藥物分析學(xué)課件：第16章 抗生素類藥物

1、第十六章 抗生素類藥物的分析 2022/8/41學(xué)習(xí)要求掌握熟悉各類抗生素藥物的有關(guān)物質(zhì)來源、特點(diǎn)和檢查方法?？股仡愃幬锏念愋?、結(jié)構(gòu)、質(zhì)量和穩(wěn)定性特點(diǎn),分析方法了解抗生素藥物的體內(nèi)樣品分析臨床監(jiān)測(cè)應(yīng)用2022/8/42第一節(jié) 概述第二節(jié) -內(nèi)酰胺類抗生素第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素第五節(jié) 抗生素中高分子雜質(zhì)的檢查 內(nèi)容2022/8/43是生物(包括微生物、植物、動(dòng)物)在其生命活動(dòng)中產(chǎn)生的(或并用化學(xué)、生物或生化方法衍生的)、能在低微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物機(jī)能的化學(xué)物質(zhì)的總稱。1. 抗生素（antibiotics）一、概 述 2. 來 源化學(xué)合成半合成生物合成（發(fā)

2、酵）-主要來源ChP2010共收載抗生素類原料藥及其各種制劑近300個(gè)品種。2022/8/44與化學(xué)合成藥物相比，其結(jié)構(gòu)、組成更復(fù)雜，表現(xiàn)為： 1. 化學(xué)純度較低 有三多：即同系物多，如慶大霉素、新霉素、等含有多個(gè)組分；異構(gòu)體多，半合成-內(nèi)酰胺抗生素、氨基糖苷類抗生素具有旋光性，均存在光學(xué)異構(gòu)體，如藥用巴龍霉素為兩個(gè)立體異構(gòu)體巴龍霉素I和巴龍霉素II的混合物；降解物多，如四環(huán)素類存在脫水、差向異構(gòu)體。 2. 活性組分易發(fā)生變異 微生物菌株的變化、發(fā)酵條件改變等均可導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量發(fā)生變化，如組分的組成或比例的改變。 3. 穩(wěn)定性差 抗生素分子結(jié)構(gòu)中通常含有活潑基團(tuán)，而這些基團(tuán)往往是抗生素的活性中心

3、，如青霉素、頭孢菌素類結(jié)構(gòu)中的-內(nèi)酰胺環(huán)，鏈霉素結(jié)構(gòu)中的醛基等均具有穩(wěn)定性差的特點(diǎn)。3. 抗生素的特點(diǎn)一、概 述2022/8/454. 分類一、概 述按來源、作用對(duì)象、作用機(jī)制分類（見書）按化學(xué)結(jié)構(gòu)分類 ：(1) -內(nèi)酰胺類抗生素 (2) 四環(huán)類抗生素 (3) 氨基糖苷類抗生素 氨基環(huán)醇氨基糖氨基糖2022/8/464. 分類一、概 述此外還有： (4) 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 (5) 多烯大環(huán)類抗生素 (6) 多肽類抗生素 (7) 酰胺醇類抗生素 (8) 抗腫瘤類抗生素 (9) 其它抗生素 本章主要討論-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類抗生素的物理化學(xué)性質(zhì)、鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測(cè)定方法與原理。2

4、022/8/47細(xì)菌耐藥性 在長(zhǎng)期的抗生素選擇之后出現(xiàn)的對(duì)相應(yīng)抗生素產(chǎn)生耐受能力的微生物，統(tǒng)稱耐藥菌。細(xì)菌耐藥性(bacterial resistance)又稱抗藥性，是指細(xì)菌產(chǎn)生的對(duì)抗菌藥不敏感的現(xiàn)象，是細(xì)菌自身生存過程的一種特殊表現(xiàn)形式。 1. 耐藥性的種類：固有耐藥性；獲得性耐藥性 2. 耐藥的機(jī)制：產(chǎn)生滅活酶，藥物作用靶位改變；降低膜通透性；影響主動(dòng)流出系統(tǒng)一、概 述2022/8/48采用生物學(xué)法與物理化學(xué)法鑒別：理化方法、微生物法1 官能團(tuán)的顯色反應(yīng)2 UV， IR（多晶現(xiàn)象，對(duì)照品與供試品圖譜或?qū)φ請(qǐng)D譜不一致，最好用相同溶劑同時(shí)重結(jié)晶供試品和對(duì)照品，使處于相同晶型情況下再進(jìn)行測(cè)定）

