實驗二蛋白質(zhì)定量測定

1、分光光度法1(一)基本原理分光光度法是利用物質(zhì)對某種波長的光具有選擇性吸收的特性建立起來的鑒別物質(zhì)或測定其含量的一項技術(shù)。Lambert-Beer定律，吸光度與溶液的濃液成正比，與光束通過溶液的距離(即光程)成正比，用數(shù)學表達式表示為： A=KLCC：物質(zhì)的濃度，L：光程（cm），K為吸光系數(shù)或消光系數(shù)。2（二）待測溶液的濃度計算1、利用標準管法計算待測溶液的濃度：2、利用標準曲線進行換算：3、利用吸光系數(shù)（消光系數(shù)）求出待測溶液的濃度。3根據(jù)Lambert-beer定律： 標準管：As=KLCs (下標S：標準液) 待測管：Ax=KLCx (下標X：待測液)L相等，溫度相同，測定同一物質(zhì)，所

2、用單色光相同，則K相同，則： As/Ax=Cs/Cx即Cx=Ax/AsCs在實際操作中，常使待測管體積與標準管體積相等(以X代表測定管含量，S代表標準管含量)則： X=Ax/AsS計算待測溶液濃度時，可根據(jù)測定時實際吸取的標準液的體積(Vs)和待測樣品的體積(Vx)，將上式演變?yōu)椋?待測溶液濃度：Cx=Ax/AsCsVs/Vx利用標準管法計算待測溶液的濃度4利用標準曲線進行換算 1標準曲線的作用 (1) 又叫做校正曲線或工作曲線。從濃度一光密度直線的直線特性，判斷所采用方法的呈色反應(yīng)是否符合lambertBeer定律。 (2)作多次平行測定繪制標準曲線，可判斷在整個測定過程中操作、儀器等誤差的

3、大小，確定該測定方法的可靠性。 (3)從繪制標準曲線的斜率可以比較各種方法的靈敏度。 (4)大批樣品分析時，省略多次計算，從光密度值直接查閱標準曲線而求得被測物質(zhì)的濃度。標準曲線的繪制52標準曲線的作法(1) 標準液濃度的選擇：標準液濃度選擇一般應(yīng)能包括待測樣品的可能變異最低與最高值，一般選擇5種濃度。濃度差距最好是成倍增加或等級增加。(2) 標準液的測定：在比色時，讀取光密度至少讀2-3次，求其平均值，以減少儀器不穩(wěn)定而產(chǎn)生的誤差。(3) 標準曲線圖的繪制：一般常用光密度一濃度標準曲線。6【操作】73、標準曲線圖的繪制 用普通方格紙作圖。圖紙長寬=11或長寬=32，以橫軸為濃度，縱軸為光密度

4、。繪制標準曲線時，將各座標點和原點連成一條線。若各點不在一直線，則可通過原點，盡可能使直線通過更多點，使不在直線上的點盡量均勻地分布在直線的兩邊。座標紙上注明：測定物及測定方法的名稱，儀器型號、波長及繪制的日期、室溫。8標準曲線根據(jù)Lambert-Beer定律， A與C成正比配制一系列標準液C1、C2、C3，在max下，測相應(yīng)的A1、A2、A3。實驗項目,儀器型號,波長,日期,室溫.mg/ml9利用吸光系數(shù)（消光系數(shù)）求出待測溶液的濃度根據(jù)Lambert-Beer氏定律：A=KLC若C為1%（g/ml），L為1cm，此時的K值稱為百分吸光系數(shù)用E1%1cm表示.即：C=A/E1%1cm若C為1

5、mol/L，L為1cm，其K值稱為摩爾吸光系數(shù)，用表示即； C=A/10(三)波長的選擇11最大吸收峰的波長(max) 根據(jù)三個原則： 1.被測溶液有適當?shù)墓饷芏?，適當?shù)墓饷芏葹?.1- 0.7，以0.2- 0.6最理想。 2.應(yīng)使干擾影響降低至最低限度。 3.應(yīng)使標準曲線在盡可能大的范圍內(nèi)接近直線。12蛋白質(zhì)定量分析技術(shù)13雙縮脲法紫外分光光度法BCA（二喹啉甲酸）法Lowry法(Lowry改良法)考馬斯(Comessie)亮蘭結(jié)合法凱氏定氮法14雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量15雙縮脲(NH2CONHCONH2)在堿性溶液中與硫酸銅反應(yīng)生成紫紅色化合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有許多肽鍵(-CONH-)在堿性溶液中也能與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色化合物。在一定范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。操作簡便、迅速、受蛋白質(zhì)種類性質(zhì)的影響較??；靈敏度較差，特異性不高。-CONH2、 -CH2NH2、 -CS-NH2等基團也有此反應(yīng)?！驹怼?6【操作】17【結(jié)果】(一)在座標紙上以光密度為縱座標，以蛋白質(zhì)濃度為橫座標繪制標準曲線。(二)從標準曲線中查出待測血清樣本的蛋白質(zhì)濃度(g/L)，并求出人血清樣本的蛋白質(zhì)濃度。(三)從標準管中選擇一管與測定管光密度相接近者，求出人血清樣本的蛋白質(zhì)濃度(g/L)。18原始數(shù)據(jù)記錄日期，室溫實驗項目19實驗報告1、