專利定稿可溶性型鴨肝炎病毒3d蛋白在制備elisa試劑中的應用及其試劑盒-返公司

1、接案號：140530101(與：140530102 和 140530103 同日申報)(與：一案兩報)專利申請著錄項目表請務必按照“注意事項”核對下述各欄是否填寫正確特殊專利申請信息，涉及該項內(nèi)容時填寫雙方及其它特殊要求同恒源知識2013帶格式的: 邊框:底端: (單實線, 自動設置, 0.75 磅行寬)聯(lián)系人：電子郵箱：mshwang163 com人：轉(zhuǎn) 804；電子郵箱：其它特殊要求分案申請原申請?zhí)枺横槍Φ姆职干暾執(zhí)枺涸暾埲眨耗?月 日生物材料樣品保藏：地址：保藏日期：年 月 日保藏：分類命名：在提交專利申請的同時提交生物材料樣品保藏及存活證明序列表本專利申請涉及核苷酸或氨基酸序列表11

2、 要求優(yōu)先權(quán)原受理機構(gòu)名稱：在先申請日：年 月 日在先申請?zhí)枺涸芾頇C構(gòu)名稱：在先申請日：年 月 日在先申請?zhí)枺?專利名稱可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋白在ELISA 試劑中的應用及其ELISA 試劑盒 專利類型發(fā)明實用新型外觀設計一案兩報 所有發(fā)明人，大， 第一發(fā)明人國籍中國號申請人申請人 (1)或名稱組織機構(gòu)代碼/號450718925611130詳細地址省市溫江區(qū)惠民路 211 號申請人 (2)或名稱組織機構(gòu)代碼/號詳細地址申請人 (3)或名稱組織機構(gòu)代碼/號詳細地址提前請求提前該專利申請（只適用于發(fā)明專利申請）實質(zhì)在提交專利申請的同時提交實質(zhì)請求（只適用于發(fā)明專利申請）帶格式的: 邊框:底

3、端: (單實線, 自動設置,行寬)0.75 磅一、本表由人預先填寫，請聯(lián)系人仔細核對信息是否正確，若有錯誤或缺漏請修改或補充。二、本表第欄，專利名稱包括字母、數(shù)字和標點符號在內(nèi)一般不得超過 25 個字，化學領域可允許最多到 40 個字。三、本表第欄，專利類型分為發(fā)明、實用新型和外觀設計三種。對產(chǎn)品、方法或者其改進所新的技術(shù)方案可以申請發(fā)明專利。對產(chǎn)品的形狀、構(gòu)造或者其結(jié)合所適于實用的新的技術(shù)方案可以申請實用新型專利。對產(chǎn)品的形狀、圖案或者其結(jié)合以及色彩與形狀、圖案的結(jié)合所作出的富有美感并適于工業(yè)應用的新設計可以申請外觀設計專利。申請人可以同日對同樣的發(fā)明創(chuàng)造既申請實用新型專利又申請發(fā)明專利（簡

4、稱一案兩報）。四、本表第欄，發(fā)明人是指對發(fā)明創(chuàng)造的實質(zhì)性特點作出創(chuàng)造性貢獻的人。發(fā)明人應當是個人。發(fā)明人應當使用中文；外國發(fā)明人的中譯名可以使用外文縮寫字母，姓和名之間用圓點分開，例如M 。發(fā)明人有兩個以上的應當自左向右順序填寫。發(fā)明人可以請求國家知識局不其，若請求不，應當在此欄所填寫的相應發(fā)明人后面注明“（不）”。五、本表第欄，第一發(fā)明人、臺地區(qū)的，其國籍應填寫為“中國”。第一發(fā)明人為中國內(nèi)地居民的，還應當同時填寫居民件號碼（或軍官證號碼）。六、本表第欄，申請人是指提出專利申請的人。除另有協(xié)議外，職務發(fā)明的申請人為，非職務發(fā)明的申請人為個人。申請人可以有多個，如兩個或兩個以上的、一個和一個個

5、人等等。申請人是的，應當填寫正式全稱、組織機構(gòu)代碼、地址和；申請人是個人的，應當填寫本人真實、居民件號碼（或軍官證號碼）、地址和。地址欄應明確至街道門牌號碼。七、本表第欄，提前是指在發(fā)明專利申請初步合格后立即進入準備。如果不請求提前，則該發(fā)明專利申請將在自申請日起滿十八個月時。由于發(fā)明專利申請必須在以后才能進入實質(zhì)程序，為了加快申請的進程，在申請人無特別要求的情況下，本公司默認勾選此欄。如申請人不要求提前，請去除勾選并及時通知人。八、本表第欄，實質(zhì)是指員對發(fā)明專利申請是否符合條件（包括新穎性、創(chuàng)造性、實用性、公開充分、單一性問題等）進行。申請人可以在自申請日（有優(yōu)先權(quán)的，指優(yōu)先權(quán)日）起三年內(nèi)提

6、出實質(zhì)請求來啟動實質(zhì)程序。如果在提交專利申請的同時提交實質(zhì)請求，則該發(fā)明專利申請在后立即進入實質(zhì)階段。為了加快發(fā)明專利申請的進程，在申請人無特別要求的情況下，本公司默認勾選此欄。如申請人不想在提交專利申請的同時提交實質(zhì)理人。請求，請去除勾選并及時通知代九、本表第欄，申請是分案申請的，應當填寫此欄。一件專利申請中包含兩項以上發(fā)明、實用新型或者外觀設計的，在該專利申請未結(jié)案之前，申請人可以基于該專利申請主動提出或者依據(jù)員的意見提出一件或多件分案申請。分案申請的類別應當與原申請的類別一致。分案申請應當填寫原申請的申請?zhí)柡蜕暾埲眨粚τ谝烟岢鲞^分案申請，申請人需要針對該分案申請再次提出分案申請的，還應當

