《環(huán)境微生物檢測》教學課件

1、第11章 環(huán)境微生物檢測1h第1頁，共51頁。11.1 空氣中微生物的檢測與控制11.1.1 空氣中微生物的檢測方法 (1)撞擊法 撞擊法是采用撞擊式空氣微生物采樣器，通過抽氣動力作用，使空氣通過狹縫或小孔而產(chǎn)生高速氣流，使懸浮在空氣中的帶菌輪子撞擊到轉(zhuǎn)動的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上。經(jīng)37、48h培養(yǎng)，計算出每立方米空氣中所含的細菌菌落數(shù)。2h第2頁，共51頁。3h第3頁，共51頁。 (2) 自然沉降法 自然沉降法是靠重力的作用將空氣中攜帶微生物的懸浮顆粒沉陷到直徑9cm的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上，經(jīng)37，48h培養(yǎng)后計生長的細菌菌落數(shù)。4h第4頁，共51頁。 由于沉降法是被動采樣，會造成很大的誤差。

2、通過前蘇聯(lián)奧梅梁斯基公式換算出。5h第5頁，共51頁。 通常設(shè)置5個采樣點，即室內(nèi)墻角對角線交點為1個采樣點，該交點與四墻角連續(xù)的中點為另外4個采樣點。采樣高度為1.21.5m。采樣點心遠離墻壁1m以上，并避開空調(diào)、門窗等空氣流通處。檢測點數(shù)越多越準確，以2030個測點數(shù)為宜，最少測點數(shù)為56。6h第6頁，共51頁。(3)過濾法 過濾法是在負壓下抽濾空氣，使空氣通過經(jīng)滅菌的微孔濾膜，空氣中細菌被截留在膜上，然后將膜轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上，使濾膜與培養(yǎng)基完全貼緊，倒置于37恒溫箱培養(yǎng)24h。通過計平板上的菌落數(shù)，測定空氣中細菌的數(shù)量。7h第7頁，共51頁。 空氣中微生物總數(shù)目前用CFUm3，計量。即每立

3、方米空氣落下的細菌數(shù)，一般以室內(nèi)空氣中細菌總數(shù)5001000 CFUm3以作為空氣污染指標。8h第8頁，共51頁。11.1.2 空氣微生物污染的控制 控制空氣微生物污染，必須減少空氣中微生物的來源，特別是微生物污染嚴重的醫(yī)院，肉類加工等行業(yè)廢水廢物的處理消毒工作；搞好室內(nèi)外環(huán)境衛(wèi)生。減少微生物滋生；綠化造林也是凈化市氣、除塵、殺菌和吸收有害氣體的重要途徑；另外空氣消毒和空氣凈化器對凈化空氣也起一定的作用。9h第9頁，共51頁。日本建議的評價空氣清潔程度的標淮見表10h第10頁，共51頁。11.2 水的微生物檢測及控制11.2.1 水質(zhì)的細菌學檢測 我國生活飲用水衛(wèi)生標準GB5749-85關(guān)于飲

4、用水中的細菌標準與大腸菌群數(shù)量標準為1細菌總數(shù)100個/ml2大腸菌群 3 個/L11h第11頁，共51頁。一、傷寒桿菌病癥：傷寒或副傷寒。表現(xiàn)：持續(xù)發(fā)燒，牽涉到淋巴組織，脾臟腫大，軀干上出現(xiàn)紅斑，胃腸壁潰瘍產(chǎn)生腹瀉。 傷寒沙門氏菌12h第12頁，共51頁。二、痢疾桿菌痢疾桿菌可引起細菌性痢疾(與阿米巴痢疾不同)，癥狀為急性腹瀉，通常大便中有血及粘液，某些病例中有發(fā)燒。13h第13頁，共51頁。三、霍亂弧菌病癥：霍亂癥狀：輕型病例中，只造成腹瀉。 在較嚴重或較典型的病例中，除腹瀉外，癥狀還包括嘔吐、“米湯樣”大便、腹疼和昏迷等。病程短，嚴重的常常在癥狀出現(xiàn)后12h內(nèi)死亡。電鏡照片使用的是結(jié)晶紫

