氧化應(yīng)激損傷的生物化學(xué)診斷課件

1、廣東醫(yī)學(xué)院檢驗學(xué)院劉新光第二十三章 氧化應(yīng)激損傷的生物化學(xué)診斷全國高等醫(yī)藥院校醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)規(guī)劃教材 臨床生物化學(xué)檢驗 （第二版）教學(xué)目標(biāo)與要求 掌握：自由基、活性氧、氧化應(yīng)激、歧化反應(yīng)的概念及脂質(zhì)過氧化作用。氧化應(yīng)激指標(biāo)的種類。 熟悉：氧化應(yīng)激的損傷效應(yīng)；主要活性氧、過氧化脂質(zhì)、抗氧化酶、NO與NOS以及常用抗氧化劑的常用檢測方法的原理及方法學(xué)評價。 了解：心肌缺血再灌注、衰老的概念；氧化應(yīng)激的原因，抗氧化損傷的防御系統(tǒng)組成與作用。2目錄 氧化應(yīng)激的生物化學(xué)基礎(chǔ) 1氧化應(yīng)激的生物學(xué)效應(yīng) 2抗氧化應(yīng)激損傷的防御系統(tǒng)3氧化應(yīng)激與臨床疾病的關(guān)系4氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測方法及評價5小結(jié)與展望6返回總目錄3

2、第一節(jié) 氧化應(yīng)激的生物化學(xué)基礎(chǔ) 一、氧化應(yīng)激的概念 氧化應(yīng)激（oxidative stress, OS）是指多種原因致使體內(nèi)的活性氧(ROS ) 、活性氮(RNS ) 等相關(guān)物質(zhì)產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致分子、細(xì)胞和機體的損傷。 4活性氧(reactive oxygen species, ROS ) 如：超氧陰離子( O2 )、過氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧（1O2）、氫過氧化物（ROOH） 氧自由基（oxygen radical）活性氮( reactive nitrogen species, RNS ) 如：一氧化氮（NO）、過氧亞硝酸根（ONOO

3、） 5(一)外源性因素1電離輻射及大氣污染 和X射線等 ；2藥物 解熱鎮(zhèn)痛藥、抗結(jié)核藥； 3其他 環(huán)境污染的鎘、水銀、鉛等重金屬離子 。二、氧化應(yīng)激產(chǎn)生的原因6(二)內(nèi)源性因素1O2 的產(chǎn)生 2OH的產(chǎn)生3吞噬細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生 4脂質(zhì)過氧化作用 71. O2的產(chǎn)生 SQ +O2 Q +O2 通過線粒體的輔酶Q半醌、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上細(xì)胞色素P450和Hb、肌紅蛋白、腎上腺素等自氧化作用均可產(chǎn)生O2 8黃嘌呤氧化酶黃嘌呤2O2H2O 尿酸2O2 2H+ 酶促氧化過程中均可產(chǎn)生O2 胞液中的黃嘌呤氧化酶與醛氧化酶 線粒體中的黃素蛋白酶 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶 質(zhì)膜上的NADPH氧化

4、酶等92OH的產(chǎn)生O2 + O2 + 2H+ H2O2+O2 (歧化反應(yīng)) 過渡金屬離子O2H2O2 O2OHOH(Fenton反應(yīng))主要是通過Fenton反應(yīng)由O2 直接衍生形成： 歧化反應(yīng)是指反應(yīng)中的某種底物既能作為還原劑供應(yīng)電子，又可作為氧化劑接受電子。上述反應(yīng)中的O2 就承擔(dān)這種角色，故屬于歧化反應(yīng)。10 過氧化物酶體中多種需氧脫氫酶催化生成的H2O2，如不迅速被分解，在Fe2+的催化下也可生OH。 H2O2Fe2+H+ OHH2OFe3+11 3吞噬細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生 H2O2除可生成OH外，在Cl存在時，經(jīng)髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的作用，生成活性很強

5、的次氯酸(HOCl)和1O2，1O2是一個強的親電子性的氧化劑。MPOH2O2Cl H2OOClOClH2O2 H2O1O2ClMPO124脂質(zhì)過氧化作用 (lipid peroxidation) 在過氧化條件下，脂過氧化物 LOOH是不穩(wěn)定的，能分解成一系列復(fù)雜產(chǎn)物。通常以小分子降解產(chǎn)物的數(shù)量來表示脂質(zhì)過氧化的程度。定義：機體產(chǎn)生的活性氧，攻擊生物膜磷脂中的多聚不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)引發(fā)一種自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，鏈?zhǔn)降禺a(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，這種作用就稱。返回章目錄13一、氧化應(yīng)激對機體的生理作用第二節(jié) 氧化應(yīng)激的生物學(xué)效應(yīng)(一) 吞噬細(xì)胞殺滅外

