現(xiàn)代儀器分析

1、題 目：教學目的與要求:熒光分析法（1）掌握分子熒光、磷光和化學發(fā)光的產(chǎn)生機理；掌握激 發(fā)光譜和發(fā)射光譜特征。（2）掌握熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系以及溶液的熒光（磷光） 強度影響因素。（3）熟悉熒光（磷光）分析法的特點及定量測定方法。（4）了解磷光分析法的類型。（5）熟悉熒光、磷光和化學發(fā)光分析儀器的結(jié)構(gòu)。內(nèi)容與時間分配:重點與難點：熒光分析原理：120min；熒光儀器：20min；分析方法：40min；磷光分析簡介：20min；1、熒光的產(chǎn)生；2、熒光光譜與激發(fā)光譜；3、熒光與分子結(jié)構(gòu)4、影響因素5、分析方法教具準備:PPT學習好資料-.歡迎下載熒光分析法（fluorometry ）靈敏度高，紫外

2、一可見法10-7g/ml待測物質(zhì)：分子熒光原子熒光激發(fā)光：紫外可見熒光紅外可見熒光X-射線熒光1、基本原理利用目一波長得光照射試樣，使試樣吸收這一輻射，然后再發(fā)射出波長相同或較長得光，若這 種再發(fā)射約在10-9秒內(nèi)發(fā)生，稱為熒光，利用熒光得強度和特性對物質(zhì)進行定性、定量分析，稱為熒 光分析法。當分子軌道中電子吸收光子躍遷，若電子躍遷后，處于自旋方向相反得狀態(tài)，則總自旋量子數(shù)S = 0，體系的多重性M=2S+1，既為 激發(fā)態(tài)的單線態(tài)（此分子在磁場中不產(chǎn)生能級裂分）若電子躍遷后，處于自旋方向相同的狀態(tài)，則總自旋量子數(shù) S=1/2+1/2=1,體系的多重性 M=2S+1=3,即為三線態(tài)（在磁場中，三

3、線態(tài)的電子能級產(chǎn)生裂分，一條線可分裂成三條線。三線態(tài)的 能量較相應(yīng)單線態(tài)的能量低）。電子由單-單躍遷，所需E1 熒光熒光法不普及：室溫下難呈現(xiàn)體系間跨越幾率小體系間跨越后，又一改體系間跨躍回到激發(fā)單線態(tài)-熒光分子間碰撞，溶劑間作用，各種卒滅效應(yīng)。所以，磷光法：液氮冷凍條件下激發(fā)。延遲熒光分子在激發(fā)三線態(tài)的振動基態(tài)可以存活一定時間，所以需時較長。2、激發(fā)光譜與熒光光譜熒光時分子受激發(fā)射光譜，所以有兩個特征光譜：激發(fā)光譜發(fā)射光譜（1）激發(fā)光譜：以激發(fā)光波長為橫坐標熒光強度為縱坐標熒光強度隨激發(fā)光波長的變化（2）熒光光譜：以熒光的發(fā)射波長為橫坐標熒光的發(fā)光強度為縱坐標熒光物質(zhì)的入ex,man和入皿m

4、ax是鑒定的依據(jù)，也是定量的依據(jù)，（3）特點：（4）紫外光譜：紫外光的吸收度熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜兩者相似，因吸收了紫外線才能發(fā)射熒光激發(fā)光譜與紫外吸收相似，但不完全重疊熒光光譜與激發(fā)光譜相比在長波長處熒光光譜的吸收峰只有一個，且與激發(fā)光波長無關(guān)。激發(fā)光譜與熒光光譜呈鏡像關(guān)系，例蒽的激發(fā)光譜與熒光光譜（在高分辨的熒光光譜圖上）激發(fā)光譜 a峰：分子基態(tài)S-S2*b峰分子基態(tài)卜虧的 2為不同的能級）峰相當于bo的躍遷線bi峰相當于E躍遷線熒光光譜：C峰：分子從第一電子激發(fā)態(tài)的振動能級基態(tài)躍遷至電子基態(tài)的不同振動能級而形成Co峰一Co躍遷線ci峰一q的躍遷線3、熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（1）產(chǎn)生過程：學習好