7、填寫該分案申請的申請?zhí)?。十、本表第欄，發(fā)明專利申請涉及公眾不能得到的生物材料的，應當填寫此欄，并自申請日起四個月內(nèi)提交由保藏出具的該生物材料樣品的保藏及存活證明。專利定，如果申請涉及的完成發(fā)明必帶格式的: 左帶格式的: 邊框:底端: (單實線, 自動設置, 0.75 磅行寬)須使用的生物材料是公眾不能得到的，申請人必須在申請日前或者最遲在申請日（有優(yōu)先權(quán)的，指優(yōu)先權(quán)日）當天將該生物材料樣品提交至國家知識局認可的生物材料樣品國際保藏保藏。十一、本表第欄，發(fā)明專利申請涉及核苷酸或氨基酸序列表的，應當填寫此欄，并在提交專利申請文件的同時提交核苷酸或氨基酸序列表的計算機可讀形式副本。十二、本表第11

8、欄，申請人要求外國或者本國優(yōu)先權(quán)的，應當填寫此欄。專利定，申請人就相同的發(fā)明或者實用新型在外國第一次提出專利申請之日起十二個月內(nèi)，或者就相同的外觀設計在外國第一次提出專利申請之日起六個月內(nèi)，又提出專利申請的，可以根據(jù)有關規(guī)定要求外國優(yōu)先權(quán)。申請人就相同的發(fā)明或者實用新型第一次提出專利申請之日起十二個月內(nèi)，又以該專利申請為基礎向?qū)＠痔岢霭l(fā)明或者實用新型專利申請的，可以要求本國優(yōu)先權(quán)。要求外國或者本國優(yōu)先權(quán)的在后申請以第一次專利申請的申請日作為優(yōu)先權(quán)日。申請人在一件專利申請中，可以要求一項或多項優(yōu)先權(quán)。帶格式的: 左 摘 要本發(fā)明公開了可溶性I 型鴨肝炎3D 蛋白在ELISA 試劑中的應用及其E

9、LISA 試的反應板、酶標抗體、顯色液和劑盒，ELISA 試劑盒含有可溶性I 型鴨肝炎3D 蛋白終止液，將該試劑盒用于檢測 I 型鴨性肝炎抗體具有特異性強、重現(xiàn)性好、敏感度高，與用全作抗原的ELISA 試劑盒檢測的符合率高，可用于臨床樣品的檢測。1摘 要 附 圖1權(quán) 利 要 求 書1、 可溶性I 型鴨肝炎3D 蛋白在檢測I 型鴨性肝炎抗體的ELISA 試劑中的應用，其特征在于，所述可溶性蛋白的步驟如下：將SEQ ID NO.3 所示序列的第 91376位核苷酸連接于 pET-32(a)+載體的多克隆酶切位點處，然后以大腸桿菌 Rosetta、BL21 或BL21(DE3)PLYS 為宿主菌，在

10、抗性的 LB 培養(yǎng)基中活化后，在 IPTG 終濃度為 0.21.0mmol/L、溫度為 2039條件下誘導表達 412 小時，收集菌液，離心后收集菌體，將收集的菌體用 20 mmol/L、為 8.0 的Tris-HCl 懸浮，然后在冰浴下超聲，破碎后進行離心，上清用 Ni2+-NTA 瓊脂糖凝純化，透析，超濾得可溶性I 型鴨肝炎3D 蛋白。2、 根據(jù)權(quán)利要求 1 所述的應用，其特征在于：所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)PLYS。3、 根據(jù)權(quán)利要求 1 所述的應用，其特征在于：所述誘導表達為加入 IPTG 至終濃度為 0.8 mmol/L，在溫度為 25條件下誘導表達 6 小時。4、 根據(jù)

11、權(quán)利要求 1 所述的應用，其特征在于，所述活化的具體步驟為：將表達菌株接種于抗性的 LB 培養(yǎng)基中，在 37、120 r/min 條件下過夜培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)液與性的LB 培養(yǎng)基按體積比為 1：100 擴大培養(yǎng)至 OD600 為 0.6 即可。5、 根據(jù)權(quán)利要求 1 所述的應用，其特征在于：所述冰浴下超聲為在冰浴條件下超聲破碎6 次，30sec/次，每次間隔 30sec。6、 檢測I 型鴨性肝炎抗體的ELISA 試劑盒，其特征在于：所述試劑盒含有可溶性I抗型鴨肝炎3D 蛋白7、 根據(jù)權(quán)利要求 6的反應板。所述的 ELISA 試劑盒，其特征在于：所述反應板的方法為將1g/mL 的可溶性 I 型鴨肝

12、炎PBST 洗板 5 次，拍干即可。3D 蛋白按每孔 100L 加入反應板中， 4過夜，次日8、 根據(jù)權(quán)利要求 6 所述的 ELISA 試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還含有酶標抗體、顯色液和終止液。9、 根據(jù)權(quán)利要求 6 所述的ELISA 試劑盒，其特征在于：所述酶標抗體為 HRP 標記羊抗鴨IgG 或HRP 標記兔抗鴨IgG，所述顯色液為 TMB，所述終止液為濃度為 2 mol/L 的H2SO4。1可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋白在ELISA 試劑中的應用及其 ELISA 試劑盒技術(shù)領域本發(fā)明屬于生物化學領域，具體涉及可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋白在ELISA 試劑中的應用和檢測I 型鴨背景技

13、術(shù)性肝炎抗體的 ELISA 試劑盒。我國是世界上養(yǎng)鴨數(shù)量最多的國家，鴨的飼養(yǎng)量約占世界的 70%，養(yǎng)鴨業(yè)在我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占有重要地位。鴨肝炎（Duck Hepatitis，DHV）可引起的鴨性肝炎（Duck Viral Hepatitis，DVH）。DVH 是一種高度致死性傳染病，以發(fā)病急、病程短、發(fā)病率和率高為特點。鴨肝炎屬于小 RNA科（Picornaviridae）禽肝炎屬（Avihepato），本病毒有三個型，分別為 DHAV-1、DHAV-2 和 DHAV-3，無免疫交叉反應。在我國，主要流行 1 型鴨性肝炎，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，著養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。因此對 DHAV 等

