抗氧化酶SOD、POD、CAT活性測定方法

1、 抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性測定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定（氮藍四唑光化復原法）1、試劑的配制1）005mol/L磷酸緩沖液（PBS，pH7.8）:母液：02mol/L磷酸氫二鈉溶液：取Na2HPO412H2O（分子量35814）717g；母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO42H2O（分子量15601）312g。分別用蒸餾水定容到1000ml。005mol/LPBS（pH78）的配制：分別取A母液（Na2HP04）22875ml,B母液（NaH2PO4）21.25ml,用蒸餾水定容至1000ml。參照文件：李合生主編：植物生理生化實驗原理和技術(shù)高等教

2、育第一版社，2000：267268。2）145mM甲硫氨酸溶液：取21637gMet用磷酸緩沖液（pH78）定容至1000ml。（3）30uMEDTA-Na溶液：取0.001gEDTA-Na用磷酸緩沖液定容至100ml。22（4）60uM核黃素溶液：取00023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml,避光保留。5）225mM氮藍四唑（NBT）溶液：取01840gNBT用PBS定容至100ml,避光保留。酶液制備：取02g（可視狀況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預冷的研缽中，加入1.6ml50mmol/L預冷的磷酸緩沖液（pH78）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4C、12000g下離心

3、20min,上清液即為酶液。2、酶活性測定1）反響混淆液配制（以60個樣為準）：分別取Met溶液162ml,EDTA-Na溶液06ml,2磷酸緩沖液5.4ml,NBT溶液6ml,核黃素溶液6ml,混淆后搖勻；（2）分別取3ml反響混淆液和30ul酶液于試管中光照下反響（3）將試管置于光照培育箱中在4000lux同時做兩支比較管，此20min；中后測定作為最大光復原管，1支試管取3ml反響混淆液加入30u1PBS（不加酶液）照光1支只加緩沖液置于暗中測準時用于調(diào)零。（4）以不照光的比較管（只有緩沖液并置于暗處）調(diào)零后，避光0D560（出現(xiàn)顏色即測可測定）?？寡趸窼OD、ODCA活性測定方法 酶

4、活性計算：SOD活性單位以克制NBT光化復原50%所需酶量(測的樣品值要在最大管的一半左右才適合，不然要調(diào)整酶量)為1個酶活單位(u)。SOD總活性=(Ack-AE)XV/(1/2AckXWXVt)SOD比活力=SOD總活性/蛋白質(zhì)含量SOD總活性以鮮重酶單位每克表示(u/gFW)；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；A為照光比較管的吸光度；A為樣品管的吸光度；V為樣品液整體積(ml,16ml,加入PBS的體積)；Vt為測準ckE時的酶液用量(ml,30ul)；W為樣品鮮重(g,測準時應換算為葉綠體的質(zhì)量mg)；蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。二、POD、CAT酶活性的測定粗酶液制備同SOD。1、過氧

5、化物酶(POD)活性測定(愈創(chuàng)木酚法)試劑配制：0.2mol/L磷酸緩沖液(pH60)：分別取A母液(Na2HP04)123ml和B母液(NaH2P04)877ml混勻即為1000mlPBS(0.2M,pH6.0)；反響混淆液配制(以60個樣為準)：取200mlPBS(02M,pH60),加入0076ml液體(原液)愈創(chuàng)木酚(2-甲氧基酚)加熱攪拌溶解，冷卻后加入0.112ml30%的H0,混勻后保留于冰箱中備用。22樣品測定：要保證每個樣品從加好樣到開取3ml反響液并加入30ul酶液，以PBS為比較調(diào)零，爾后測定OD470值(測定40秒)。邊加樣邊測定,測定前等候5秒,動作要快,假如慢的話,

6、始記時的時間相差不大)(4)酶活性計算：以每minOD值變化(高升)001為1個酶活性單位(u)。POD=(A470XVt)/(WXVsX001Xt)(u/gmin)A470：為反響時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反響時間(min)；Vt為提取酶液整體積(ml,(16ml)；Vs為測準時取用酶液體積(ml,30ul)。2、過氧化氫酶(CAT)活性測定1)試劑配制：0.15mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)：取A母液(Na2HP04)4575ml和B母液(NaH2P04)2925ml混淆后用蒸餾水定容至1000ml。(2)反響液配制：取200mlPBS(015M,pH7.0)，加入0