5、資料-.歡迎下載分子吸收光子，由基態(tài)一第一電子激發(fā)態(tài)或第二激發(fā)態(tài)一通過無輻射躍遷回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級一躍遷到基態(tài)的各振動能級一發(fā)出熒光一通過無輻射躍遷回到基態(tài)的最低振動能級產(chǎn)生熒光的必要條件分子吸收光能量(紫外一可見吸收強)，產(chǎn)生躍遷(n口 x躍遷弱，所以引起的熒光極弱)吸收后必須具有較高的熒光效率，才能產(chǎn)生熒光物質(zhì)分子不是吸收熒光紫外光量子，即能夠發(fā)射一個熒光量子。物質(zhì)發(fā)射熒光的量子數(shù)與所吸 收的激發(fā)態(tài)量子數(shù)的比值，稱為熒光效率或熒光量子產(chǎn)率中f=發(fā)出熒光的量子數(shù)/吸收激發(fā)光的量子數(shù)熒光強度與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系(內(nèi)部因素)長共靴結(jié)構(gòu)口 一口 x躍遷產(chǎn)生強K帶紫外吸收。門電子共靴越長，入和

6、入 將長移。F、中f將增大分子的剛性結(jié)構(gòu)和共平面效應(yīng)分子的剛性結(jié)構(gòu)和共平面效應(yīng)增大，中f增大，且A em長移。例：取代基a、增加分子的電子共靴程度，中f增大，A em長移的基團NH2, oh, OCH3, -nhr, NR2, -cn 等b、減弱分子的/電子共靴程度，中f減小，甚至熒光卒滅的基團-COOH, NO2, -C=o, -no, -SH, NHCONH3, -F, -Cl，-I,-Br 等c、對分子I的口電子共靴作用小，對熒光影響不明顯。-r, SO3H, NH3+等4、影響熒光強度的外部因素溫度：溫度增大，中f小，碰撞幾率大，分子運動速度增大，無輻射躍遷增大，溶劑：a,極性大，中f

7、大。紅移所以極性溶劑中， E_n x減小。b、粘度大，中f大，粘度小，分子碰撞幾率增大，所以中f小PH值的影響：對弱酸和弱堿的熒光物質(zhì)影響大。PH值不同，離子電離結(jié)構(gòu)不同。如：熒光熄滅劑：使中f減小或熒光強度與濃度不呈線性關(guān)系。常見的熄滅劑有：鹵素離子、重金屬離子，氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基混 合物。原因：分子碰撞；產(chǎn)生無熒光的配合物；I、Br溶解O2使易發(fā)生體系跨越至三線態(tài)； 散射光干擾2a、容器表面：方形影響小，原形影響大?？赏ㄟ^調(diào)整狹縫減小散射。b、丁達爾散射：膠體顆粒產(chǎn)生的散射可盡量除去膠體顆粒；脫氣c、瑞利散射：瑞利光波長=激發(fā)光波長學習好資料-.歡迎下載分子吸收光子

8、后，由基態(tài)較低振能級一較高能級，并在極短的時間內(nèi)返回原來的能級，釋放出與激 發(fā)光相同波長的光線。d、拉曼散射分子吸收光子，基態(tài)較低振動能級一較高能級一回到稍高或稍低與原能級的振動能級。拉曼光波長。激發(fā)光波長可通過減小狹縫加強濾光片選擇激發(fā)波長來減小拉曼光的干擾。氫鍵的影響與溶劑或其它溶液分子產(chǎn)生氫鍵，對熒光光譜和熒光強度有顯著的影響表示活性劑的影響增溶、增穩(wěn)、表面活性劑濃度增大一膠束一對熒光分子有遮蔽作用。一減小分子碰撞幾率一保護激發(fā)單線態(tài)熒光分子一提高中f自卒滅熒光物質(zhì)濃度過大，1g/l產(chǎn)生的熒光含被分子吸收。使熒光強度減小，發(fā)生濃度卒滅5、熒光強度與濃度的關(guān)系定量關(guān)系F怵(I0-It)F:

