《細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)》課件凍存細(xì)胞

1、哺乳動物細(xì)胞冷凍保存 哺乳動物細(xì)胞冷凍保存主要目的：（1）保存種子細(xì)胞，以便隨時取用。這是保存細(xì)胞的最主要目的。（2）減少細(xì)胞被微生物污染的危險性。（3）減少細(xì)胞之間交叉污染的危險性。（4）減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變。（5）避免有限細(xì)胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。冷凍保存要點(diǎn)：（1）冷凍過程要緩慢。（2）凍存細(xì)胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90，無微生物污染。（3）細(xì)胞濃度控制在：11075107/ml。（4）使用高濃度血清或蛋白保護(hù)劑。一般情況下，用于冷凍保存完全細(xì)胞生長培養(yǎng)液中血清濃度大于20。（5）使用合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑，以保護(hù)細(xì)胞在冷凍過程中免受冰晶破壞。 細(xì)胞冷凍保存液

2、主要成分：冷凍保護(hù)劑，血清或蛋白，基礎(chǔ)培養(yǎng)液， 。 DMSO ：血清：1640 =1：2：7常用細(xì)胞冷凍保存液：（1）10DMSO 完全細(xì)胞生長培養(yǎng)液（20血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液）（2）10甘油 完全細(xì)胞生長培養(yǎng)液（20血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液），1:9(和生長液的比例）目前，最常用的冷凍保護(hù)劑是DMSO(二甲基亞砜)，使用終濃度為510。但是，有些細(xì)胞系不能用DMSO作為冷凍保護(hù)劑，如人白血病細(xì)胞系HL-60。因為，DMSO 能誘導(dǎo)HL-60 細(xì)胞分化。在這種情況下，可選用其它冷凍保護(hù)劑，如甘油（glycele）,羥乙基淀粉等。細(xì)胞冷凍保存操作程序： 傳代后放入離心管的細(xì)胞懸液。離心1000rpm 10分鐘。

3、 棄上清，加入保存液（ DMSO ：血清：1640 =1：2：7）（已備=1.8ml），混勻，移入凍存管，蓋好蓋，封口膜封口。需要冷凍保存的細(xì)胞先在4冰箱中放置3060 分鐘；然后轉(zhuǎn)入-20，放置30 分鐘；然后再轉(zhuǎn)入-80放置1618 小時（或過夜）；最后放入液氮中長期保存。有條件的地方，可用程控降溫儀，按每分鐘-1 到-3速度降溫，一直到-80以下，然后直接放入液氮中長期保存。特別注意(1)：（1）細(xì)胞在冷凍過程中在-20冰箱內(nèi)放置時間不可超過1 小時，以防止冰晶過大而破壞細(xì)胞。也可跳過-20這一步驟直接放入-80冰箱中，但這樣做細(xì)胞存活率要低一些。（2）DMSO 稀釋時會釋放大量熱量。因此，DMSO 不能直接加到細(xì)胞液中，必須事先配制。（3）DMSO 必須是細(xì)胞培養(yǎng)級別的。新買的DMSO 本身處于無菌狀態(tài)，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管或瓶中，4保存。避免反復(fù)凍融造成DMSO 裂解產(chǎn)生有害物質(zhì)。并可減少污染機(jī)會。如要過濾DMSO，必須選用耐DMSO 的尼龍濾膜。