生姜拮抗性內(nèi)生細(xì)菌的篩選

1、生姜拮抗性內(nèi)生細(xì)菌的篩選生細(xì)菌資源開發(fā)抑菌新藥物提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1材料從樂山各市場購買市售食用生姜。1.2靶標(biāo)菌：、B.subtilis、MRSA，由本校病理實驗室提供。1.3培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（分離純化培養(yǎng)基）：馬鈴薯200g,葡萄糖5g，瓊脂粉16g，純凈水1000mL，pH自然4。馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）（拮抗篩選培養(yǎng)基）：馬鈴薯200g,削皮煮汁，葡萄糖5g,瓊脂粉20g,水1000mL,pH7.05。1.4生姜內(nèi)生菌的分離純化生姜的表面消毒：取無病無霉變的完整生姜塊根（約30g），用自來水沖洗5min，沖洗表面的泥土等污物，放于已滅菌的培養(yǎng)皿中，無菌水反復(fù)沖洗3

2、-5次，5%次氯酸鈉洗滌3次，無菌水沖洗3-5次，收集最后一次沖洗液做無菌檢驗6。分離純化：在無菌條件下，分別用滅菌后的解剖刀切割表面消毒完全的生姜塊根成直徑為0.5cm方形的小塊，用無菌鑷子將姜塊放于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上不同的地方，每個平板均勻擺放3-4塊，置于28C培養(yǎng)，每隔12h觀察一次，培養(yǎng)23d時間。待培養(yǎng)皿上出現(xiàn)單菌落時，根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色、大小將其分類后采用平板劃線法接種到新鮮平板上培養(yǎng)，直到獲得單菌落為止7-8,純化后的菌株保存于斜面中備用。1.5平板對峙法初篩內(nèi)生細(xì)菌活化后涂布接種在平板上培養(yǎng)24h后，在無菌條件下用0.5cm打孔器制打成菌餅9-10,將菌餅放置于涂布接種有

3、四種靶標(biāo)菌的平板上，28C培養(yǎng)，每隔12h觀察一次，培養(yǎng)48h后用十字交叉法測定抑菌圈的大小1112，每處理重復(fù)三次，以無菌的培養(yǎng)基打孔代替菌餅做為對照（CK）13。相對抑菌率（%）=（抑菌圈直徑菌餅直徑）/菌餅直徑X100%。1.6牛津杯法復(fù)篩直接垂直插上已滅菌的牛津杯，輕輕加壓（注意不能與培養(yǎng)皿底部接觸）14，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，每個平板插4個牛津杯，將初篩中有拮抗活性的菌株菌懸液100uL加入到牛津杯中，置28C培養(yǎng)48h15,十字交叉法測量抑菌圈直徑大小，記錄數(shù)據(jù)。每種處理重復(fù)三次，以向牛津杯中加入100uL的無菌水代替菌懸液做為對照（CK）。相對抑菌率（%）=（抑菌圈直徑菌餅直徑

4、）/菌餅直徑X100%。2結(jié)果與分析2.1生姜內(nèi)生細(xì)菌的分離純化通過反復(fù)分離純化，并按照菌落、菌株形態(tài)、大小、顏色等特征進行區(qū)分，共獲得9株可培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌，依次編號為SJ1SJ9。2.2拮抗菌株的初篩對分離純化得到的9株生姜內(nèi)生菌菌株進行了皿內(nèi)對峙法拮抗試驗，9個菌株均具有不同程度的抑菌效果，其中有7個菌株對四種病原細(xì)菌的抑菌圈直徑均大于12.5mm,相對抑菌率均超過150%。對初篩得到的7個菌株進行牛津杯法復(fù)篩，結(jié)果表明7個菌株對四種病原細(xì)菌都有不同程度的抑菌效果，其中SJ1和SJ9的抑菌效果比較明顯,對四種病原細(xì)菌的抑菌圈直徑超過13mm,相對抑菌率超過170%（表2）。3結(jié)論與討論3.

5、1因生姜內(nèi)生細(xì)菌大多數(shù)具有抑菌作用，其中SJA和SJI抑菌圈的直徑大于等于13.7mm,具有較強的抑菌效果。在初篩過程中SJA對大腸桿菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈大小依次為：13.8mm、14.5mm、13.7mm、13.3mm。在復(fù)篩過程中SJA對大腸桿菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑菌圈的大小依次為：13.7mm、13.7mm、13.7mm、13.8mm。在初篩過程中SJI對大腸桿菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑菌圈的大小依次為：13.1mm、12.7mm、13.4mm、13.2mm.在復(fù)篩過程中SJI對大腸桿菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、枯草

6、芽孢桿菌抑菌圈的大小依次為13.7mm、13.8mm、13.8mm、13.6mm。3.2本試驗中，判斷抑菌作用強弱的是抑菌圈的大小，此方法具有一定的局限性，通常只能定性判斷內(nèi)生細(xì)菌對靶標(biāo)菌有無抑菌效果，不能確定內(nèi)生細(xì)菌抑菌的機制。3.3生姜內(nèi)生細(xì)菌大多數(shù)具有很強的抑菌效果16，在醫(yī)學(xué)方面新藥的研發(fā)具有很高的研究價值，是一種重要的天然來源。3.4本試驗只是對生姜莖的內(nèi)生細(xì)菌進行了分離和篩選，而葉等器官沒有進行內(nèi)生細(xì)菌的分離和篩選，還等進一步進行研究。3.5本次試驗中，SJ1和SJ9初篩和復(fù)篩過程中抑菌圈大小存在差異，二者之間是否存在一定的聯(lián)系還不確定【參考文獻】劉杰鳳，周天,王穎等小白菜內(nèi)生菌的

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