5、單染色，若革蘭氏染色則為陰性紅色14h第14頁，共51頁。四、寄生蟲真菌一般通過接觸傳染，不通過水傳播，引起疾病的原生動物和小型后生動物也由水傳播，通常稱為寄生蟲。在目前發(fā)現(xiàn)的幾千種原生動物中只有20種能引起人類疾病傳播方式：除了飲水不衛(wèi)生外，更多的是通過食物以及昆蟲血液傳播如瘧疾是蚊子傳播，食用生肉感染肉類寄生蟲等15h第15頁，共51頁。11.2.2 水質(zhì)指示微生物大腸菌群 大腸菌群是人腸道中正常的寄生菌，是一群需氧和兼性厭氧的，能在37，24h內(nèi)使乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性無芽孢桿菌，又稱總大腸菌群。 大腸菌群作為水體被糞便污染的指標，也是飲水、食品等的細菌學常規(guī)檢驗指標之一，通常用“大

6、腸菌群指數(shù)”和“大腸菌群值”表示。16h第16頁，共51頁。 這些寄生菌通常與人體構(gòu)成互利共生關(guān)系，當人體免疫力下降時，他們則有可能成為引起腸炎的致病菌，他們中的個別變種還會變?yōu)闃O具毒性的病菌。 如大腸埃希氏菌可引起幼兒腹瀉，引起美國和日本傳染病流行的O-157也是大腸埃希氏菌的變種菌株。17h第17頁，共51頁。中國水質(zhì)標準中規(guī)定的大腸菌群數(shù)(個L) 飲用水 3 游泳池水 100 地表水 第一級 500 第二級 10000 第三級 5000018h第18頁，共51頁。11.2.2.1 大腸菌群檢測的目的和原理(一) 生理習性與腸道病原菌類似，即在外界的生存 時間基本一致；（代表性）(二) 在

7、糞便中的數(shù)量較多；（比病原菌多，不會漏 檢）(三)檢驗技術(shù)較簡單;（操作方便）19h第19頁，共51頁。11.2.2.2 大腸菌群的檢測方法 常用的大腸菌群的檢測方法有多管發(fā)酵法與膜濾法。1多管發(fā)酵法（即最大可能數(shù)法， MPN ）發(fā)酵法是大腸菌群測定的國家標準方法。分為三步。A初發(fā)酵目的：水中大腸菌群存在與否的初步判斷。20h第20頁，共51頁。A.初發(fā)酵方法為將水樣置于糖類液體培養(yǎng)基中，在一定溫度下，經(jīng)一定時間培養(yǎng)后，觀察有無酸和氣體產(chǎn)生，即有無發(fā)酵，而初步確定有無大腸菌群存在。如采用含有葡萄糖或甘露醇的培養(yǎng)基，則包括副大腸桿菌；如不考慮副大腸桿菌，則用乳糖培養(yǎng)基。由于水中除大腸菌群外，還可

8、能存在其它發(fā)酵糖類物質(zhì)的細菌，所以培養(yǎng)后如發(fā)現(xiàn)氣體和酸并不一定能肯定水中含有大腸菌群，還需根據(jù)這類細菌的其它特性進行下兩階段的檢驗。21h第21頁，共51頁。試驗中的培養(yǎng)基中加入了酸堿指示劑紫色的溴甲酚紫，產(chǎn)酸時指示劑變黃，同時培養(yǎng)基中口朝下放置了裝滿同樣培養(yǎng)基的小試管，產(chǎn)氣時小試管中會封閉一段氣體，被作為培養(yǎng)中是否產(chǎn)氣的依據(jù)。22h第22頁，共51頁。目的：鑒定產(chǎn)酸產(chǎn)氣菌的染色特征、好氧與否、芽孢特征。根據(jù)：大腸菌群在固體培養(yǎng)基上可以在空氣生長，革蘭氏染色呈陰性和不生芽孢的特性B.平板分離23h第23頁，共51頁。復發(fā)酵在此階段，先將上一試驗產(chǎn)酸的菌種移植于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基(遠藤氏培養(yǎng)基)

9、或伊紅美藍培養(yǎng)基表面（劃線接種是為了分離出單菌落，防治菌落不純干擾結(jié)果），這一步氧氣可以阻止厭氧芽抱桿菌的生長，而上述培養(yǎng)基所含染料物質(zhì)也有抑制許多其它細菌生長的作用。24h第24頁，共51頁。C.復發(fā)酵目的：驗證將可疑的菌落再移植于糖類培養(yǎng)基中，觀察其是否發(fā)酵，是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣，最后肯定有無大腸菌群存在。 對于自來水廠出水，初步發(fā)酵試驗一般都在10個小發(fā)酵管和2個大發(fā)酵管(或發(fā)酵瓶)內(nèi)進行，復發(fā)酵試驗則在小發(fā)酵管內(nèi)進行。根據(jù)肯定有大腸菌群存在的初步發(fā)酵試驗的發(fā)酵管或瓶的數(shù)目及試驗所用的水樣量，即可利用數(shù)理統(tǒng)計原理，查表得出結(jié)果。25h第25頁，共51頁。（2）膜濾法 使用的濾膜是孔徑為0.450