5、3 色譜法 TLC，HPLC檢查：水分、異常毒性、熱原、細(xì)菌內(nèi)毒素、降壓物質(zhì)等5. 抗生素質(zhì)量分析一、概 述2022/8/49含量/效價(jià)測(cè)定： 微生物法 ：管碟法；濁度法 與臨床療效吻合，靈敏度高，但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)； 理化方法： 準(zhǔn)確度與專屬性較高，且操作簡(jiǎn)便，但與臨床療效有偏差。HPLC測(cè)定結(jié)果必須與生物效價(jià)吻合。5. 抗生素質(zhì)量分析一、概 述2022/8/410 抗生素的活性以效價(jià)單位表示，即指每毫升或每毫克中含有某種抗生素的有效成分的多少。效價(jià)是以抗菌效能(活性部分)作為衡量的標(biāo)準(zhǔn)，因此，效價(jià)的高低是衡量抗生素質(zhì)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)。 效價(jià)用單位(U)或微克(g)表示。各種抗生素的效價(jià)基準(zhǔn)是人們?yōu)?/p>

6、了生產(chǎn)科研方便而規(guī)定的，如1mg青霉素鈉定為1670 U；1mg慶大霉素定為590 U；1mg硫酸卡那霉素定為670 U。6.活性表示方法 一、概 述2022/8/411第二節(jié) -內(nèi)酰胺類抗生素 發(fā)展史1929年，弗來明(Alexander Fleming) 發(fā)現(xiàn)青霉素。1958年謝漢合成6-氨基青霉烷酸(6-APA)成功。開創(chuàng)了半合成青霉素的時(shí)代1961年，頭孢菌素C被發(fā)現(xiàn)，頭孢菌素迅速發(fā)展。80年代:廣譜碳青霉烯類上市。2022/8/412一、化學(xué)結(jié)構(gòu)1.化學(xué)結(jié)構(gòu)：-內(nèi)酰胺環(huán)母核：6-氨基青霉烷酸簡(jiǎn)稱：6-APA母核：7-氨基頭孢菌烷酸簡(jiǎn)稱：7-ACA2022/8/413酸性較強(qiáng)（pKa

7、2.5-2.8）臨床常用其堿金屬鹽（水溶性好）酸性(羧基)有多個(gè)手性碳旋光性青霉素類：苯環(huán)取代基頭孢菌素類：母核有共軛結(jié)構(gòu)UV（共軛）干燥條件較穩(wěn)定，溶液不穩(wěn)定穩(wěn)定性(內(nèi)酰胺)2、主要理化性質(zhì)降解失效氧化劑、酸、堿酶、金屬離子、青霉素二、理化性質(zhì)2022/8/414100-青霉噻唑?；u胺酸青霉素青霉烯酸青霉噻唑酸青霉酸青霉醛青霉胺圖 青霉素的降解反應(yīng)2022/8/415圖 頭孢噻吩鈉降解產(chǎn)物圖 2022/8/416(一) 色譜法 利用HPLC保留時(shí)間(tR) 或TLC顯主斑點(diǎn)的位置和顏色 鑒別。 ChP有HPLC法又有TLC法的，規(guī)定可在兩種鑒別方法中選做一種。 (二) 光譜法紅外吸收光譜(

8、IR) -內(nèi)酰胺環(huán)羰基的伸縮振動(dòng)(1750cm-11800cm-1)， 仲酰胺的氨基、羰基的伸縮振動(dòng)(3300cm-1，1525 cm-1，1680 cm-1)、 羧酸離子的伸縮振動(dòng)(1600cm-1，1410cm-1)是該類抗生素共有的特征峰。二、鑒別試驗(yàn)2022/8/417特征吸收峰歸屬峰位(cm-1)歸屬36002600O-H1780C=O1690C=O1585, 1480COO-1250CO圖 阿莫西林的紅外光譜圖(KBr壓片法) 內(nèi)酰胺環(huán)羰基羧酸離子伸縮振動(dòng)側(cè)鏈仲酰胺羰基二、鑒別試驗(yàn)2022/8/418(三) 呈色反應(yīng) 1. 羥肟酸鐵反應(yīng) 青霉素及頭孢菌素在堿性中與羥胺作用，-內(nèi)酰胺

