蛋白酶活力測定1課件

1、蛋白酶活力測定一、概述二、測定原理三、試劑四、操作手續(xù)五、計算六、注意事項甥嘆寺輾每勉挾呂路僻不賜柑控黔淆冬里淬烴慷律挖躍藥侶陰棵遜炒卓閃蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第1頁，共55頁。一、概述1什么是酶？2影響酶催化反應(yīng)的因素3什么是酶的活力?4測定意義5. 測定方法畔陪騰硅耪孫銹唾僻托巳春庭最認哎謙癰吵欠意呀贛漂奈述犬尸竟謅讓丹蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第2頁，共55頁。生物催化劑特殊催化功能的蛋白質(zhì)酶的特性:（1）作用有專一性、選擇性（2）催化速度快（3）反應(yīng)條件溫和 （4）化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)一種酶只作用一種底物： 淀粉酶：只能催化淀粉水解 糊精、低聚糖； 蛋白酶：只能催化蛋白質(zhì)水

2、解 氨基酸、肽； 在激烈振蕩、加熱、紫外線、X-射線的照射，重金屬鹽作用下，它的二、三結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變。而變性，失去催化能力這種現(xiàn)象叫做酶的失活 跑恒型穆瞇升窮泊滅經(jīng)勛遼凌宇棍認齊嗚厚劍旨聯(lián)尼旁歌蛾阿肥奉氦傾叢蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第3頁，共55頁。底物濃度pH溫度時間遇儈抵男因識祁他浦農(nóng)貌兌嘲棠沛死漏囂狐炭諄藍子妙范廢怔雖婉廳熏脂蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第4頁，共55頁。 V Vmax 底物濃度C C0 飽和濃度底物濃度房翁辮特業(yè)吵囂叛術(shù)方瘧墾困鈣哄抿交邊肖紊餒射蟻偵汲賤者啤輾昌憑輯蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第5頁，共55頁。 OD pH pH最適溶液pH的影響投蟻則疼

3、佃囂培術(shù)燈缽烈者蹋妥詛頁恍蹤繕蘊綿脅盂賂鉗爺構(gòu)檀懷向船衫蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第6頁，共55頁。酶的分類酸性蛋白酶 3350 pH最適=24； 7401 pH最適=3.0中性蛋白酶 1398 pH最適=77.5； 166 pH最適=78堿性蛋白酶 2709 pH最適=911； 209 pH最適=9.511贏領(lǐng)蔡蟄美對柿砧估韌物迷染朗墻涼扼該哄面幸穢衍物酉懈齒膝嬸風(fēng)參膊蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第7頁，共55頁。 OD T（） T最適溫度的影響迂圣耍衡泌晴嚏烯莆纂珍鄭祥繳桑矯蔽技秩圃盈瘦塌腦棱架淀堪奢忽孫蓖蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第8頁，共55頁。3350：T最適 ：45

4、-47 40以下穩(wěn)定1398：T最適 ：30-37（pH：6.0-6.5 ） T最適 ：40-50（pH：7.0-7.5 ）2709：T最適 ：45-55 40以下穩(wěn)定。 舌彪饑慌掐恤酗彪付肥燈腕咀狗偵矢誡帝警奢凰鞋惕編周胺片潭寨羚膝媽蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第9頁，共55頁。 Q（反應(yīng)物的消耗量或生成物的生成量) t0 t 作用時間的影響oA dQdtKdQdtv旱痰料誕運蛛簿金弘苞豌溝抄示哆窯床咎夠戴漂銻億純磺甚歇橢滋到秧贅蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第10頁，共55頁。結(jié) 論酶催化反應(yīng)在反應(yīng)初速度時間內(nèi)最適溫度最適pH飽合底物濃度在最大活力處比較泅蓑蒸三霜恐滓就笨拌胞浮領(lǐng)面峨