10、.65m的微孔濾膜；轉(zhuǎn)移至伊紅美蘭平板上。26h第26頁，共51頁。11.2.3 水微生物污染的控制 控制水體微生物的污染首先必須從源頭做起，即控制排放廢水，尤其是醫(yī)院廢水等微生物的含量,避免大量有害微生物進入水體； 其次，消除微生物茲生的環(huán)境。凈化水體，對地表水、游泳池水要進行定期檢測，必要時加入消毒劑以殺滅微生物。27h第27頁，共51頁。11.3 發(fā)光細菌的微毒檢測 發(fā)光細菌法是20世紀70年代后期提出的一種微生物檢測環(huán)境水質(zhì)毒性的新方法。發(fā)光細菌法簡便、快速、靈敏、精度高，凡有毒化合物、廢水、廢物的生物毒性均可測定。 發(fā)光細菌法已被中國國家環(huán)境保護總局規(guī)定為測定水環(huán)境急性毒性的國家標準

11、。28h第28頁，共51頁。11.3.1 發(fā)光細菌檢測的原理 細菌的發(fā)光過積是菌體內(nèi)一種新陳代謝的生理過程。菌體含有熒光素、熒光酶、ATP等發(fā)光要素，在有氧條件下通過細胞內(nèi)生化反應而產(chǎn)生微弱熒光。 毒物濃度與菌體發(fā)光強度呈線性負相關(guān)關(guān)系，發(fā)光細菌法就是利用靈敏的光電測量系統(tǒng)測定毒物對細菌發(fā)光強度的抑制程度進而反映環(huán)境中毒物毒性大小，用發(fā)光度表征毒物所在環(huán)境的急性毒件。29h第29頁，共51頁。30h第30頁，共51頁。11.3.2 發(fā)光細菌法檢測的操作 目前國內(nèi)外發(fā)光細菌的測定常用的有兩種方法。 新鮮發(fā)光細菌培養(yǎng)測定法 即將發(fā)光菌接種于液體培養(yǎng)基中，在適當條件下(200.5)振蕩培養(yǎng)到對數(shù)生長

12、期，配制含3NaCl鹽度的適當濃度的菌懸液加入測試管中，再加入待測液，使之與菌液接觸，作用515min后，讀出并記錄對照管和樣品管發(fā)光強度。此法操作較為簡便。31h第31頁，共51頁。 冷凍干燥發(fā)光細菌制劑測定法 即把培養(yǎng)到對數(shù)生長期的發(fā)光細菌，以冷凍干燥法制成干粉劑，使用時加入冷的2NaCl溶液復蘇，使其恢復到原來的生理狀態(tài)和發(fā)光水平，然后用于測定。這是國家標準方法，其優(yōu)點是可實行測定的質(zhì)量控制。凍干粉可長期保藏方便使用，操作簡便，節(jié)約時間。32h第32頁，共51頁。11.3.3 發(fā)光細菌法的應用在水質(zhì)監(jiān)測中的應用在工業(yè)廢水、固體廢物、廢氣的急性毒性檢測中的應用 對重金屬急性毒性效應的測定和

13、評價對化學品的毒性評價和安全性評價 33h第33頁，共51頁。11.4 污染物致突變性檢測（Ames）試驗 該試驗是通過測定有污染物存在時鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)的組氨酸營養(yǎng)缺陷型(his-)菌株發(fā)生回復突變的概率來判斷污染物的致癌、致突變效應。其陽性結(jié)果與致癌物吻合率高達83。 列為評價化學物質(zhì)安全性的首選力法。34h第34頁，共51頁。11.4.1 Ames試驗的原理和方法 鼠傷寒沙門菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，在不含組氨酸的培養(yǎng)基上不能生長。但當受到致突變物作用后，大量細胞在遺傳物質(zhì)的特定座位發(fā)生基因回復突變而成為野生型，能自行合成組氨酸，此時培養(yǎng)物中雖

14、不含組氨酸。組氨酸缺陷型菌株亦能生長并形成菌落。 Ames試驗就是通道在培養(yǎng)物中加入待測物，根據(jù)不含組氨酸的培養(yǎng)基上組氨酸營養(yǎng)缺陷型茵株長出回復突變菌落數(shù)目的多少判斷待測物的致突變性。35h第35頁，共51頁。(1)試驗菌株 采用鼠傷寒沙門菌變異株TA97，TA 98，TAl00，TAl02四種菌種，又增加了TA1535，TA1537，TA1538共七株。36h第36頁，共51頁。(2)試劑 牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基 牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0gNacl 5.0g,水1000mL.pH7.27.4 S9mix 大鼠肝勻漿S9與NADP、G-6-P、KCl、Na2 HPO4、KH2PO4和水配成混

