凝膠色譜柱使用注意事項

1、Sephadex LH-20中藥生物技術(shù)S06203361基本內(nèi)容 1結(jié)構(gòu) 2性質(zhì) 3應(yīng)用原理使用方法 1一般使用過程 2溶劑選擇 3再生方法 4污染處理方法注意問題2基本內(nèi)容1. Sephadex LH-20結(jié)構(gòu)特點Sephadex LH-20是Sephadex G-25經(jīng)羥丙基化處理后得到的產(chǎn)物。葡聚糖凝膠中的葡萄糖部分與羥丙基結(jié)合成醚鍵形式。親脂性的羥丙基是同時具備吸附性層析和分子篩功能的獨特層析介質(zhì)。3交聯(lián)葡聚糖凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)42 Sephadex LH-20性質(zhì)交聯(lián)度小，機械強度低，不耐壓，溶脹性大具親脂性和親水性，水及有機溶劑中都能應(yīng)用可用于分子篩層析、吸附層析和分配層析 應(yīng)用范圍

2、廣泛，適合用有機溶劑分離嗜脂性分子載樣量高，極少需要再生5主要性能參數(shù)分離范圍（球蛋白） 100-4000顆粒大?。ㄎ⒚祝?20-150應(yīng)用范圍 膽固醇 ，脂肪酸，激素，維他命，天然產(chǎn)物PH穩(wěn)定性 2-13最高流速 （厘米小時） 50063應(yīng)用原理凝膠層析的分子篩原理 l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脫開始，小分子擴散進人凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；3 大小分子分開： 4大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進行中7吸附原理吸附：范德華力或產(chǎn)生氫鍵 反相分配原理分配：極性與非極性溶劑組成的混合劑（反相溶劑）中起到反相分配的效果8使用反相溶劑洗脫，極性大的化合物保留弱，先被洗脫下

3、來，極性小的化合物保留強，后出柱。如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過濾作用來分離。9使用方法 制備凝膠懸浮液 裝柱平衡 上樣洗脫 再生污染處理10制備凝膠懸浮液Sephadex LH-20在使用之前必須進行溶脹。在室溫下，將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時。在溶脹的過程中，要盡量避免過分攪拌，否則會破壞球形膠粒，且要避免使用磁力攪拌器 11將干膠往水里加，邊加邊攪，以防凝膠結(jié)塊，然后放到沸水浴中加熱接近100，幾個小時就可以使其溶脹，還可起到除去顆粒內(nèi)部氣泡和殺菌作用。 12使溶脹膠體積沉淀之后占總體積的75%，上層溶劑占25%，這時，懸浮液從一個容器倒入另一容器時膠?？梢苿?。13LH-20在

4、不同溶劑中的溶脹性能溶劑溶脹體積 溶劑 溶脹體積 ml/g干膠 ml/g干膠二甲亞砜4.2-4.4 乙醇 3.2-3.6吡啶 4.0-4.3 異丙醇 3.1-3.5水 3.8-4.2 四氫呋喃3.1-3.5甲醇 3.7-4.2 二氯乙烷3.5-4.0丙醇 3.4-3.8 甲苯 1.5-1.614裝柱將溶脹后的凝膠根據(jù)裝柱要求均勻倒入柱內(nèi)，在保證膠粒不變形的前提下，應(yīng)在盡可能高的壓力下裝柱，反壓不要超過1.5ba。柱裝得不好往往造成洗脫區(qū)帶加寬，甚至使一些本來可以分開的區(qū)帶重疊。如裝柱時的操作壓力太大，會使凝膠床壓得太實，從而降低流速。15一般是在柱內(nèi)先裝入約1/3高度的水或緩沖液，然后將溶脹好

5、的凝膠在攪拌成稀漿的情況下慢慢倒入柱內(nèi)，使其自然沉降。如此連續(xù)操作，可以得到一個均勻的柱床。16平衡 新柱裝好后，要用洗脫緩沖液平衡，一般用35倍體積的緩沖液在恒壓下流過床。上樣前，用洗脫液平衡層析柱至少兩個柱體積直到基線變得平穩(wěn)為止。如改變?nèi)軇?yīng)該注意凝膠在新溶劑中的溶脹性質(zhì)，并根據(jù)性質(zhì)確定柱高調(diào)節(jié)器的位置，如使用相同的溶劑，在以后的層析中柱平衡可以省略。17上樣一般要求樣品粘度小于0.01Pas（帕斯卡.秒），這樣才不致于對分離造成明顯影響。上樣量視被分離物的結(jié)構(gòu)性能的差異而定差異大，可大；差異小，應(yīng)小。樣品與柱床體積比例懸殊時分離效果好，但過少的樣品量會造成設(shè)備和器材的浪費，降低工作效率

6、，還會造成樣品稀釋。 。 18洗脫 所有的緩沖液都應(yīng)該離心或經(jīng)過0.45um的膜過濾以除去雜質(zhì)。洗脫流速應(yīng)根據(jù)情況而定，最大張性流速約12cm/min（反壓1.5ba），建議流速為1-10cm/min。流速不宜過快且要穩(wěn)定。 洗脫液的成分也不應(yīng)改變，以防凝膠顆粒的脹縮引起柱床體積變化或流速改變。 19溶劑的選擇主要考慮能溶解樣品、濕潤凝膠、不腐蝕色譜儀、純度高、毒性低、溶解性能好，能溶解多種高分子、粘度盡可能低。適用溶劑：滿足上述條件，根據(jù)分離 要求選擇即可，如：水 DMF 丙酮 乙醇 乙酸乙酯 甲醇 氯仿 THF 正丁醇 二氯乙烷常用溶劑：水甲醇丙酮乙酸乙酯 二氯甲烷 甲醇-水 氯仿-甲醇2

7、0用低級醇為溶劑時，對芳香族、雜環(huán)族化合物仍有吸附作用。但用氯仿時則可去除對上述化合物的吸附作用，而對含羥基與羧基的化合物卻有吸附作用。21再生方法凝膠再生通常是先用2-3個柱體積的洗脫液進行清洗，如更換洗脫液，則需要重新平衡 在洗脫過程中，所有組分一般都可被洗脫下來，所以裝好柱后，可反復(fù)使用，無需特殊的再生處理。22多次使用后，凝膠顆粒可能逐漸沉積壓緊，流速變慢。這時只需將凝膠自柱內(nèi)倒出，重新填裝?；蚴褂梅礇_法，使凝膠松散沖起，然后自然沉降，形成新的柱床，這樣流速會有所改善。23污染處理方法Sephadex LH20柱子被弄臟了，大多數(shù)情況下是由于樣品沒濾, 將柱頭堵住,或由于樣品的死吸附(

8、一般很少發(fā)生),使柱子的柱頭部分污染。一般的處理是將被污染的柱頭部分的填料棄去,具體做法很簡單,只將被污染的柱頭部分的填料用玻棒輕輕攪起,倒掉即可。24 如果柱子整個被污染,若是Sephadex LH-20用作反相被污染，辦法如下：依次用水, NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗滌被污染的柱子。25因為是整個柱子被污染，所以污染物一定不會完全死吸附在柱上（如果完全死吸附在柱上，污染物一定會只在柱頭部分），所以用合適的溶劑一定可以將之洗下來。NaOH-NaCl水溶液配法： 8g NaOH ,30g NaCl， 1000ml水。26保存方法暫時不用時可水洗-含水醇洗（醇的濃度逐步遞增）-醇洗，最后泡在醇中貯于磨口瓶中備用。如長期不用時，可以在以上處理基礎(chǔ)上，減