6、來病原微生物 吞噬作用所產(chǎn)生的活性氧如H2O2、O2 、OH、1O2和HOCl等可用來殺滅外來病原微生物。14 合成凝血酶原時，凝血酶原前體的羧化過程需要O2 和CO2反應(yīng)形成的“活性碳”。(二) 參與合成某些重要的生物活性物質(zhì) 合成前列腺素時需要H2O2 和O2 的參與。 參與第二信使cAMP和cGMP的激活等過程。15 氨基酸的氧化脫氨作用需自由基的參與； 核糖核苷的還原過程需自由基的參與。(三) 參與許多酶促反應(yīng) 羥脯氨酸、羥賴氨酸的酶促羥化作用需要O2，OH，H2O2或1O2的參與；(四) 參與解毒作用 外來物質(zhì)通過細(xì)胞色素P450的羥化作用達(dá)到解毒作用，O2 參與了羥化作用。 16

7、自由基參與一系列的連鎖反應(yīng)，能引起細(xì)胞生物膜上的脂質(zhì)過氧化，引起細(xì)胞損傷。其機制比較復(fù)雜，主要有三方面：膜脂改變導(dǎo)致膜功能的障礙和膜酶的損傷；脂質(zhì)過氧化過程中生成的活性氧對酶和其他成分的損傷；LOOH的分解產(chǎn)物特別是醛類產(chǎn)物對細(xì)胞及其成分的毒性作用。 二、氧化應(yīng)激對機體的損害效應(yīng)17(一) 氧化應(yīng)激對脂類和細(xì)胞膜的破壞膜內(nèi)不飽和脂肪酸減少；膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，使其流動性、通透性、離子轉(zhuǎn)運及屏障功能受損；溶酶體酶釋放，線粒粒膨脹、酶失活等損傷；紅細(xì)胞膜破裂導(dǎo)致溶血；LOOH進(jìn)一步分解產(chǎn)生醛類，尤其是丙二醛(MDA)可作為交聯(lián)劑導(dǎo)致分子間的交聯(lián)聚合。 胞膜的損害則會導(dǎo)致細(xì)胞代謝、功能和結(jié)構(gòu)的改變，后者

8、是許多疾病的病理基礎(chǔ)，從而可引起許多病變。18(二) 氧化應(yīng)激對蛋白質(zhì)和酶的損害 直接作用于蛋白質(zhì)（Pr） ，與最鄰近的氨基酸（AA）發(fā)生Pr過氧化；通過LOOH間接作用于Pr，使多肽鏈斷裂或與個別AA發(fā)生氧化或使Pr交聯(lián)，從而使Pr的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂。 19 脂質(zhì)過氧化、電離輻射、其他產(chǎn)生的自由基的反應(yīng) 可通過多種途徑影響酶活性: 通過自由基鏈反應(yīng)，使酶分子發(fā)生聚合； 通過LOOH中的MDA使酶分子發(fā)生交聯(lián)； 通過破壞酶分子中AA以及與酶分子中的金屬離子反應(yīng)。20使DNA鏈斷裂或堿基破壞、缺失，使核酸分子的完整性和構(gòu)型受到破壞，造成遺傳信息改變；(三) 氧化應(yīng)激對核酸和染色體的

9、損害 自由基對DNA的破壞可導(dǎo)致染色體變異；電離輻射和化學(xué)物質(zhì)使受損細(xì)胞的染色體斷裂。 輻射作用于核酸環(huán)境中的水分子，使其電解產(chǎn)生OH和 O2，輻射可使DNA主鏈斷裂、堿基降解和氫鍵破壞 ；21(四) 氧化應(yīng)激對糖分子的損害 使核糖、脫氧核糖形成脫氫自由基，從而造成DNA主鏈斷裂或堿基破壞；使細(xì)胞膜中的糖分子羥基化，破壞細(xì)胞膜上的多糖結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞功能的發(fā)揮；通過氧化降解使多糖破壞，影響組織功能。 脂類、蛋白質(zhì)、核酸、糖類一旦受損，生命活動將受到威脅，導(dǎo)致細(xì)胞受損，機體患病，如動脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤、胃腸道功能失調(diào)、感染、免疫失調(diào)等。 返回章目錄22一、抗氧化酶類 第三節(jié) 抗氧化應(yīng)激損傷的

10、防御系統(tǒng) 超氧化物歧化酶（SOD）過氧化氫酶（CAT）硒谷胱甘肽過氧化物酶（SeGSHPx）谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）與抗氧化作用相關(guān)的其他酶（如醛酮還原酶） 23超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) SOD是金屬酶，包括三種同工酶 CuZn-SOD 在真核細(xì)胞胞液中，以Cu2+-Zn2+為輔基 Mn-SOD 在原核和真核細(xì)胞的線粒體中，以Mn2+為輔基 Fe-SOD 在原核細(xì)胞中，以Fe3+為輔基SOD2O2 + 2H+ H2O2+O2（歧化反應(yīng) ）242. 過氧化氫酶(catalase, CAT)CAT2H2O2 H2O+O2 可清除O2的歧化產(chǎn)物H2O2

11、253. 硒谷胱甘肽過氧化物酶(selenium dependent glutathione peroxidase, SeGSHPx) 還發(fā)現(xiàn)一新的硒酶：PHGSHPx ，稱磷脂氫過氧化物谷胱甘 肽過氧化物酶，能清除生物膜上的磷脂氫過氧化物，防止生 物膜的脂質(zhì)過氧化 PHGSHPx是單體酶 SeGSHPx是由4個相同亞基構(gòu)成的寡聚酶LOOH(H2O2)2GSH LOH(H2O)+H2OGSSGSeGSHPx可清除LOOH或H2O2，抑制自由基的生成 26 如醛酮還原酶，可催化脂肪醛和脂肪醛-谷胱甘肽加成物的還原，以清除脂質(zhì)過氧化作用的毒性產(chǎn)物。4谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-t