15、合液。37h第37頁，共51頁。(3)菌種鑒定 在試驗之前都要進行全面的生物學特性和敏感性鑒定，符合要求才能使用。脂多糖屏障丟失 判定是否是缺陷型R因子 判斷菌體是否存在或失去了某種 抗藥性質(zhì)粒。紫外線損傷修復缺陷38h第38頁，共51頁。自發(fā)回變回變特性診斷性試驗 組氨酸營養(yǎng)缺陷型(4)操作方法 Ames試驗的典型操作方法有平板摻入試驗和斑點試驗兩種。39h第39頁，共51頁。11.4.2 Ames試驗的應用檢測食品添加劑、化妝品等的致突變性，由此推測其致癌性。檢測水源水和飲用水的致突變性，探索較現(xiàn)行方法更加衛(wèi)生安全的消毒措施。檢測城市污水和工業(yè)廢水的致突變性，結(jié)合化學分析，追蹤污染源，為研

16、究防治對策提供依據(jù)。 40h第40頁，共51頁。檢測土壤、污泥、工業(yè)廢物堆肥、廢物灰燼的致突變性。以防止維系生命的土壤受致突變物污染后，再通過農(nóng)作物危害人類。 檢測氣態(tài)污染物的致突變性，防止污染物經(jīng)出大氣，通道呼吸對人體發(fā)生潛在危害。研究化合物結(jié)構(gòu)與致突變性的關(guān)系。為合成對環(huán)境無潛在危害的新化合物提供型論依據(jù)。41h第41頁，共51頁。檢測農(nóng)藥在微生物降解前后的致突變性，了解農(nóng)藥在施用后代謝過程中對人類有無隱患。 篩選抗突變物，研究開發(fā)新的抗痛藥?？拐T變因素在抗癌作用上至關(guān)重要、隨著遺傳毒理學的發(fā)展，通過篩選已發(fā)現(xiàn)天然食物如蔬菜類、茶葉、中草藥等都員有抗誘變作用。42h第42頁，共51頁。11

17、.5 生物傳感器11.5.1 生物傳感器的定義與分類 傳感器是能感受特定的被測量的物質(zhì)并按照一定規(guī)律將其轉(zhuǎn)換成可用信號的器件或裝置。 生物傳感器是用固定化生物成分或生物體作為敏感元件的傳感器。43h第43頁，共51頁。生物傳感器的分類主要有三種方式。根據(jù)生物傳感器中分子識別元件即敏感元件可分為五類：酶傳感器、微生物傳感器、細胞傳感器、組織傳感器和免疫傳感器。根據(jù)生物傳感器的換能器即信號轉(zhuǎn)換器分類有：生物電極傳感器、半導體生物傳感器、光生物傳感器、熱生物傳感器、壓電晶體生物傳感器等。44h第44頁，共51頁。以被測目標與分子識別元件的相互作用方式進行分類有：生物親和型生物傳感器和代謝型或催化型生

18、物傳感器。 三種分類方法之間互相交義，相互滲透。45h第45頁，共51頁。11.5.2 生物傳感器基本結(jié)構(gòu)和工作原理 生物傳感器通常由敏感元件(生物分子)、轉(zhuǎn)換元件及相應的機械結(jié)構(gòu)和電子線路所組成，它以生物分子所發(fā)生的物理或化學變化轉(zhuǎn)化為相應的電信號予以放大輸出，從而得到檢測結(jié)果。46h第46頁，共51頁。47h第47頁，共51頁。 生物傳感器的工作原理主要有以下幾種： (1)將化學變化轉(zhuǎn)變成電信號 (2)將熱變化轉(zhuǎn)換成電信號 (3)將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?(4)直接產(chǎn)生電信號方式 48h第48頁，共51頁。 11.5.3 生物傳感器在環(huán)境檢測中的應用(1)BOD生物傳感器 應用BOD傳感器完成樣品的測定，一般在1030min，比傳統(tǒng)法的測定時間大為縮短。(2)測定氨生物傳感器(3)亞硝酸鹽生物傳感器 (4)致突變物傳感器(5)急性毒性發(fā)光細菌生物傳感器49h第49頁，共51頁。11.6 PCR