9、環(huán)破裂生成羥肟酸；在稀酸中與高鐵離子呈色。 二、鑒別試驗(yàn)2022/8/419 2. 類似肽鍵的反應(yīng) 本類藥物具有-CONH-結(jié)構(gòu)，一些取代基有-氨基酸結(jié)構(gòu)，可顯雙縮脲和茚三酮反應(yīng)。 3. 其他呈色反應(yīng) 側(cè)鏈含有-C6H5-OH基團(tuán)時(shí)，能與重氮苯磺酸試液產(chǎn)生偶合反應(yīng)而呈色。此外，本類藥物還可與變色酸-硫酸、硫酸-甲醛等試劑反應(yīng)而呈色。(四) 各種鹽的反應(yīng) 鉀、鈉離子的火焰反應(yīng) 青霉素類、頭孢菌素類藥品中，許多制成鉀鹽或鈉鹽供臨床使用，因而可利用鉀、鈉離子的火焰反應(yīng)進(jìn)行鑒別。二、鑒別試驗(yàn)-呈色反應(yīng)2022/8/420三、檢查 本類抗生素的雜質(zhì)主要有高分子聚合物，有關(guān)物質(zhì)，異構(gòu)體等，一般采用HPLC

10、法控制其限量，也有采用測(cè)定雜質(zhì)的吸光度來控制雜質(zhì)量的。部分抗生素還檢查有機(jī)溶劑殘留量。 (一) 聚合物 (二) 有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體 (三) 吸光度 (四) 有機(jī)溶劑 (五) 結(jié)晶性2022/8/421三、檢查- 聚合物分子排阻色譜法-凝膠色譜柱分子篩機(jī)制例：青霉素V鉀中青霉素V聚合物的測(cè)定2022/8/422三、檢查- 有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查色譜法異構(gòu)體：頭孢呋辛酯A，B異構(gòu)體之間、頭孢呋辛酯A異構(gòu)體與3-異構(gòu)體之間的分離度應(yīng)大于1.5； 供試品色譜圖中, A異構(gòu)體峰的面積與A、B異構(gòu)體峰的面積和之比應(yīng)為0.480.55。有關(guān)物質(zhì)：供試品溶液：0.25mg/ml(流動(dòng)

11、相溶）；對(duì)照液:將供試品溶液加流動(dòng)相稀釋對(duì)照溶液進(jìn)樣20ml ，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的20% ，取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20ml，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至A異構(gòu)體峰保留時(shí)間的3.5倍，供試品溶液如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的和，不得大于對(duì)照溶液兩個(gè)主峰的面積和的3倍。1:頭孢呋辛酯2:頭孢呋辛酯B異構(gòu)體3:頭孢呋辛酯A異構(gòu)體4: 3-異構(gòu)體5,6:頭孢呋辛酯E異構(gòu)體2022/8/423四、含量測(cè)定-HPLC 各國(guó)藥典收載的青霉素類和頭孢菌素類的含量測(cè)定除少數(shù)幾個(gè)樣品采用抗生素微生物檢定法測(cè)定外，大多采用HPLC測(cè)定方法。ChP2010收載的本類抗生素中除磺芐西

12、林鈉采用微生物檢定法測(cè)定含量外，其余均采用HPLC法測(cè)定含量。 2022/8/424四、含量測(cè)定-HPLC2022/8/425單選練習(xí)D2022/8/426單選練習(xí)C2022/8/427多選1練習(xí)ABCE2022/8/428多選2練習(xí)ABD2022/8/429 1. 化學(xué)結(jié)構(gòu)都是以氨基環(huán)己醇與氨基糖縮合而成的苷；分子結(jié)構(gòu)中都含有多羥基；均為堿性抗生素；第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics)抗結(jié)核桿菌，兔熱癥，鼠疫2022/8/430第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics) 1. 化學(xué)結(jié)構(gòu)-慶大霉素2022