12、ransferase, GST) 屬不含硒的谷胱甘肽過氧化物酶，只清除 LOOH，而不能清除H2O2。LOOH2GSH LOHH2OGSSGGST5與抗氧化作用相關(guān)的其他酶27脂溶性抗氧化劑水溶性小分子抗氧化劑 蛋白性抗氧化劑 二、抗氧化劑 28 1. 維生素E 清除O2、OH、脂過氧基 LOO及1O2，防止脂質(zhì)過氧化。 2. -胡蘿卜素 清除1O2、LOO、O2 、及OH，防止脂質(zhì)過氧化。3. 輔酶Q 既參與自由基的生成也具有抗氧化作用， CoQH2較氧化型的抗氧化作用強。4. 固醇類激素 雌激素可能與結(jié)構(gòu)中的酚基相關(guān)，但大劑量可生成O2 ，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。 (一) 脂溶性抗氧化劑 29 VC

13、還可與維生素E自由基 ( VE )反應(yīng)，使其恢復(fù)為還原型維生素E，而本身變成VC，后者可由依賴于NADH的氧化還原酶系統(tǒng)還原成VC。VC與VE兩者有協(xié)同作用。 因此VC的總效果與其濃度有關(guān)。 VC的不利作用：將Fe3+還原成Fe2+，H2O2存在時，可通過Fenton反應(yīng)形成OH；但它又可清除OH。維生素C(又稱抗壞血酸) 能直接與OH、O2 和1O2 作用，是機體重要的活性氧清除劑。 (二) 水溶性小分子抗氧化劑 30 H2O22GSH GSSG2H2O LOOHGSH GSSGLOHH2O OHGSH H2OGS 2GS GSSG4. 色氨酸代謝產(chǎn)物 3-羥犬尿酸，黃尿酸和3-羥鄰氨基苯甲

14、酸等均含有酚羥基，抑制脂質(zhì)過氧化作用。 2. 谷胱甘肽(GSH) 為H2O2、LOOH、OH和1O2重要清除劑。 3. 尿酸 清除1O2和OH，抑制脂質(zhì)過氧化。311. 銅藍(lán)蛋白具有亞鐵氧化酶活性，能催化Fe2+氧化成Fe3+，抑制由Fe2+催化H2O2生成OH的反應(yīng)，從而防止OH引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用。 銅藍(lán)蛋白還是吞噬細(xì)胞呼吸爆炸生成的氧代謝產(chǎn)物O2和OCl的主要清除劑。 (三) 蛋白性抗氧化劑 322. 清蛋白結(jié)合的膽紅素 有效地清除1O2、O2 和LOO。 保護(hù)與清蛋白結(jié)合的不飽和脂肪酸和清蛋白本身 免受活性氧損傷。 腸道的抗氧化劑，保護(hù)維生素A和不飽和脂肪酸 免受氧化破壞。 膽紅素在m

15、ol/L濃度時即能保護(hù)血漿蛋白免受 過氧亞硝酸致的氧化修飾，或通過清除自由基減輕 血漿蛋白損傷。333. 其他血漿蛋白 清蛋白可結(jié)合銅離子抑制OH形成和有效清除OCl 。 結(jié)合珠蛋白和血液結(jié)合素(hemopexin)能與Hb結(jié)合， 促使Hb由受損組織和炎癥局部排出，以減輕Hb對組織 的損傷作用。 轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白，對鐵催化的脂質(zhì)過氧化作用是強 氧化劑。轉(zhuǎn)鐵蛋白還能清除OCl 。上述抗氧化酶與抗氧化劑均屬于機體的抗氧化防御系統(tǒng)342. 二甲亞砜及甘露醇 兩者均有清除OH的作用。二甲亞砜近來已用于抗腦水腫。1. 別嘌呤醇 黃嘌呤氧化酶的抑制劑，能降低O2 的生成，是心肌缺血再灌注氧自由基抑制劑，

16、但只有在灌注前用藥，才能收到明顯效果。 (四) 近年來發(fā)現(xiàn)的抗氧化劑 354. 白細(xì)胞功能抑制劑 前列環(huán)素(PGI2)是血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的花生四烯酸主要代謝物，能抑制血小板聚集，保護(hù)冠狀動脈。它還能抑制中性粒細(xì)胞激活，減少自由基生成。 (四) 近年來發(fā)現(xiàn)的抗氧化劑 3. 鈣拮抗劑 尼可地平、硝苯啶、維拉帕米和硫氮卓銅等有保護(hù)細(xì)胞和升高GSH的作用。365. N-乙酰半胱氨酸 它本身是抗氧化劑，而且還是胞內(nèi)合成GSH的原料。6. 普羅布可(Probucol) 是一種很強的脂溶性抗氧化劑或自由基清除劑, 該藥有延緩泡沫細(xì)胞發(fā)生的的能力，可用于AS的輔助治療。 (四) 近年來發(fā)現(xiàn)的抗氧化劑 返回章目