14、鴨源進行研究具有重要的社會和經(jīng)濟意義。對鴨肝炎及鴨肝炎進行研究，離不開鴨肝炎及其抗體的檢測試劑及檢測方法?？捎糜?DHV 及其抗體檢測的試劑及方法雖很多，如血凝實驗、協(xié)同凝集實驗、中和實驗、瓊脂擴散、ELISA、熒光抗體、免疫組化、膠體金等。而目前最常用且可靠的方法仍是中和試驗 ，但因其操作復雜、費時、成本高，不能用于快速檢測因而不適于基層推廣應用。ELISA法具有操作簡便快速、特異性強、敏感性高、重復性好等優(yōu)點。早在 1991 年，Zhao 等運用中和實驗、瓊脂擴散試驗、ELISA 法對 DHV 抗體進行檢測，陽性檢出率分別為 18.8%、68.8%和 68.8%；作為等以氯仿去脂、0.22

15、m 孔徑濾膜過濾、凝濃縮層析方法純化得到的抗原，也建立了檢測 DHV抗體的間接 ELISA 方法。但該方法在具體使用中受到限制，一致未能推廣，其主要原因之一是檢測 DHV抗體的間接 ELISA 方法對抗原純度要求很高，但由于必須依靠宿主細胞才能增殖，因此進行全抗原純化時難于與宿主蛋白分離。隨著對 DHAV-1 分子生物學研究的不斷深入，將重組表達蛋白（特別是大腸桿菌原核表達蛋白）抗原運用到鴨肝炎抗體的檢測中成為可能。大腸桿菌表達的重組蛋白抗原易于和純化，且表達重組蛋白抗原的宿主細胞大腸桿菌比DHV 抗原的宿主細胞（如鴨1胚及鴨源細胞、雞胚等）與 DHV 的宿主（鴨）親緣關系更遠，檢測時由于抗原

16、純度而產(chǎn)生非特異性的可能性也減少。但重組表達的蛋白抗原運用到鴨肝炎抗體的檢測還有一個困難，就是大腸桿菌表達易形成不溶性的包涵體，包涵體由于雜蛋白含量較低、可避免蛋白酶降解、難溶于水等特點而使其易于分離純化。包涵體中的目標蛋白雖然其肽鏈是完整的，但卻是非天然形式、無生物學活性的表達蛋白，包涵體的溶解非常，需要用強變性劑高濃度尿素、SDS 等來打斷分子內(nèi)和分子間的非共價鍵、離子鍵等，為獲得有活性的蛋白，繼而需要進行蛋白復性，而包涵體蛋白溶解后的復性不僅費時、費力，且復性率低。DHAV 具有微RNA科成員相似的特點，為單股正鏈RNA，完整組長度約為7.7kb，由 5非翻譯區(qū)、一個大的開放閱讀框（OR

17、F）、3非翻譯區(qū)組成，ORF 含有 6750nt，編碼2249AA 的多聚蛋白，隨后被編碼的蛋白酶切割，首先分解成 P1、P2 和 P3 產(chǎn)物，然后P1、P2 和P（3 P1 編碼結(jié)構(gòu)蛋白、P2 和P3 編碼非結(jié)構(gòu)蛋白）又進一步分別分解為VP0/VP1/VP3、2A1/2A2/2A3/2B/2C 和 3A/3B/3C/3D 蛋白，產(chǎn)生 12 個成蛋白。3D 是 DHAV 的一種非結(jié)構(gòu)蛋白，雖然不是粒子的組成成分，但在生命循環(huán)中扮演著重要角色，在負鏈 RNA、酶過程中占有主導的作用，加之其本身的酶催化活性，使得 3D 蛋白在的生存過程中必不可少，因此，在機體內(nèi)可能產(chǎn)生 3D 抗體，但目前未見 3

18、D 蛋白是否可以作為抗原檢測 DHAV 抗體的 ELISA 方法；同時，獲得高純度有活性的抗原并應用于ELISA 檢測試劑盒 ，對于鴨性肝炎抗體的檢測的有重要的意義和推動作用。發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋白在檢測I 型鴨性肝炎抗體ELISA 試劑中的應用；本發(fā)明的目的之二在于提供檢測I 型鴨體ELISA 試劑盒。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：性肝炎抗1、可溶性 I 型鴨肝炎應用，所述可溶性蛋白的3D 蛋白在檢測 I 型鴨性肝炎抗體的 ELISA 試劑中的步驟如下：將SEQ ID NO.3 所示序列的第 91376 位核苷酸連接于pET-3

19、2(a)+載體的多克隆酶切位點處，然后以大腸桿菌Rosetta、BL21 或 BL21(DE3)PLYS為宿主菌，在 抗性的 LB 培養(yǎng)基中活化后，在 IPTG 終濃度為 0.21.0 mmol/L、溫度為 2039條件下誘導表達 412 小時，收集菌液，離心后收集菌體，將收集的菌體用 20 mmol/L、為 8.0 的 Tris-HCl 懸浮，然后在冰浴下超聲，破碎后進行離心，上清用 Ni2+-NTA 瓊脂糖2凝純化，透析，超濾得可溶性I 型鴨肝炎3D 蛋白。優(yōu)選的，所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)PLYS。優(yōu)選的，所述誘導表達為加入 IPTG 至終濃度為 0.8 mmol/L，在溫度