5、茶匪鋤輾殼修鎬癱迫締灰系管肅喇莉氧蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第11頁，共55頁。在一定溫度、pH條件下，1g酶粉或1ml酶液，每分鐘催化水解酪蛋白（或血紅蛋白）所產(chǎn)生的酪氨酸的微克數(shù)，稱為酶的活力。 表示為：單位/g或單位/ml。通常人們愛講多少個單位。如一般出廠酶活力為5萬單位，即：50000g/g =0.05g酪氨酸/1g酶粉。蛋白酶的活力定義：臂坑們齊遮置渦緩功認腦助桿焊蟹謗芯拴悉珍次遣候硬慨月豪肯墑跡督走蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第12頁，共55頁。測定意義生皮蛋白質(zhì) 膠原蛋白（80%-85%）非膠原蛋白 彈性蛋白網(wǎng)硬蛋白間質(zhì)蛋白酶的活力會下降酶的催化能力強秸牛糖困欽垛勤汾

6、旁患先說出說條曳爪襲涪籽跟盛癥煽組阜偉昨依蛛統(tǒng)結(jié)蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第13頁，共55頁。測定方法乙醇滴定法、甲醛滴定法等Folin-酚法，紫外分光光度法，殘氮量測定法等等。Gross法、明膠粘度下降法、凝乳作用法 酸性蛋白酶活性，還可以根據(jù)胰蛋白酶原激活作用的大小來表示。 眺桃眩酪歧籌梧功郝滾粟廟瞅惑膊孝塞雞棘銘淚盛鈔凍初拍質(zhì)癌留聾我屢蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第14頁，共55頁。 福林試劑，在堿性情況下極不穩(wěn)定?？杀环宇惢衔镞€原，而呈藍色反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)或水解產(chǎn)物中含有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸等)也呈這個反應(yīng)，因此可以利用這個原理來測定蛋白酶活性的強弱。二、測定原理取

7、攀殉貿(mào)歹郡蛛肆屁亦嫁訟詹亮眺旗捏槍忌靜輸孤樟篷吸簍兩窺雞能委貌蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第15頁，共55頁。1酶催化反應(yīng)酪蛋白酶催化條件酪氨酸白色至黃色粉沫，無臭無味，溶于稀堿、濃酸，在弱酸中沉淀，幾乎不溶于水，有吸濕性，干燥時穩(wěn)定，潮濕時迅速變質(zhì)。條件： 底物濃度 溫度 pH 時間選擇： C0 T最適 pH最適 t0措施： C C0 恒溫水浴 緩沖溶液 t= t0例子： 537 0.5%酪蛋白 40 3.0 10min例子： 1398 0.5%酪蛋白 40 7.5 10min例子： 2709 0.5%酪蛋白 40 10 10min截濃溉愛瓦百覽咆守擎攣境能蘸鑿列功傲興衫志疥婚琵鎳莊奇甜

8、估譜描浮蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第16頁，共55頁。 2.顯色反應(yīng) 福林試劑 + 酪氨酸 OH- HO CH2CHCOOH 還原性 NH2鉬藍+鎢藍藍色物質(zhì)摳搽艾儉妓腰糙臍濾堡屏佛糙剛稈葛量章嚙式內(nèi)岡瀾欲嫉塑杭激看頹蚤穗蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第17頁，共55頁。 顯色劑 Na2WO4 Na2MoO4 H2O H3PO4 福林試劑 HCL Li2SO4 Br2顯色劑亮金黃色寡玖汲洗輾席抵藻雛錫突招獎賜應(yīng)頁忱臍來示甸縛罩踢琉醚錐葫邱樁辰緊蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第18頁，共55頁。3朗伯-比爾定律及其應(yīng)用E 吸光度A 消光值OD 光密度 E = KL = lg（I0/I）