17、錄37一、氧化應(yīng)激與心血管疾病第四節(jié) 氧化應(yīng)激與臨床疾病的關(guān)系動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS) AS的發(fā)病機制尚未明了。脂肪浸潤、血小板聚集、血栓形成和克隆等多種學(xué)說從不同角度闡明了其發(fā)病機制。近年來自由基與LOOH在AS發(fā)病機制中的作用受到普遍關(guān)注。高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙等易患因素均可增加細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷，促進(jìn)AS形成。(一)氧化應(yīng)激與動脈粥樣硬化38自由基和LOOH可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)腫脹和破損，導(dǎo)致動脈硬化發(fā)生。LDL受到自由基作用，形成過氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)，大量沉積于EC，最終形成AS。Ox-LDL可導(dǎo)致血小板聚集，促使自由基大量產(chǎn)生

18、，從而加速AS發(fā)展。氧化應(yīng)激與LOOH在AS發(fā)病機制中的作用： 39近年研究進(jìn)展： AS的發(fā)生與OH和次氯酸致的蛋白氧化修飾存在相關(guān)性 AS病灶中EC、平滑肌細(xì)胞(SMC)及單核細(xì)胞的SiS基因表達(dá) 氧化應(yīng)激刺激血管SMC的增殖，參與了原癌基因的激活及異常表達(dá)從基因水平揭示:氧化應(yīng)激與AS之間的密切關(guān)系40 (二) 氧化應(yīng)激與心肌缺血再灌注損傷 缺血再灌注損傷 在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，組織器官的損傷反而加重的現(xiàn)象。 目前心肌缺血再灌注損傷的確切機制仍不明了, 與自由基作用有關(guān)的機制有: 脂質(zhì)過氧化 細(xì)胞內(nèi)鈣超載 細(xì)胞成分間的交聯(lián) PGI2/TXA2失調(diào), 微循環(huán)障礙 TXA2：血栓素A2（

19、thromboxane A2）41氧化應(yīng)激致癌與促癌機制： 1. 氧化應(yīng)激對DNA的作用 2. 氧化應(yīng)激對蛋白質(zhì)的作用3. 氧化應(yīng)激對脂質(zhì)的作用4. 基因損傷與致癌、促癌的關(guān)系 421. 氧化應(yīng)激對DNA的作用 電離輻射可直接作用于DNA，產(chǎn)生自由基；電離輻射也可間接產(chǎn)生羥基DNA自由基；在有氧條件下DNA自由基與氧作用成為過氧由基；這些自由基是造成DNA鏈斷裂的原因。43 主要是修飾氨基酸殘基，引起結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的改變，造成肽鍵斷裂，聚合和交聯(lián)，造成細(xì)胞選擇性生長和改變基因表達(dá)。 2. 氧化應(yīng)激對蛋白質(zhì)的作用44 3. 氧化應(yīng)激對脂質(zhì)的作用 氧化應(yīng)激不但可通過生物膜中的PUFA的過氧化引起細(xì)胞損

20、傷，而且還可通過LOOH的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞的損傷。 45 4. 基因損傷與致癌、促癌的關(guān)系 致癌物和促癌物均可造成基因損傷。 基因損傷主要為DNA單鏈或雙鏈的斷裂，重排 或堿基修飾。 化學(xué)致癌物的最終致癌形成包括某些自由基可 選擇性作用于DNA的核苷酸而激活原癌基因。46 它是生物體隨著增齡而發(fā)生的退行性變化的總和，表現(xiàn)為機體功能活動的進(jìn)行性下降，機體維持內(nèi)環(huán)境恒定和對環(huán)境的適應(yīng)能力逐漸降低。 人的生命周期中有一個隨時間進(jìn)展而表現(xiàn)出不斷惡化，直到死亡的過程，老年醫(yī)學(xué)將該過程稱為衰老(aging 或 senscence)。 三 氧化應(yīng)激與衰老 471956年 Harman的衰老的自由基學(xué)說：機制

21、：隨著年齡增長，體內(nèi)有大量過剩的自由基積累。 過多的自由基引發(fā)胞膜脂質(zhì)氧化，其產(chǎn)物MDA造成細(xì)胞內(nèi)核酸變性及功能障礙。 脂褐素(lipofuscin) 是衰老的基本特征 脂褐素的形成涉及脂質(zhì)過氧化 體內(nèi)過量的自由基及其所誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)長期使細(xì)胞受到損害，導(dǎo)致人體衰老和死亡。 481978年Zs-Nagy提出的衰老膜學(xué)說(the membrane hypothesis of aging, MHA) 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)交聯(lián)以及質(zhì)膜上所產(chǎn)生的殘熱可引起胞膜物理-化學(xué)特性的改變，且這種改變是通過隨著年齡的增長而變化，從而使整個細(xì)胞產(chǎn)生退行性變化。491972年Harman又提出線粒體衰老概念20