9、熒光強度。(10-七)：被吸收的光強度即 F= (I0-It) -KzK常數(shù)，取決于中f根據(jù)Beer定律：It/Io=1O-eci即：F= K Io(1-1O-eci)= K Io(1-e-2.3Ecl)=K Io2.3Ecl-(-2.3Ecl)/2!-(-2.3Ecl)2/3!-(-2.3Ecl)n/n!當Ecl 0.05時，即稀溶液F=K I02.3Elc=KC所以濃度低時，F(xiàn)與C成線性關(guān)系。靈敏度高可通過放大檢測信號，增加激發(fā)光強度，通過靈敏度。而吸收光譜：A=-lgIt/IIt/I0為比值，無法放大”定性、定量分析定性分析：依據(jù)激發(fā)光譜中地峰位鑒定物質(zhì)。注意：影響因素多，測到地只是表觀

10、光譜圖，須校正。一般用對照品對照定量分析方法：工作曲線法比例法(標準曲線過原點)Fs-F =KCs0F樣-F0=KC樣F0:空白溶液熒光強度多組分測定：與紫外分光光度法定量分析用6熒光分光光度計主要部件激發(fā)光源：疝燈（多用）：連續(xù)光源汞燈：發(fā)射線光譜，產(chǎn)生不連續(xù)地一定波長地光另外：氘燈、鹵鎢燈等單色器：激發(fā)單色器（光源與樣品之間）發(fā)射單色器（樣品與監(jiān)測器之間）熒光計：慮光片熒光分光光度計：光柵作色散元件吸收池：石英檢測器：光電倍增管光電二極管陣列檢測器：迅速、瞬時測定熒光光譜（2）類型熒光計熒光分光光度計（3）校正（4）波長校正用汞燈地標準譜線對單色器地波長刻度進行校正靈敏度：影響因素較多a光

11、源強度穩(wěn)定度單色器地性能b波長、狹縫c空白溶液、拉曼散射、激發(fā)光、雜質(zhì)熒光常用：硫酸奎寧溶液作為標準溶液進行校正光譜校正雙光束熒光分光光度計，參比光束抵消光學誤差7熒光分析新技術(shù)（1）激發(fā)熒光分析：光源:激光、波長純，強度大檢測靈敏度高，樣品量1ul最小可測10T6g測量生化樣品、氣體樣品及有機化合物中地自由基（2） 同步熒光分析靈敏度高在熒光物質(zhì)地激發(fā)光譜和發(fā)射光譜中選擇適宜地波長差值入，同時掃描熒光發(fā)射波長和激發(fā) 波長，得同步熒光光譜。Fsp（A em,A ex）=KCFexFem（3）膠束增溶增敏熒光分析加入增溶增敏試劑，如表面活性劑：SDS,CTMAB,CPB,PVA,Triton*1

12、00 等環(huán)糊精：a CD，P CD，y -CD 等表面活性劑在臨界膠束濃度時，相差疏水基向里，親水基向外得具有一定大小內(nèi)腔得膠束，增 溶、增敏其用于熒光分析，不僅提高了靈敏度、選擇性且可在分子水平模擬生物體系細胞膜結(jié)構(gòu)。對藥 物在體內(nèi)的分布和作用機理進行研究。（4）反相膠束增敏熒光分析法形成親水基向里，疏水基向外的微囊今年來在膜的模擬化學、蛋白質(zhì)液一液萃取，膠束催化，超細納米材料制備，有毒物質(zhì)降解、學習好資料-.歡迎下載醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域有重要應(yīng)用。時間分辨熒光分析根據(jù)分子熒光壽命不同，在激發(fā)與檢測之間間隔一定時間，使不同分子達到分別檢測，從而可 以消除共存組分的干擾。將其用于免疫分析，“時間分辨熒光免疫分析儀“技術(shù)研究新進展。標記免疫分析與臨床，1995，vol2(1