13、/8/431第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics) 1. 化學(xué)結(jié)構(gòu)-巴龍霉素2022/8/432硫酸鏈霉素StreptomycinSulfate 硫酸巴龍霉素Paromomycin Sulfate 硫酸慶大霉素Gentamycin sulfate 硫酸奈替米星Netilmicin Sulfate 第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics) 1. 化學(xué)結(jié)構(gòu)2022/8/433第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics) 2. 理化性質(zhì)多個(gè)氨基（堿性基團(tuán)）和羥基，屬于堿性

14、、水溶性抗生素，與礦酸或有機(jī)酸成鹽（硫酸鹽），易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑溶解度(氨基、羥基)鏈霉素巴龍霉素2022/8/434第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics) 2. 理化性質(zhì)氨基糖上有多個(gè)手性碳，具有旋光性旋光性(糖)2022/8/435第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics) 2. 理化性質(zhì)鏈霉素在酸性或堿性條件下水解為鏈霉胍和鏈霉雙糖胺該類抗生素對(duì)光、熱、空氣均較穩(wěn)定水解（苷）與穩(wěn)定性2022/8/436第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics) 2. 理

15、化性質(zhì)鏈霉素在230nm有紫外吸收，慶大霉素、奈替米星等無紫外吸收紫外吸收鏈霉素巴龍霉素慶大霉素2022/8/4373、鑒 別茚三酮反應(yīng)：具羥基胺類，-氨基酸性質(zhì)鏈霉素 + 水合茚三酮 藍(lán)紫色Molisch試驗(yàn)第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics)氨基糖苷酸水解鹽酸脫水糠醛（五碳糖）羥甲基糠醛（六碳糖）-萘酚/蒽酮紅紫色或藍(lán)紫色2022/8/4383、鑒 別第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics)2022/8/4393、鑒 別第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotic

16、s)N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)(Elson-Morgan反應(yīng))2022/8/4403、鑒 別第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics)麥芽酚(Maltol)反應(yīng)2022/8/4413、鑒 別第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics)坂口(Sakaguchi)反應(yīng)2022/8/4423、鑒 別第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics)硫酸鹽反應(yīng) 本類藥物多為硫酸鹽，因此，各國(guó)藥典都進(jìn)行硫酸根的鑒定 2022/8/4433、鑒 別第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycos

17、ides Antibiotics)色譜法 TLC， HPLC光譜法 IR UV2022/8/4443、鑒 別 總 結(jié)第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics)2022/8/4454、有關(guān)物質(zhì)及組分分析 來 源：發(fā)酵中產(chǎn)生BP:薄層色譜法（雜質(zhì)對(duì)照品法）要求：NC2 2000，C2a峰和C2峰的分離度應(yīng)符合要求，重復(fù)進(jìn)樣RSD2.0%鏈霉素中鏈霉素B的檢查慶大霉素C 組分測(cè)定（系統(tǒng)適用性試驗(yàn)）色譜柱：ODS流動(dòng)相： H2O-HAc-MeOH配制的庚烷磺酸鈉溶液(0.2M)，必要時(shí)調(diào)節(jié)甲醇的含量。檢測(cè)波長(zhǎng)： 330nm（鄰苯二甲醛柱前衍生）第三節(jié) 氨基糖苷

18、類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics)2022/8/4464、有關(guān)物質(zhì)及組分分析慶大霉素C 組分測(cè)定第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics)2022/8/4474、有關(guān)物質(zhì)及組分分析慶大霉素C 組分測(cè)定第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics)USP2022/8/4484、有關(guān)物質(zhì)及組分分析慶大霉素C 組分測(cè)定第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics)2022/8/4494、有關(guān)物質(zhì)及組分分析慶大霉素C 組分測(cè)定第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素