22、世紀(jì)80年代Miquel和Fleming提出了“衰老的氧自由基線粒體損傷”的二階段學(xué)說1990年Bandy等闡明線粒體DNA突變可增加線粒體內(nèi)氧應(yīng)激水平由此引發(fā)衰老的出現(xiàn)1992年Wallace等提出氧化磷酸水平下降與衰老和退行性病變，如阿爾茨海默氏病(AD, 亦稱早老性癡呆)與帕金森病等有關(guān)。返回章目錄50第五節(jié) 氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測方法及評價 一、主要活性氧的檢測二、一氧化氮與一氧化氮合酶的測定三、抗氧化酶活性的檢測四、常用抗氧化劑的測定五、氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物檢測 51(二) OH檢測 (三) H2O2的檢測 (一) O2 的檢測 一、主要活性氧的檢測 52NBT還原法高鐵細(xì)胞色素C還原法

23、羥胺氧化法較為常用1. 物理檢測方法(一) O2 的檢測 電子自旋共振(ESR)波譜分析法直接法 電子順磁共振(EPR)波譜分析法間接法優(yōu)點：操作均較簡單缺點：需昂貴的儀器，應(yīng)用均受到限制2. 化學(xué)檢測方法間接法53一種較靈敏檢測O2的方法，其檢測限量可達(dá)1g/L。具有設(shè)備簡單，試劑便宜易購，操作簡便，專一性好，結(jié)果較為準(zhǔn)確等優(yōu)點，適合于一般實驗室的檢測。羥胺氧化法 O2 能與羥胺溶液反應(yīng)生成NO2，NO2與對氨基苯磺酸和-萘胺顯色，在波長530nm處有專一吸收峰，其顏色深淺與產(chǎn)生的O2 呈量效關(guān)系?！痉椒▽W(xué)評價】【注意事項】嚴(yán)格控制反應(yīng)系統(tǒng)pH8.0，盡可能降低反應(yīng)中的溶解氧及鐵含量，這樣測

24、出的O2 產(chǎn)生速率才更接近實際水平。54(二) OH檢測 原理是無熒光的對苯二甲酸與OH反應(yīng)形成強熒光的羥-對苯二甲酸加成物，315nm激發(fā)，可發(fā)射425nm熒光，可檢測受物理因素及化學(xué)因素處理后水溶液中產(chǎn)生的OH。 自旋捕捉法 氣相色譜法(GC) 高效液相色譜(HPLC)優(yōu)點：準(zhǔn)確度較高 缺點：操作繁瑣，儀器 昂貴，不便推廣優(yōu)點：操作簡便，測定快速，靈敏度 較高，穩(wěn)定性較好。缺點：特異性不太高，需化學(xué)發(fā)光儀分光光度法熒光分析法方法簡便，易為一般實驗室采用 化學(xué)發(fā)光法55 【原理】利用H2O2/Fe2+體系通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的OH，使鄰二氮菲-Fe2+在536nm處的最大吸收峰消失，根據(jù)

25、反應(yīng)前后A536下降值進(jìn)行計算。分光光度法 溴鄰苯三酚紅光度法【原理】利用H2O2/Fe2+體系通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的OH與溴鄰苯三酚紅形成有560nm處吸收峰的有色化合物，根據(jù)反應(yīng)前后A560的升高值進(jìn)行計算。 鄰二氮菲-Fe2+氧化法 細(xì)胞色素C氧化法 水楊酸比色法這兩種方法穩(wěn)定性好、操作簡便、測定快速。56(三) H2O2的檢測 碘滴定法分光光度法化學(xué)發(fā)光法熒光法通過測定CAT和過氧化物酶的活性也可估測H2O2的水平H2O2是最穩(wěn)定的活性氧檢測方法: 571. 分光光度法過氧化物酶-氧化酶法Fe2+-鄰二氮菲分光光法 碘化鉀比色法58碘化鉀比色法 快速、簡便、重復(fù)性好，適合于溶液中m

26、ol/L水平的日常測定。 【原理】 H2O2+KII2鉬酸銨藍(lán)色化合物 淀粉 【方法學(xué)評價】 59過氧化物酶-氧化酶法 經(jīng)典的比色法，整個反應(yīng)過程約20min，是一種操作簡便、靈敏度較高(可達(dá)10-9mol/L水平)的方法。 【原理】 在弱酸性環(huán)境下，過氧化物酶-氧化酶反應(yīng)中的NADH往往被完全消耗。 而在較高pH值環(huán)境下，NADH至少在反應(yīng)的開始階段并不完全被消耗，測定A340下降值, 計算NADH被消耗量。 【方法學(xué)評價】 602. NADPH氧化法 兩方法靈敏度均較高。 前者無需制作H2O2的校正曲線，操作簡便， 適用于大批量樣品的同時測定。 后者適用于生物反應(yīng)體系中微量H2O2測定。

27、【原理】測定體系中NADPH的氧化與H2O2的含量成正比 GSH-NADPH氧化法 Scopoletin-NADPH氧化法 【方法學(xué)評價】 61二、一氧化氮與一氧化氮合酶的測定 (一) 一氧化氮(NO)測定 NO含量少，且極不穩(wěn)定, 較難直接測定其含量。常用測定NO含量的方法多利用NO的化學(xué)性質(zhì)，測定其終末產(chǎn)物NO3和(或)NO2的含量來反映組織細(xì)胞NO的含量。 物理方法有微電極法和EPR法，優(yōu)點是靈敏度較高，可實時檢測，但需昂貴儀器限制了應(yīng)用?；瘜W(xué)方法有Griess試劑法、硝酸鹽還原酶法、熒光分光光度法、催化光度法、化學(xué)發(fā)光法，其中以Griess試劑法最為常用。621. Griess試劑法：