20、為 25條件下誘導表達 6 小時。優(yōu)選的，所述活化的具體步驟為：將表達菌株接種于抗性的 LB 培養(yǎng)基中，在 37、120 r/min 條件下過夜培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)液與培養(yǎng)至 OD600 為 0.6 即可。抗性的LB 培養(yǎng)基按體積比為 1：100 擴大更優(yōu)選的，所述冰浴下超聲為在冰浴條件下超聲破碎 6 次，30sec/次，每次間隔 30sec。2、檢測I 型鴨性肝炎抗體的ELISA 試劑盒，所述試劑盒含有可溶性I 型鴨肝炎3D 蛋白的反應板。優(yōu)選的，所述反應板的方法為將 1g/mL 的可溶性 I 型鴨肝炎，次日PBST 洗板 5 次，拍干即可。3D 蛋白按每孔100L 加入反應板中，4過夜優(yōu)選的，

21、所述試劑盒還含有酶標抗體、顯色液和終止液。更優(yōu)選的，所述酶標抗體為 HRP 標記羊抗鴨IgG 或HRP 標記兔抗鴨IgG，所述顯色液為TMB，所述終止液為濃度為 2 mol/L 的 H2SO4。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開了可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋白在檢測 I 型鴨性肝炎抗體ELISA 試劑中的應用，且將其構(gòu)建為檢測試劑盒，獲得的試劑盒具有特異性強、重現(xiàn)性好、敏感度高，與用全作抗原的ELISA 試劑盒檢測的符合率高，對I 型鴨性肝炎的具有重要意義。附圖說明為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：圖 1 為 I 型鴨肝炎株 DHAV-H 的 3DPCR 擴增產(chǎn)

22、物電泳結(jié)果（M：DL 2000Marker，1：3DPCR 擴增產(chǎn)物）。圖 2 為I 型鴨肝炎株 DHAV-H 的 3D載體構(gòu)建過程中PCR 鑒定和酶切鑒定結(jié)果（A：pJET-1.2+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒PCR 鑒定，M：DL2000 Marker，1：PCR 產(chǎn)物；B： pJET-1.2+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒酶切鑒定，M：DL15000 Marker，1：Kpn/Xho雙酶切條帶，2： Xho單酶切條帶；C：pET-32(a)+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒的PCR 鑒定，M：DL2000 Marker，1： PCR 產(chǎn)物；D：pET32a+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒的酶切鑒定，1：

23、Kpn/Xho雙酶切結(jié)果，2：Xho單酶切條帶）。3圖 3 為可溶性 3D 蛋白表達條件的優(yōu)化（M 為低分子量蛋白質(zhì)標準品；A：表達菌的篩選，1 為 pET-32(a)+空載體表達產(chǎn)物，2-4 分別為 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Rosetta、BL21 和 BL21(DE3)PLYS 三種不同表達宿主菌的表達產(chǎn)物；B：誘導表達時間的優(yōu)化，1-5 依次為誘導 12 h、10 h、8 h、6 h 和 4 h 的BL21(DE3)PLYS 宿主菌表達產(chǎn)物；C：誘導表達溫度的優(yōu)化，1-6 分別為 39、37、35、30、25和 20的 BL21(DE3)PLYS宿主菌表達

24、產(chǎn)物；D：IPTG 濃度優(yōu)化，1-5 分別為 0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L 和 1.0 mmol/L 的IPTG 誘導的表達產(chǎn)物。圖 4 為 3D 蛋白 Western-blot 檢測及純化蛋白電泳（A 為 3D 蛋白的免疫印跡檢測結(jié)果，M 為蛋白質(zhì) Marker，1 為 3D 蛋白印跡。B 為SDS檢測純化的 3D 蛋白，M 為低分子量蛋白質(zhì)Marker，1 為純化的 3D 蛋白）。具體實施方式下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J. 薩

25、姆等著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例 1、克隆 I 型鴨肝炎株 DHAV-H 的 3DI 型鴨肝炎載體均由株 H（DHAV-H）（GenB：JQ301467）、E. coli DH5 菌種和pET-32(a)+禽病防治保存并提供。各種分子生物學試劑購于生物試劑公司。根據(jù)DHAV-H 的物如下：組序列（GenB：JQ301467）設計擴增 3D的引物，具體引P1：5-ggggtaccgatcaagggaaagtagtgagcaag-3（SEQ ID NO.1），下劃線表示 Kpn酶切位點；P2：5-acgcctcgagtcagatcatcatgcaagctgt-3（SEQ I

26、D NO.2），下劃線表示 Xho酶切位點；然后將設計的引物由寶生物工程（大連）。取保存的 DHAV-H液以滅菌 PBS 作 5 倍稀釋，添加 1/100 體積的雙抗（青霉素、鏈霉素的終濃度分別為 100IU/mL 和 100g/mL）后于 37 溫育 1 h，然后接種 9 日齡發(fā)育良好、無母源抗體的鴨胚，棄去 24 h 內(nèi)胚，收集 2472 h胚的尿囊液及胚體，按照Trizol 試劑盒提取RNA。將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA，然后以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，反轉(zhuǎn)錄4和PCR 擴增體系如表 1 所示。表 1 反轉(zhuǎn)錄和PCR 反應體系反錄轉(zhuǎn)程序為：30 10 min，42 15 m

27、in，95 5 min，4 5 min，循環(huán)一次；PCR程序為：94預變性 5 min；94變性 40 sec，56退火 40 sec，72后延伸 30 sec，30 個循環(huán)，最后 72后延伸 10 min。將PCR 擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖 1 所示。結(jié)果顯示，擴增獲得長度約 1386bp 的片段（不包括內(nèi)切酶位點和保護性堿基則為 1368bp），其核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示，與預期片段大小相同，因此按照天根生化科技()的膠回收試劑盒回收目的條帶，回收獲得的片段命名為DHAV-H-3D。實施例 2、構(gòu)建表達 I 型鴨肝炎株 H 3D 蛋白的表達載體將回收的 DHAV