19、(Aminoglycosides Antibiotics)2022/8/4505、含 量 測(cè) 定氨基糖苷類 含量檢測(cè)微生物法、HPLC法等第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素 (Aminoglycosides Antibiotics)2022/8/451練習(xí)單選 1硫酸慶大霉素A2022/8/452練習(xí)單選 2可發(fā)生茚三酮反應(yīng)的藥物是（ ）A青霉素 B氯霉素 C四環(huán)素 D鏈霉素D2022/8/453練習(xí)單選 3硫酸鏈霉素的鑒別反應(yīng)中不包括（ ）A麥芽酚反應(yīng) B氯化鋇反應(yīng) C茚三酮反應(yīng) D硝酸銀反應(yīng)D2022/8/454練習(xí)多選 1ABD2022/8/455練習(xí)多選 2AE2022/8/456第四節(jié) 四環(huán)素

20、類抗生素 四環(huán)素類抗生素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，都具有四個(gè)并苯或萘并萘環(huán)構(gòu)成，故統(tǒng)稱為四環(huán)素類(tetracyclines)抗生素。2022/8/457第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素2022/8/458第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素酸堿性1、理化性質(zhì)酚羥基、烯醇型羥基-弱酸性；二甲胺基-弱堿性；所以，四環(huán)素類為兩性化合物，遇酸或堿均可成鹽2022/8/459第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素溶解性1、理化性質(zhì)鹽酸鹽易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑游離體在水中溶解度很小，溶解度與pH有關(guān)。pH4.57.2難溶于水，pH低于4或高于8時(shí)，可以得到高濃度的水溶液。旋光性有不對(duì)稱碳原子，有旋光性 可用于定性定量分析。2022/8/460第四節(jié) 四

21、環(huán)素類抗生素紫外吸收及熒光1、理化性質(zhì)有共軛雙鍵系統(tǒng)由紫外吸收；在紫外光照射下產(chǎn)生熒光，它們的降解產(chǎn)物也具有不同顏色熒光，可區(qū)別不同的四環(huán)素類抗生素。2022/8/461第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素穩(wěn)定性1、理化性質(zhì)對(duì)各種氧化劑都不穩(wěn)定，且堿性水溶液特別易氧化，顏色很快變深形成色素，干燥品較穩(wěn)定，但貯存時(shí)遇光可使顏色變深（因空氣氧化）。弱酸性（pH2-6） A環(huán)C-4異構(gòu)化 差向四環(huán)素酸性（pH 2） C環(huán)脫水 脫水四環(huán)素 堿 性 C環(huán)開環(huán)，形成內(nèi)酯 異四環(huán)素2022/8/462第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素穩(wěn)定性1、理化性質(zhì)（1） 差向異構(gòu)化性質(zhì)：（差向四環(huán)素）在弱酸性（pH2.06.0）溶液中，A環(huán)上手

22、性C4構(gòu)型的改變，發(fā)生差向異構(gòu)化，形成差向四環(huán)素類。 高價(jià)的無機(jī)酸或有機(jī)酸根存在或陰離子濃度增加，差向化速度增大。四環(huán)素和金霉素很易差向異構(gòu)化，形成4-差向四環(huán)素、4-差向金霉素，他們的抗菌性極弱或完全消失。 43212022/8/463第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素穩(wěn)定性1、理化性質(zhì)（2）降解性質(zhì):酸性下降解反應(yīng)：（脫水四環(huán)素類） 在酸性（pH2）時(shí)，C環(huán)上C6上羥基易脫落與C5a 上的氫生成水，在C6-C5a間形成雙鍵。經(jīng)重排使C環(huán)芳構(gòu)化，生成脫水四環(huán)素類。四環(huán)素、土霉素和金霉素可發(fā)生脫水； 565a565a565a2022/8/464第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素穩(wěn)定性1、理化性質(zhì)（2）降解性質(zhì):堿性下降解反應(yīng)：（異四環(huán)素類） 在堿性下，C環(huán)打開，生成無活性的具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的異四環(huán)素。 。 ABCDABCD2022/8/465第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素1、理化性質(zhì)總結(jié)。 2022/8/466第四節(jié)