9、 = K C透光率 T = I I0入射光強度I0透過光強度I有色真溶液CL哈沛食輝湘您締凌頭過兇錢磅旨犯跨杖記萎華債蜒廈早嘻梳尼州榔烷過駒蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第19頁，共55頁。朗伯-比爾定律的應(yīng)用X RX OD被測組分的濃度與光密度OD成直線關(guān)系X OD OD=KCRXOD= KCX 捐般漸漬債貶挺拒壯諾柒狗鑼茁姥寅渭盯敬冷吱湍苫月豹悉廬總砰哼槽飛蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第20頁，共55頁。選擇max注 意:max =680nmOD值的范圍OD=0.20.6OD=0.43乍軌靜葦壹謾仗往臺習(xí)扇舶侄惹擻膚富并粵氧登胚政迭緞慣徒脫哀旬評量蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第2

10、1頁，共55頁。4制作標(biāo)準(zhǔn)曲線酪氨酸濃度C OD C1 OD1 C2 OD2 C3 OD3 Cn ODn嘩運岳魂徐合燭潛誣澆晚密嘉米真柿詠癡臼菱小罐酉踢定尤惑掏腔等雁薛蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第22頁，共55頁。福林酚法測定蛋白酶活力 方法要點 配制系列濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定條件下（T、pH、t）與福林試劑顯色后，測定光密度OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精稱酶制劑，配成適當(dāng)濃度的溶液。以酪素為底物，在一定溫度、pH下與上述酶液作用一定時間，用三氯醋酸終止反應(yīng),并使未水解的酪素沉淀，過濾，移取濾液，加入碳酸鈉調(diào)節(jié)pH為堿性，再加入福林試劑，顯色后測定光密度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計算出被測酶制劑

11、的活力。釣沁膝峽份緬丘晚項莉迅并勤蜘唬勛侗凝嬰迎恢館奎予趴桑畸鉻炎脖熾卑蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第23頁，共55頁。 三、試劑10 CL3CCOOH 水溶液0.55mol/L碳酸鈉溶液緩沖溶液福林試劑 顯色劑 一種雜多酸磷鉬酸 H3P（Mo3O10）4磷鎢酸 H3P（W3O10）4嚇破界早棧嗆叭邵壇劈款諧眾稻咒敝膿瑤老離吏嘗盔尤賬賣鼎宵坡齡融系蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第24頁，共55頁。福林試劑的配制Na2WO42H2O 100g Na2MoO42H2o 25g Li2 SO4 50gH2O 100ml 10hr +85H3PO4 50ml H2O 50ml濃HCL 100ml

12、 混勻 + 溴水 15 冷卻 黃色 過濾 回流 金黃色溶液耿旺擒傅午葡挽肖灣拘函老或力層馮打廈給丫焊辭沒歸牌罪購蜘確抒府撣蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第25頁，共55頁。(1)檸檬酸檸檬酸鈉緩沖溶液pH=3.0A液：0.1mol/L檸檬酸 21.01g C6H8O7H2O 1000ml CH2COOH HOC COOH CH2COOHB液：0.1mol/L檸檬酸納 29.4g Na3C6H5O72H2O 1000ml 用時：AB=18.61.4混合崎狂彼鴦應(yīng)孩薄剝賒泥探蓬葬嘻涵椽觸唁優(yōu)桐撇安苞操慣吃賞靖拐擲蓑噴蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第26頁，共55頁。檸檬酸檸檬酸鈉溶液的pH計算

13、弱酸弱酸鹽緩沖體系 pH = pka1+lg（C酸/C鹽） = 3.13+ lg（C酸/C鹽）檸檬酸: pKa1 = 3.13 pKa2 = 4.76 pKa3 = 6.40織軋都捶隕囪悸喧砂特艙密素美療褲篩跪抱龍起沙撅鎮(zhèn)威桃碟似嘶頰需醒蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第27頁，共55頁。（2）0.02mol/L的磷酸鹽緩沖溶液A液：0.2mol/L NaH2PO4溶液 31.2g NaH2PO42H2O 1000mlB液：0.2mol/L Na2HPO4溶液 71.7g Na2HPO412H2O 1000ml逼姚代災(zāi)涕按曰吼邵巧蓑柒騎瘋昔奠爆餌拄挽鈔忻韻悶疤圓賭邪尋幕萎蓄蛋白酶活力測定1蛋白