28、-H-3D 與 pJET1.2 載體連接，連接反應參照 pJET1.2 克隆試劑盒進行，反應體系如表 2 所示。表 2、連接DHAV-H-3D 與pJET1.2 載體項目體積2Reaction Buffer DHAV-H-3D 回收產(chǎn)物 pJET1.2 載體水（nuclease free） T4 DNA-ligase小計10 L1 L1 L7 L1 L20 L按表 2 體系混合后進行瞬時離心，然后在 20條件下連接 15 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5感受態(tài)細胞，并用抗性的 LB 固體及液體培養(yǎng)基篩選，并將篩選菌落用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2 所示序列為引物進行PCR 檢測，

29、擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2 中 A 所示。結(jié)果顯示，篩選獲得了陽性克隆。為了進一步檢測陽性克隆，將陽性克隆的菌株提取質(zhì)粒，然后經(jīng) Kpn和 Xho雙酶切5RTPCR5*PrimescriptTM Buffer2 LPrimescript RTase Mix0.5 L下游引物 P21 LRNA2 LRNAase Free 水4.5 L小計10 L2*Prime Star Mix12 5 L上游引物 P1（10pmol/L）1 L下游引物 P2（10pmol/L）1 LcDNA1 L滅菌蒸餾水9 5 L小計25 L及 Xho單酶切鑒定，酶切體系如表 3 所示。表 3、Kpn及 Xho酶

30、切鑒定反應體系單酶切體系雙酶切體系10H buffer質(zhì)粒2.5 L 10 L11.5 L/ 1 L25 L10H buffer質(zhì)粒2.5 L 10 L10.5 L 1 L 1 L25 L滅菌蒸餾水滅菌蒸餾水Kpn Xho小計Kpn Xho小計按表 3 體系混合后瞬時離心，然后于 37條件水浴 3 h，反應結(jié)束將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖 2 中B。結(jié)果顯示，DHAV-H-3D 片段正確連入pJET1.2 載體中，并命名為 pJET-1.2+/DHAV-H-3D。將 pJET-1.2+/DHAV-H-3D 送 Invitrogen 公司篩選未突變的序列用于構(gòu)建表達載體。，取正確的

31、pJET-1.2+/DHAV-H-3D 和pET-32(a)+載體分別用 Kpn和 Xho進行雙酶切，回收 3D及載體骨架，然后按表 4 所示體系進行連接。表 4、3D及載體骨架連接體系項目體積5.5 L 2 L7.5 L15 L目的pET32a+回收液2Ligation mix小計按表 4 體系混合后瞬時離心，然后于 16條件下過夜連接，得 pET-32(a)+/DHAV-H-3D質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5 宿主菌，以抗性LB 固體及液體培養(yǎng)基篩選，然后進行 PCR鑒定，結(jié)果如圖 2 中 C 所示。然后將 PCR 鑒定為陽性的菌株用于提取質(zhì)粒，并將質(zhì)粒用Xho進行單酶切及用 Kpn和 Xho

32、進行雙酶切，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖 2 中 D 所示。由圖 2 中C 和D 可知，3D及載體骨架正確連接。實施例 3、I 型鴨肝炎株 H 可溶性 3D 蛋白的表達表達宿主菌大腸桿菌（ Escherichia coli ） Rosetta 、大腸桿菌 BL21 和大腸桿菌BL21(DE3)PLYS 菌種均由禽病防治保存；含 I 型鴨肝炎株H 3D蛋白的表達載體 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 由實施例 2 中構(gòu)建；各種分子生物學試劑購于生6物試劑公司。將實施例 2 獲得的 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化 BL21 、 Rosetta 和BL21(D

33、E3)PLYS 表達菌，轉(zhuǎn)化菌于過夜培養(yǎng)，次日將過夜培養(yǎng)物與新鮮抗性的LB 液體培養(yǎng)基中 37、120 r/min 條件下抗性的 LB 液體培養(yǎng)基按體積比為 1：100 擴大培養(yǎng)約 3 小時，菌液 OD600 達 0.6 時加入 IPTG 至終濃度為 0.2mmol/L，并在 37下誘導12 h，然后收集菌液，將菌液在 12000 r/min 條件下、離心 10 min，菌體用 20 mmol/L Tris-HCl（8.0）按 1:10（V/V）懸浮。同時以 pET-32(a)+載體轉(zhuǎn)化相應表達菌作為對照。為了篩選表達出可溶性 3D 蛋白的表達菌，然后將上述制得的懸浮菌液在冰浴條件下超聲破碎

34、6 次，30sec/次，每次之間間隔 30sec，然后將破碎后的菌液在 4、12000r/min條件下離心 10min，棄沉淀（為不溶性包涵體表達蛋白），收集上清（為可溶性表達蛋白）。吸取 80L 上清，加入 20L 含-巰基乙醇的 5SDS 上樣buffer，煮沸 10min 后在 12000r/min條件下常溫離心 5min，然后進行SDS電泳檢查，結(jié)果如圖 3 中A 所示。結(jié)果顯示，通過將重組質(zhì)粒 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 轉(zhuǎn)化到三種表達菌后，在約 68 kD 處出現(xiàn)了目的條帶，而對照不含有此條帶，并且轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)PLYS 菌株的蛋白表達量最大、BL21的表達

35、量次之，所以根據(jù)表達量篩選出最佳表達菌為BL21(DE3)PLYS。I 型鴨肝炎株H 可溶性 3D 蛋白表達條件的優(yōu)化：（1）IPTG 濃度的優(yōu)化：將含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)PLYS菌株的菌液按體積比為 1:100 接種于 5抗性的LB 液體培養(yǎng)基試管中，并于 37振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6左右，加入 IPTG 至終濃度分別為 0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6mmol/L、0.8 mmol/L 和 1.0 mmol/L，然后在 37條件下誘導培養(yǎng) 12 h，然后用SDS檢測可溶性 3D 蛋白的表達量，結(jié)果如圖 3 中 B

