VSV16 96孔培養(yǎng)板中加入不同稀釋度的IFN和標準IFN， 每孔50l，病毒對照不加IFN 每孔加入100l 1.5210 ml Wish 或Hep-2細胞懸

8、液， 孵箱培養(yǎng)612h， 每孔加入VSV, 細胞對照不加病毒液 終止培養(yǎng)前34h加入5mgml MTT, 15L孔 加入適量生理鹽水，用滴管輕輕吹吸棄去懸浮病變細胞和死細胞 200l孔 二甲亞砜，作用10min 測OD(570nm),表示活細胞中含甲臜的量， 測定IFN對活細胞的保護水平 IFN的生物學活性測定17四、趨化活性測定法 IL-8、IL-16、MCP（單核細胞趨化蛋白）的生物活性測定Boyden 小室法 18優(yōu)點生物學活性的測定靈敏度高不需商品化試劑盒，成本低缺點特異性差操作繁瑣易受干擾五、生物學檢測法的評價19第二節(jié) 免疫學檢測法 ELISA 首選方法 放射免疫分析 流式細胞分析

9、法酶聯(lián)免疫斑點實驗可溶性細胞因子細胞內(nèi)細胞因子20免疫學檢測法的評價缺點：測定的是細胞因子的蛋白含量，與生物活性不一定呈正相關，有時與臨床癥狀不一致。不同來源親和力的單抗對同一標本測定結果可能不同敏感度不如生物學測定法標本中存在的細胞因子受體、細胞因子結合蛋白有干擾優(yōu)點： 特異性高 操作簡便、快速，無需依賴細胞株 影響因素較少且易控制，重復性好，方法容易標準化21第三節(jié) 分子生物學檢測 細胞因子的DNA檢測 Southern印跡雜交 斑點印跡雜交 聚合酶鏈反應（PCR） 原位雜交和原位PCR 22細胞因子mRNA表達的測定 原位雜交RT-PCR原位RT-PCR 23分子生物學檢測方法的評價 可對細胞因子的基因突變、缺失、重排及染色體易位等進行檢測。原位雜交和原位PCR，可分析病理情況下何種細胞中細胞因子的基因發(fā)生異常，揭示細胞中細胞因子基因特定改變及其表達，究竟發(fā)生在細胞增殖的哪個階段。 技術復雜 ,實驗室條件要求嚴格 24第四節(jié) 細胞因子受體檢測技術膜結合受體的測定可溶性受體的測定25細胞因子測定的臨床