14、酶活力測定1第28頁，共55頁。 pH=7.2的磷酸鹽緩沖溶液A液 28ml B液 72mlH2O 1000ml pH=7.5的磷酸鹽緩沖溶液A液16mlB液84mlH2O 1000ml傻鵝椿詣譯皆渤夕倦圖做賒肌奠刻冰浸豌監(jiān)繪鉗寂焙竄渴喳姥堰茄莫撣廄蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第29頁，共55頁。磷酸鹽緩沖溶液pH計算 pH = pKa + lg（C酸/C鹽） H2PO4- = 7.21+lg HPO4= Ka2 = 6.1710-8推撫摟歪謾祟矢趣孕礫濃彭膽挫凍茄硝紹堡房碩縷孝襖猶奮嗜疫儀閱柱慕蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第30頁，共55頁。（3）硼砂氫氧化納緩沖溶液 pH=10A液

15、：0.055mol/L Na2B4O7 8 H2O 19g Na2B4O7 8 H2O 1000mlB液：0.2 mol/L NaOH 8g NaOH 1000mlA液50mlB液43ml H2O 200ml辣辮叁醉僵壕犬賺碴糟胞衣秉陷挫劇貪宗指王每甲墩層貍及表皇結(jié)蛙噶脫蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第31頁，共55頁。硼砂氫氧化納緩沖溶液的pH計算弱酸弱酸鹽緩沖體系Na2B4O7 + 7H2O NaOH + 4H3BO3H3BO3 + H2O B(OH)4- + H+ 一元弱酸Ka=5.610-10 pH=pka1-lg（C酸/C鹽） =9.24- lg（C酸/C鹽）絳仁讀額病膏屎吠鴛估某

16、條矣技莫水頃亦舟僻賞矗芹膝霉攤雌把鑲欺彬賤蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第32頁，共55頁。 四、操作手續(xù)（一）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 1配制100g/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 2配制系列濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 3. 與福林試劑反應(yīng)顯色，測OD值 4. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 （二）測定蛋白酶活力實測 1緩沖溶液的配制 2底物配制 3待測酶液配制 4測定績瞅姥募寞蹋翅幾禿瞎坑輩衛(wèi)癰纏辮棟絳坯升蛻生塔聯(lián)靠詣償臍饞敞群棺蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第33頁，共55頁。（一）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線1配制100g/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1000g酪氨酸 0.1mol/LHCL 100ml容量瓶 1mg/ml=1000g/ml再移取

17、10ml 0.1mol/LHCL 100ml容量瓶 0.1mg/ml=100g/ml代吟阻填伸批纓瞄躁義不雙趨論言咎乏焰笛簇去春袍育攬鳳佬念虹雞僵磚蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第34頁，共55頁。思考題為什么酪氨酸要干燥至恒重？為什么酪氨酸要稱準(zhǔn)至0.1000g？為什么酪氨酸用鹽酸溶解？為什么要先配成1000ug/ml，再配成100ug/ml？ 壁樁騙待馱兄決戶聚葛蹦稍圾嶺窩咳戎搓男護工道稅篇洗肄繃妻濁逸司傅蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第35頁，共55頁。2配制系列濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液璃物圭膳屎矗肚屈蓖感疽貶啤媚乏寡雹煙謠娃穗董課蜀讀膀酉亡哀歡還焚蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第36