36、 所示。結(jié)果顯示，IPTG 終濃度為 0.8 mmol/L條件下可溶性 3D 蛋白的表達量最高，即IPTG 終濃度為 0.8 mmol/L 為最適濃度。（2）誘導表達溫度優(yōu)化：將含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)PLYS菌株的菌液按體積比為 1:100 接種于 6抗性的LB 液體培養(yǎng)基試管中，并于 37振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.6 左右，加入IPTG 至終濃度為 0.8 mmol/L，然后分別于溫度為 20、 25、30、35、37和 39條件下誘導 12 h，然后用SDS檢測可溶性 3D 蛋白的表達量，結(jié)果如圖 3 中 C 所示。結(jié)果顯示，溫度在

37、 25條件下可溶性 3D 蛋白的表達量最高，即誘導溫度為 25為最適表達溫度。（3）誘導表達時間優(yōu)化：將含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)PLYS菌株的菌液按體積比為 1:100 接種于 5抗性的LB 液體培養(yǎng)基試管中，并于 377振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.6 左右，加入IPTG 至終濃度為 0.8 mmol/L，然后于溫度為 25條件下誘導 4 h、6 h、8 h、10 h 和 12 h，然后用 SDS檢測可溶性 3D 蛋白的表達量，結(jié)果如圖 3 中 D 所示。結(jié)果顯示，溫度在誘導表達 6h 后可溶性 3D 蛋白的表達量以達到最高，即誘導表達時間

38、為 6h。經(jīng)過上述優(yōu)化，可以看出含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)PLYS菌最優(yōu)表達條件為 0.8 mmol/L IPTG、25 誘導 6 h。后續(xù)按照此條件對 3D 蛋白進行大量表達。I 型鴨肝炎株H 可溶性 3D 蛋白Western-blot 檢測，具體步驟如下：按最優(yōu)表達條件表達可溶性 3D 蛋白，然后進行 SDS，隨后將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上，80 V 轉(zhuǎn)印 90 min，轉(zhuǎn)印完畢后將 PVDF 膜取出，以 1% BSA 于 37 搖動孵育 1 h，然后以1:100 稀釋的抗DHAV 的IgG 在 37搖動孵育 1 h 后取出，以

39、TBS 洗滌 3 次，每次 2 min，隨后以 1:3000 稀釋的HRP 標記的羊抗鴨IgG 或HRP 標記兔抗鴨IgG 于 37搖動孵育 1 h，以 TBS 洗滌后按照 DAB 顯色試劑盒顯色，待目的條帶清晰可見時以蒸餾水沖洗終止顯色，結(jié)果如圖 4 中 A 所示，最后將PVDF 膜干燥避光保存。I 型鴨肝炎株H 可溶性 3D 蛋白的純化：將含重組質(zhì)粒pET-32(a)+/DHAV-H-3D 的BL21(DE3)PLYS 在最適條件下表達，然后收集菌體，用 20 mmol/L Tris-HCl（8.0）懸浮后在冰浴條件下超聲破碎 6 次，30sec/次，每次之間間隔 30sec，然后將破碎后

40、的菌液在 4、12000r/min 條件下離心 10min，收集上清（為可溶性表達蛋白）；然后將收集的上清在 Bio-rad公司提供的 Ni2+-NTA 瓊脂糖凝純化（純化液及純化方法按試劑盒進行），將收集的純化蛋白液進行透析后用 0.45m 的濾膜超濾，最后置于 4 、-20、-70或凍干保存。將純化后的可溶性 3D 蛋白進行 SDS電泳，結(jié)果如圖 4 中 B 所示。結(jié)果顯示表達的 3D 蛋白經(jīng) Ni2+-NTA 親和純化后，得到了純度、濃度均較高的蛋白，經(jīng)核酸蛋白分析儀測定蛋白濃度為 1.5 mg/mL。實施例 4、利用可溶性 3D 蛋白以 ELISA 方法檢測 I 型鴨性肝炎抗體ELIS

41、A 方法檢測I 型鴨性肝炎抗體的具體步驟如下：（1）抗原反應板：加入實施例 3 純化獲得的可溶性 3D 蛋白，100 L/孔，次日PBST 洗板 5 次，每次 3 min，拍干；（2）封閉液封閉，同上洗板；（3）加入待檢鴨，在 37孵育 1.5 h，同上洗板；（4）加入工作濃度的酶標抗體（HRP 標記羊抗鴨 IgG 或 HRP 標記兔抗鴨 IgG），在837 條件下孵育 0.5 h，同上洗板；加入TMB 顯色液，避光反應；加入終止液（2 mol/L H2SO4），50 L/孔；（7）酶標儀以雙波長形式OD450-OD630 值；（8）選擇P/N 值最大者為最佳反應條件。為了獲得最佳的檢測效果，

42、按表 5 所示條件優(yōu)化：表 5、間接ELISA 條件優(yōu)化優(yōu)化項目優(yōu)化條件設置 1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600 五個梯度酶標抗體工作濃度可溶性3D 蛋白作1:50(30g/mL)、1:100(16g/mL)、1:200(8g/mL)、1:400(4抗原濃度和血g/mL)、1:800(2g/mL)、1:1600(1g/mL)六個梯度；鴨性肝炎陽/陰清稀釋度分別作 1:100、1:200、1:400、1:800 四個梯度，通過方陣法確定最性佳濃度和稀釋度設置 5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min 六個顯色時間顯色時間設置 37

43、 1h 后 4過夜，37 4h 后 4過夜和直接 4過夜三個條件條件設置 1% BSA、5% BSA、1%脫脂奶粉、5%脫脂奶粉、1%小牛、5%封閉液選擇小牛、1%明膠、5%明膠八種封閉液封閉時間設置 30 min、60 min、90 min、120 min 四個梯度ELISA 方法的反應條件優(yōu)化（1）最佳酶標抗體濃度將酶標抗體（KPL 公司的HRP 標記羊抗鴨IgG，濃度為 100g /mL）分別作 1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600 濃度稀釋，每個濃度設置兩個重復，均于 37孵育，同時設置陰陽性，然后檢測 OD450-OD630 值，并取平均值，結(jié)果如表 6 所示