28、 A550與NO2或NO的產(chǎn)量成正比，據(jù)此測定 NO2 +對氨基苯磺酸 重氮化合物 pH7.58.1 重氮化合物+N-(1-萘基)-乙二胺 紫紅色產(chǎn)物 偶聯(lián) 550nm 本法稍加修改即可用于測定樣品中的總硝酸鹽含量(NO3與NO2濃度之和)。 (一) 一氧化氮(NO)測定 63加合物+N-(1-萘基)-乙二胺 Griess反應(yīng) NO3 NO2 銅離子活化鎘NO2 +對氨基苯磺酸 加合產(chǎn)物 H+ 測A550nm，即可求出NO2 測NO3時可將其先還原成NO2，再測。 因血清中NO3NO2，NO2很低，因而測定結(jié)果主要反映血清中NO3的含量。64 無需特殊的設(shè)備和昂貴試劑，操作簡便迅速，在一般實驗

29、室、 均可開展，是目前使用最普遍的方法，適用于大批 量樣品測定。 本法測的是NO2含量, 屬于間接測定NO量，其特異性較差。 NO的還原可采用銅離子活化鎘還原法或硝酸鹽還原酶法?！痉椒▽W(xué)評價】 65測定光子量，可代表組織細(xì)胞NO的含量?？捎肗O氣體制作校正曲線，直接測定樣品中的NO。2. 化學(xué)發(fā)光法 通過酸化或/和加入還原劑，使樣品中的亞硝酸鹽釋放NONO+O3 激發(fā)態(tài)NO2* 發(fā)光 返回基態(tài) 樣品用量較少，靈敏度較高，測定范圍50250pmol NaNO2易受樣品中其他因素的干擾，測定的NO含量并不完全代表組織細(xì)胞實際的NO量。 【方法學(xué)評價】 66一般的Griess法僅測定NO2或NO3的

30、含量，且Pr的NO衍生物均被脫蛋白的步驟除去。本法基于所有NO相關(guān)復(fù)合物均可被熱裂解為硝酸鹽。血漿Pr可通過熱變性而除去，避免其干擾。 3. 全血NO代謝產(chǎn)物的測定 血液中NO代謝產(chǎn)物除NO3/NO2外，還包括S-亞硝基血紅蛋白，亞硝酰血紅蛋白等S-亞硝基/亞硝?；衔?，其總稱為NO代謝產(chǎn)物。 67激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長426nm條件下測熒光強度NO2+ 2，3-二氨基萘 1-(H)-萘三唑 H+測定血中NO代謝產(chǎn)物總量，待測樣品可為溶血或全血標(biāo)本，測定結(jié)果可較全面反映NO代謝情況。其他方法因易受Hb或其他Pr影響，不宜用全血標(biāo)本測定?！痉椒▽W(xué)評價】 68(二) NOS測定 1. 化學(xué)發(fā)

31、光法 2. 血紅蛋白法 3. NADP+檢測法 691. 化學(xué)發(fā)光法 加入去鐵乙胺可消除Hb對測定的干擾 NO+L-瓜氨酸NOSO2L-精氨酸+NO+ H2O2 ONOO 化學(xué)發(fā)光 OH魯米諾 加入SOD可消除O2 對測定結(jié)果的影響 702. 血紅蛋白法HbO2和MHb光譜特性有pH依賴性，pH7.7時：HbO2于401nm有最大光吸收MHb與HbO2混合液在411nm有等位光吸收峰測定A401和A411的變化可監(jiān)測NO產(chǎn)量的變化， 反映NOS活性NO+HbO2 MHb NO+L-瓜氨酸NOSL-精氨酸+O2 713. NADP+檢測法 測定NADP+在370nm激發(fā)波長下產(chǎn)生465nm發(fā)射波

32、長的熒光強度，可反映樣品中NOS活性。 NADP+的量可依靠酶催化循環(huán)擴增，可明顯提高對NADP+檢測靈敏度。SQ +O2 +NADPH+H+ Q + O2+NADP+ 優(yōu)勢是可用于檢測含有內(nèi)源性Arg的粗制品缺點是NADP+的生成缺乏特異性【方法學(xué)評價】NO+L-瓜氨酸 NOSL-精氨酸+O2 72三、抗氧化酶活性的檢測 (一) 超氧化物歧化酶(SOD)測定(二) 谷胱甘肽過氧化物酶測定(三) 過氧化氫酶(CAT)測定73直接法一般化學(xué)法 化學(xué)發(fā)光法 (一) SOD測定 測酶活性免疫學(xué)方法 測酶質(zhì)量 電泳法74 特異性強，所需樣本量少(僅50l)，操作快速簡單，重復(fù)性好，靈敏度高，試劑簡單。