7、3092ml30%的H0(原液)搖勻22即可。測定(3)樣品測定：取3ml反響液加入0.1ml(可視狀況調(diào)整)酶液，PBS為比較調(diào)零，0D240(紫外)(測定40s)。(4)酶活性計算：以每min0D值減少0.011個酶活性單位u)為(CAT=A240XVtX(u/gmin)(/WXVsX0.01t)A240：為反響時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；為反響時(min)；為提t(yī)間Vt取酶液整體積ml，1.6ml)；Vs為測準時取用酶液體積(ml,0.1ml)。四、超氧陰離子自由基(02.-)產(chǎn)生速率的測定(羥胺氧化法)21、試劑的配制(1)1mM鹽酸羥胺溶液：稱取0.02085g鹽酸羥胺用

8、蒸餾水定容至300ml；(2)17mM對氨基苯磺酸溶液：稱取1.1776g對氨基苯磺酸用少許冰醋酸水溶液(冰醋酸：水=1：3配制)加熱溶解后定容至400ml；(3)7mMa-萘胺溶液：稱取0.4008ga-萘胺用冰醋酸水溶液(冰醋酸：水=3：1配制)定容至400ml。2、02.-含量的測定2(1)樣品液提取方法同SOD測定；(2)取05ml提取液(酶液)(可視狀況調(diào)整用量)中加入05mlPBS(005M,pH7.8),1ml1mM鹽酸羥胺溶液后搖勻。3)在25C下保溫1小時；抗氧化酶SOD、ODCA活性測定方法9 #4）挨次先加入1ml17mM對氨基苯磺酸，再加入1ml7mMa-萘胺，混淆后迅

9、速搖勻；5）在25C下保溫20min后在3000Xg下離心3min后立刻進行測定（或置于冰箱待測）6）以比較管調(diào)零（用水調(diào)零），取粉紅色水相液測定OD530值（測定）；依據(jù)羥胺與02.-2（7）0-含量的計算：由測得的0D530,查N0-標準曲線獲得N0-；222抗氧化酶SOD、ODCA活性測定方法抗氧化酶SOD、ODCA活性測定方法 .-的反響式：NH20H+202-+N02-+H202+H20計算02.-,即NO2X2=O再H依據(jù)樣品與羥胺反響的時間和樣品中的蛋白質(zhì)含量，求得0-產(chǎn)生速率(以nmolmirnmg-i2蛋白表示，也能夠nmolmin-ig-i鮮重表示)。1-10產(chǎn)生速率=(C

10、XV)/(tXW)(nmolming鮮重)2(umol/L)；V為測準時所取提取液用量(葉綠體稀釋后的C為標準曲線上查得的濃度體積);t為反響時間(60min)；W為樣品鮮重(葉綠體實質(zhì)質(zhì)量g)參照文件：信，羅廣華植物生理學通1990,(6)：5557五、丙二醛含量的測定1、試劑配制：10%TCA：100g三氯乙酸-IL0.67%TBA：335g硫代巴比妥-500ml10%TCA(避光)酸2、測定步驟開水0.2樣品+16ml10%TCA研磨f12000g離10min-上1.5ml+1.50.67%TBA清煮30min-冷卻，離心上清0D450,0D532,0D6003、計算組織中MDA含量:M

11、DA濃度C(umol/L)=645(0D5320D600)0.560D450MDA含量(umol/gFW)二CXV/W式中V為提取液體積(1.6ml),W為樣品鮮重(02g)六、植物細胞質(zhì)膜透性的測定(電導儀法)1)取新鮮葉片或根系(不可以萎蔫)0.3g，用自來水沖刷表面污漬，再用去離子水沖刷幾遍后用吸水紙吸干水分；(2)樣品剪碎(也可打孔取樣)放入試管(或15ml大離心管)中，加10ml去離子水，在室溫下擱置3h使葉片充足吸水后測定溶液電導率(R1)；3)再放入恒溫水浴鍋中在100C開水浴中煮20min以殺死葉片組織，用冷水冷卻到室溫后測定溶液電導率(R2)；4）用公式計算質(zhì)膜相對透性（用相

12、對電導率表示）：相對電導率（）=R1/R2X100%還能夠計算植株損害程度：100%損害率二（辦理電導率一比較電導率）/（煮沸電導率一比較電導率）X七、可溶性蛋白含量的測定（考馬斯亮藍染色法）1、試劑的配制（1）考馬斯亮藍溶液配制：稱取100mg考馬斯亮藍，溶于50ml90%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，再用蒸餾水定容到1L。在留宿后過濾并貯于棕色瓶中，常溫可在暗中保留一個月。（2）100ug/ml牛血清蛋白（BSA）標準溶液：稱取25mgBSA加水溶解后定容至100ml（也可取10mgBSA定容至100ml再從中汲取40ml用蒸餾水定容至即為標準BSA溶液）。2、樣品可溶性蛋白含量的測定（1）樣品可溶性蛋白含量測定：取磷酸緩沖液（即稀釋成響2min后測OD595（以100口緩沖液加100ml，100u