44、。選擇 P/N 值最大者為最佳二抗稀釋度。表 6、酶標抗體工作濃度優(yōu)化91:1001:2001:4001:8001:1600酶標抗體稀釋度陽性 OD4500.8930.7580.5370.4000.275OD4500.4380.3100.2220.1600.126P/N 值2.0392.4492.4212.4912.182由表 6 可知，酶標抗體作 1:800 稀釋時效果最佳。（2）最佳抗原濃度及稀釋度將實施例 3 純化獲得的可溶性 3D 蛋白分別作 1:50、1:100、1:200、1:400、1:800 和 1:1600稀釋，鴨性肝炎陽/分別作 1:100、1:200、1:400、1:80

45、0 稀釋，每個濃度設置 2個重復，檢測 OD450-OD630 值后取平均值，結(jié)果如表 7 所示。選擇 P/N 值最大者為最佳條件。表 7、抗原濃度和稀釋度選擇抗原稀釋度稀釋度1:501:1001:2001:4001:8001:16001:100+1:100-P/N 值1:200+1:200-P/N 值1:400+1:400-P/N 值1:800+1:800-P/N 值0.8700.3882.2450.7500.2812.6680.4960.2072.3940.3430.1542.2360.8830.4102.1550.7170.2902.4760.5300.1952.7160.3660.18

46、02.0360.8920.4192.1270.7330.3262.2470.5430.2182.4930.3700.2051.8040.8830.3602.4540.7310.3182.2980.5230.1972.6550.3580.1841.9390.8860.4022.2030.6780.2672.5340.4910.1762.7900.3150.1631.9310.8430.3612.3370.6690.2492.6850.4580.1552.9630.2590.1611.609由表 7 可知，將可溶性 3D 蛋白作 1：1:1600，（3） 最佳顯色時間作 1：400 稀釋效果最佳。

47、將顯色時間分別設置為 5 min、10 min、15 min、20 min、25 min 和 30 min，每個顯色時間陽性、均設置 4 個重復，均于 37避光顯色，然后檢測 OD450-OD630 值，平均值，結(jié)果如表 8 所示。選擇P/N 值最大者為最佳顯色時間。表 8、最佳顯色時間選擇顯色時間(min)51015202530陽性均值0.2290.0580.3670.1150.5230.1530.6100.1990.6920.2230.7190.224均值10PN 值3.9563.2063.4193.0673.1063.205結(jié)果顯示，顯色時間為 15 min 時效果最佳。（4） 最佳條件

48、分別在 37處理 1h 后在 4過夜，37處理 4h 后在 4過夜和直接在 4過夜三種條件下，同時設置陽性和，各 7 個重復，OD450-OD630 平均值，結(jié)果如表 9所示。選擇P/N 值最大者為最佳條件。表 9、條件優(yōu)化條件371h 4過夜374h 4過夜4過夜陽性均值0.5100.1393.6740.5100.1493.4280.5310.1214.383均值P/N 值由表 9 可知，在 4條件下（5）最佳封閉液、封閉時間過夜為最佳條件。分別以 1% BSA、5% BSA、1%脫脂奶粉、5%脫脂奶粉、1%小牛、5%小牛、1%明膠和 5%明膠為封閉液，每一種封閉液設置 3 個重復，并于 3

49、7條件下封閉，OD450-OD630 平均值，結(jié)果如表 10 所示。然后設置封閉時間為 30 min、60 min、90 min、120min，OD450-OD630 平均值，結(jié)果如表 11 所示。選擇 P/N 值最大者作為最佳封閉液、封閉時間。表 10、最佳封閉液選擇封閉液5%牛10%牛1%脫脂奶5%脫脂奶1%BSA5%BSA1%明膠5%明膠陽性值0.4470.1732.5840.4520.1752.5890.4570.1922.3860 5080 2192 3200.6870.1773.8720.4310.1912.2600.4890.1892.5890.5070.2162.370值PN

50、值表 11、封閉時間選擇封閉時間0.5h1h1.5h2h陽性0.5910.1493.9670.5040.1303.8900.5560.1723.2300.5880.1713.435P/N 值由表 10 和表 11 可知，最佳封閉液為 1% BSA，最佳封閉時間為 0.5 h。根據(jù)上述優(yōu)化條件構(gòu)建檢測I 型鴨性肝炎抗體的ELISA 試劑盒，具體為：可溶性I型鴨肝炎3D 蛋白的反應板、酶標抗體、顯色液和終止液，其中反應板以濃度 1g/mL11的可溶性I 型鴨肝炎3D 蛋白按每孔 100L 加入反應板中， 4過夜，次日PBST洗板 5 次，拍干，其效果最佳；酶標抗體為HRP 標記羊抗鴨IgG，所述顯

51、色液為TMB，所述終止液為濃度為 2 mol/L 的H2SO4。ELISA 檢測方法為：以 1g/mL 的可溶性 3D 蛋白液 4過夜，以 1% BSA 作為封閉液 37封閉 0.5h，稀釋度 1:400 于 37 孵育 1.5 h，HRP 標記的羊抗鴨IgG 以 1:800 稀釋于 37孵育 0.5 h，顯色 15 min。利用根據(jù)上述ELISA 的優(yōu)化條件，檢測 I 型鴨性肝炎抗體的ELISA 試劑盒的特異性：（1）特異叉實驗用建立的 ELISA 試劑盒檢測鴨沙門氏菌（Sal）、鴨大腸桿菌（E.coli）、鴨腫頭敗血癥病毒（DSHDV）、設置鴨肝炎陽性、H5（AIV）、鴨瘟（DPV）和鴨里