33、1. 一般化學(xué)法: 鄰苯三酚自氧化法(改良Marklund法 ) 在堿性條件下，鄰苯三酚自氧化成紅桔酚，用紫外-可見光譜跟蹤波長為325nm、420nm或650nm(經(jīng)典為420nm) 同時產(chǎn)生O2 ，SOD催化O2 發(fā)生歧化反應(yīng)從而抑制鄰苯三酚的自氧化，樣品對鄰苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映樣品中的SOD含量?！痉椒▽W(xué)評價】75屬間接法中的經(jīng)典方法，但本法靈敏度較低。 1. 一般化學(xué)法: 細(xì)胞色素C還原法(McCord法) 【方法學(xué)評價】黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系中產(chǎn)生的O2 使細(xì)胞色素C氧化型還原為還原型，后者在550nm有最大光吸收。將抑制反應(yīng)的百分?jǐn)?shù)與SOD濃度作圖可得到抑制曲線，由此

34、計算樣品中SOD活性。 在SOD存在時，一部分O2 被SOD催化而歧化，O2 還原細(xì)胞色素C的反應(yīng)速度則相應(yīng)減少。762. 化學(xué)發(fā)光法可應(yīng)用于SOD的微量測定靈敏度高，簡便易行特異性準(zhǔn)確性與細(xì)胞色素C還原法類似黃嘌呤或次黃嘌呤 尿酸+O2黃嘌呤氧化酶OO2 +魯米諾 化學(xué)發(fā)光SOD能清除O2 從而抑制魯米諾的化學(xué)發(fā)光【方法學(xué)評價】774. 免疫學(xué)方法 測定SOD質(zhì)量，特異性較好，是較理想的方法。 只能測定Ab相應(yīng)的Ag，對于檢測不同種類的 SOD，則須制備相應(yīng)的特異性Ab，手續(xù)繁瑣。放射免疫法化學(xué)發(fā)光免疫分析法ELISA法【方法學(xué)評價】78(二) 谷胱甘肽過氧化物酶測定 兩者的區(qū)別在于其活性結(jié)

35、構(gòu)中是否含硒non-SeGSHPx只能催化除H2O2外的過氧化物還原SeGSHPx則可催化H2O2及其他過氧化物還原 谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)有兩種 硒谷胱甘肽過氧化物酶(SeGSHPx) 非硒谷胱甘肽過氧化物酶(non-SeGSHPx)791. DTNB直接顯色法 2. 酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測法 3. 熒光測定法 SeGSHPx的測定 801. DTNB直接顯色法 測定該離子的濃度即可計算出GSH減少量，以此求得SeGSHPx活性。LOOH(H2O2)2GSH LOH(H2O)+H2OGSSGSeGSHPx GSH 5，5 -二硫代雙，2-硝基苯甲酸 黃色 (DTNB) 5-硫代，2-硝基苯

36、甲酸殘留的812. 酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測法LOOH(H2O2)2GSH LOH(H2O) H2O GSSG SeGSHPxGSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+GSH還原酶 特異性強、靈敏度高，適用酶含量不高的樣品 GSH還原酶的成本高是本法缺點 【方法學(xué)評價】340nm 82源自GSH的熒光分析法2GSH + H2O2 GSSG +2H2O GSH + OPA 熒光復(fù)合物 3. 熒光測定法隨著反應(yīng)的進(jìn)行，GSH不斷被消耗，經(jīng)一定時間的酶反應(yīng)后，中止反應(yīng)。剩余的GSH與鄰苯二甲醛(OPA)在一定pH條件下生成較特異性的熒光復(fù)合物。通過測定其熒光強度即可測定SeGSHPx活性。8

37、3(三) 過氧化氫酶(CAT)測定 1. 鉬酸銨比色法2. 快速簡便法 3. 改良比色法4. 化學(xué)發(fā)光法841. 鉬酸銨比色法 反應(yīng)迅速達(dá)到平衡，至少穩(wěn)定60min，生成的黃色化合物的A405取決于H2O2和鉬酸銨的濃度。CAT2H2O2 H2O+O2+鉬酸銨 黃色化合物405nm殘留的H2O2測定波長為360nm，測定溫度為25。 2. 快速簡便法853. 改良比色法 在波長570610nm進(jìn)行比色測定鉻酸醋酸鉀的生成量，可反映H2O2的含量。 CAT 簡便、快速、顯色穩(wěn)定、重復(fù)性好，不需特殊試劑及儀器設(shè)備，適用于一般實驗室使用。2H2O2 H2O+O2(加醋酸重鉻酸鉀迅速中止)570610

38、nm 剩余的H2O2+醋酸重鉻酸鉀 鉻酸醋酸鉀 【方法學(xué)評價】864. 化學(xué)發(fā)光法 CAT可引起化學(xué)發(fā)光強度減弱，由此計算總CAT活性。 CAT2H2O2 H2O+O2H2O2+魯米諾+ Co2+ 發(fā)出強烈藍(lán)光87四、常用抗氧化劑的測定 (三) 維生素C測定(一) 還原型谷胱甘肽(GSH)測定1改良比色法2熒光測定法 3HPLC法 (二) 維生素E測定1熒光法 2HPLC-分光光度法 3HPLC-熒光分析法 1DNPH比色法2熒光分析法 3氧化酶法 4HPLC法 88測A412，即可測定巰基1. 改良比色法 本法適用于血紅細(xì)胞GSH含量的測定，采血量及試劑用量較少，更適用于兒童。DTNB+2G

39、SH 2-硝基-5-巰基苯甲酸+GSSG 黃色 【方法學(xué)評價】DTNB：5，5-二硫代雙，2-硝基苯甲酸(一) 還原型谷胱甘肽(GSH)測定 892. 熒光測定法 靈敏度大大高于分光光度法本法適用于測定血小板中GSH鄰苯二醛(OPT) +GSH GSH-OPT 【方法學(xué)評價】 在激發(fā)波長345nm及發(fā)射波長425nm條件下 測熒光，對GSH定量903. HPLC法 本法樣品用量少，測定結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高 GSH最低檢出限為3ng。 缺點：需HPLC儀，在一般實驗室較難完成。鄰苯二醛(OPT) +GSH GSH-OPT 【方法學(xué)評價】 HPLC可有效地用于分離樣品液中的GSH 根據(jù)OPT熒光法檢

40、測GSH的原理，通過分離的GSH峰測定樣品GSH。 熒光檢測激發(fā)波長338nm，發(fā)射波長425nm。 91(二) 維生素E測定 維生素E是一族維生素的總稱，目前已知有7種常見的有、和4種本法靈敏度較高，是測定維生素E的經(jīng)典方法?！痉椒▽W(xué)評價】 維生素E同系物的分子結(jié)構(gòu)中存在相同的共軛雙鍵體系，檢測在激發(fā)波長296nm，發(fā)射波長340nm條件下的熒光，可對維生素E定量。 1. 熒光法 92 -生育酚于292nm有特異性光吸收 胡蘿卜素于450nm有較大光吸收2. HPLC-分光光度法 生物樣品中-生育酚及胡蘿卜素可經(jīng)過HPLC法較好地分離開來，通過檢測不同波長下的光吸收值可測定樣品中的它們的含量

41、。 93 HPLC分離樣品中維生素E 維生素E在激發(fā)波長296nm下可發(fā)射340nm的熒光 根據(jù)測試對樣品純度要求選擇不同的樣品處理方法 3. HPLC-熒光分析法 HPLC法大大提高了分析的準(zhǔn)確度，且能同時 分離和測定各種維生素E同系物。 缺點是儀器設(shè)備較昂貴，分析成本高, 不適 應(yīng)于常規(guī)檢測的要求。 【方法學(xué)評價】941. 2，4-二硝基苯肼(DNPH)比色法抗壞血酸 脫氫抗壞血酸 脫氫抗壞血酸+DNPH 2，4-二硝基苯腙 硫脲及硫酸銅 H+520nm 本法測的是樣品中抗壞血酸和脫氫抗壞血酸總量 如省去氧化步驟，樣品穩(wěn)定，則可測脫氫抗壞血酸含量 是分光光度法較為理想的方法之一特異性不高，

42、其他碳?xì)浠衔锟筛蓴_，加入硫脲可增加DNPH反應(yīng)的特異性。 【方法學(xué)評價】(三) 維生素C的測定 952. 熒光分析法 抗壞血酸 脫氫抗壞血酸 脫氫抗壞血酸+鄰苯二胺 脫氫抗壞血酸對-氮雜萘 測定在激發(fā)波長350nm，發(fā)射波長430nm的熒光 本法測定的是抗壞血酸與脫氫抗壞血酸的總量 963. 氧化酶法 抗壞血酸 脫氫抗壞血酸 抗壞血酸氧化酶 脫氫抗壞血酸+Fe3+2，4，6-三(2-吡啶基)-S-三嗪 生色物 593nm優(yōu)點是不必對生物樣品進(jìn)行過多的純化處理，甚至不用脫蛋白樣品中的脫氫抗壞血酸須用其他方法測定 【方法學(xué)評價】974. HPLC法 最好的方法，先層析法將樣品中的成分分離，再用柱

43、后檢測器檢測。 HPLC-紫外分光光度法 (2) HPLC-電化學(xué)檢測法 是此類方法中最為簡單的一種 最為理想的測定生物樣品中抗壞血酸含量的方法返回章目錄98（一）脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物檢測 （丙二醛、脂氫過氧化物）（二）蛋白質(zhì)氧化損傷指標(biāo)檢測（三）DNA/RNA損傷檢測五、氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物檢測 991. 丙二醛(MDA)的測定TBA比色法 操作簡便、重復(fù)性好，是最常見測定方法 本法的線性范圍約在5.020mmol/L 本法回收率較低，約為60%80% 本反應(yīng)缺乏特異性，測定結(jié)果以MDA的相對含量表示 影響因素較多 【方法學(xué)評價】 過氧化脂質(zhì)中的MDA與硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成紅色化合物，在532nm處有極大吸收峰。（一）脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物檢測100 靈敏度高，最低檢出限0.16mol/L 樣品中的G、Ch、TG、Pr等均不干擾測定 操作較簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，熒光穩(wěn)定，不需特殊試劑， 經(jīng)濟(jì)方便。 【方法學(xué)評價】 MDA可充分與TBA形成熒光縮合物 熒光產(chǎn)物的最大激發(fā)波長為525nm1. 丙二醛(MDA)的測定TBA熒光法101快速簡便，特異性很