52、默氏桿菌（RA）陽性，對照，每個設置 3 個重復，OD450-OD630 平均值，結(jié)果如表 12 所示。表 12、ELISA 試劑盒特異性檢測待檢SalE.coliDSHDVAIVDPVRADHAVOD 值0.0590.0720.0700.0770.0470.1200 5460.123與OD 值比值0.4800.5900.5700.6280.3860.9764.460/結(jié)果顯示，六種待檢陽性與的比值均小于 2.1，表明建立的 ELISA 試劑盒特異性很好。（2）特異性阻斷實驗用可溶性 3D 蛋白與 I 型鴨肝炎的陽性按體積比為 10：1 混合，于 37中和 1h 后稀釋至最佳示。稀釋度，用建立

53、的ELISA 試劑盒檢測，計算阻斷率，結(jié)果如表 13 所表 13、ELISA 試劑盒阻斷實驗結(jié)果陽性PN 值阻斷前 OD 值阻斷后 OD 值阻斷率0.6950.18972.8%0.1820.15216.4%3.821.24/結(jié)果顯示，陽性阻斷率為 72.8%，阻斷率為 16.4%。表明可溶性 3D 蛋白能與鴨肝炎陽性特異性識別并進行中和。（3）變異系數(shù)12同一批純化的 3D 蛋白按不同批次酶標條，然后檢測 6 份的 OD450-OD630 值，每份設置 6 個重復，檢測其變異系數(shù)作板內(nèi)、板間變異系數(shù)，變異系數(shù) CV=標準差/平均值（SD/X100%），結(jié)果如表 14 和表 15 所示。表 14

54、、板內(nèi)變異系數(shù)測定OD450SD板內(nèi)變異系數(shù)1234560.2530.3900.6230.7020.3620.4150.0170.0100.0210.0130.0120.0116.57%2.69%3.31%1.91%3.19%2.63%表 15、板間變異系數(shù)測定OD450SD板間變異系數(shù)1234560.2330.3310.5730.6300.3520.3920.0160.0070.0150.0250.0200.0066.74%2.06%2.63%3.96%5.67%1.43%結(jié)果表明，板內(nèi)變異系數(shù)在 1.9%-6.6%，均小于 10%，板間變異系數(shù)在 1.4%-6.7%，均小于 10%。表明建

55、立的ELISA 試劑盒法重現(xiàn)性好。（4） 陽性閾值確定以可溶性 3D 蛋白最佳稀釋度酶標條，以最佳反應條件進行反應，檢測 60 份OD450-OD630 值，計算 cut-off 值=均值+3方差（Vcut-off=X+3SD），結(jié)果如表 16 所示。表 16、60 份OD450-OD630 值0.1300.1420.1640.1690.1350.1540.1830.1330.1190.2080.1760.1530.1410.1250.1880.1860.1500.1410.1240.1600.1890.1940.1660.1460.1770.1880.1880.1280.1680.1810.

56、1860.1300.1650.1710.1670.1660.1280.1620.1500.1440.1390.1760.1710.1990.1230.1910.1300.1110.1510.1900.1950.1770.1420.1450.1550.1430.1290.1420.1720.207取均值+3SD 作為陽性閾值，結(jié)果顯示，陽性閾值為 0.155+30.028=0.238。13（5）敏感性檢測取 8 份 I 型鴨性肝炎陽性，分別從 1:100 開始，以 2 倍倍比稀釋，用建立的ELISA 試劑盒檢測，以能檢測出陽性的最大稀釋度為靈敏度，結(jié)果如表 17 所示。表 17、ELISA 試劑

57、盒靈敏度檢測血 清稀釋度123456781:1001:2001:4001:8001:16001:32001:64001:128001:256001:512001:1024001:2048000.9540.8680.6760.4980.3420.2790.2170.2000.1990.1880.1850.0550.7480.6340.4670.4110.3280.2800.2350.2210.2080.1970.1660.0731.0440.8660.6920.5070.3480.2580.2220.2060.2060.1920.1920.0460.8210.6990.5480.4260.318

58、0.2510.2240.1760.1530.1460.1540.0610.8870.7720.6420.4590.3360.2500.1920.1630.1530.1490.1380.0520.7730.6870.6210.5170.3500.2790.1940.1850.1660.1500.1470.0860.6160.5350.4500.3640.3050.2360.1980.1750.1620.1470.1450.0850.7110.6350.5320.4180.3310.2340.2070.1820.1760.1510.1450.079結(jié)果顯示，ELISA 試劑盒檢測I 型鴨性肝炎的靈

59、敏度為 1:3200。綜上可見，利用本發(fā)明制得的可溶性 3D 蛋白的 ELISA 試劑盒檢測 I 型鴨性肝炎抗體具有特異性強、重現(xiàn)性好、敏感度高的優(yōu)點，可用于臨床樣品的檢測。實施例 5、可溶性 3D 蛋白與全ELISA 檢測的比較：全ELISA 檢測抗原的將 DHAV-1 弱毒的尿囊液原毒（為I 型鴨肝炎CH60 株，該株為本分離致弱的株，公開于公開號為 103103163A 的中國專利，保藏為 CCTCC NO.V201248）以滅菌 PBS 作 5 倍稀釋，添加相當于稀釋液 1/100 體積的雙抗（青霉素、鏈霉素的終濃度分別為 100IU/mL 和 100g/mL）于 37溫育 1h 后接

60、種雞胚，每天照蛋兩次，24 h內(nèi)胚舍棄，收集 24-72 h 內(nèi)雞胚尿囊液和胚體，胚體經(jīng)-20凍融兩次并研磨后以適量PBS 懸浮，10000 r/min 離心 30 min 取上清與尿囊液混勻置-20保存?zhèn)溆?。將DHAV-1 弱毒液經(jīng) 10000 r/min 離心 30 min，取上清液 0.22 m 濾膜過濾后 45000r/min 離心 2 h，將沉淀以離心前液體積的 1/40 比例加入滅菌PBS 懸浮，分裝于-20 保存?zhèn)溆茫⒁院怂岬鞍變x檢測其蛋白濃度。全ELISA 方法 ，具體步驟如下：a.抗原反應板，100 L/孔，37處理 1 h 后轉(zhuǎn)入 4過夜，次日 PBST 洗板 5 次，每