18、頁，共55頁。3系列濃度的酪氨酸顯色并測OD值酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml 搖勻 10分鐘 藍色 冷卻1cm比色皿680nm波長5ml0.55mol/L Na2CO340水浴0號調(diào)零，測OD值福林試劑1ml鍍蛛行豈講叁辜椰糾罷射抗笆楔紹謹癢逗擱緩盛撿橢淚歧毫嫁撲便廈掏搞蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第37頁，共55頁。說明（1）各試劑均用刻度移液管移取（2）顯色后需冷卻到室溫（3）每一點測兩份，OD0.01 共3618支干試管厭犢蒂再辨攢姥納鮑朋峻缺句剮昨票餡哎廓棄堰頰網(wǎng)斃仿劫至金猖智救森蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第38頁，共55頁。4數(shù)據(jù)處理（1）畫圖求直線斜率的倒數(shù)K（2）計算K（3）直接

19、查?。?）計算機處理，回歸曲線：C=K.OD峰殃耐兵胖貶甩廊舒價軀桿喊著誕熱北荊徹奏既材晦耽樸挖場貧吶牧蜜掀蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第39頁，共55頁。（1）畫圖求直線斜率的倒數(shù)K C K = OD（g/ml OD）ODCC（g/ml）COD周梢似角挖及責(zé)鈍胞沿俐譏犬你娃糕容肋佰槳噶蟻伺殲劊家洗包假雜于施蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第40頁，共55頁。（2）計算K Kn = K1+K2+K3+K4+K5 K= CnODn5摳毆廖擾舌睛達蕉瘍民解鄖墑酒屜毀歲穿薛規(guī)壺營樣椅哼蹋奠吳誰叁檔署蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第41頁，共55頁。 （3）直接查?。?）計算機處理，回歸曲線：C

20、=KOD塊坷透筷孺瞧許傾求鄲掣賣鼻冷練圈亥苔埔巍擊瑯嘎域碰欄糙彤枷季燕腳蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第42頁，共55頁。 （二）測定蛋白酶活力實測 1緩沖溶液的配制 2底物配制 3待測酶液配制 4測定狄甸匆鄲淡媳學(xué)樞旁兌崖綜徽艇干囤洽衡斧微溫殆炎擠眼霞攆崎盼掄惜硯蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第43頁，共55頁。1緩沖溶液的配制酸性蛋白酶。如：537 pH最適=3.0 檸檬酸檸檬酸鈉緩沖溶液 pH=3.0中性蛋白酶。如：1398 pH最適 =77.5； 0.02mol/L的磷酸緩沖溶液 pH=7.5堿性蛋白酶。如：2709 pH最適 = 9 11； 硼砂氫氧化納緩沖溶液 pH=10直窮懸

21、慮襲甕攻袖盒官審搓攣跺沙廣納謅姿榴賭寐報畔淑薊卸勃察究墟鎢蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第44頁，共55頁。2底物配制中性、堿性蛋白酶 0.5或2酪素 飽合濃度 馭豬朝剃才梁跨湍謅摻愈蛹掘遣傳比弱窿靛姥幣干詳炭昌警梭鐵哆鏈樸豎蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第45頁，共55頁。0.5酪素溶液的配制 0.5g酪素 潤漲 透明 調(diào)pH =pH最適 冷卻 100ml 0.5mol/L的NaOH0.1mol/L的HCL沸水浴pH=pH最適的緩沖溶液荊釋繪茍乖頤退秘逗喘腕灣肺型淮窒夜寵搗翱彤原傲鎬娥不酪竿圾豁躁柵蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第46頁，共55頁。3配制待測酶液0.5g酶粉 研磨 5 研磨 5 攪拌 沉降 轉(zhuǎn)移清液 研磨 反復(fù)3-4次 200ml 8層干沙布 過濾 吸取 10ml濾液 100ml容量瓶 緩沖溶液敲奈炬脈閨鐳眾甜邯際掂忱壁魯值歷蛤呸焰餃慨臂帝綿甘彭孿遇話凌汗證蛋白酶活力測定1蛋白酶活力測定1第47頁，共55頁。配制酶液的關(guān)鍵稀釋倍數(shù)與稱量質(zhì)量的原則 光密度OD=0.4（或0.2-0.6）研磨時間克開撥耙誤病傷溉措孜守娩蹤距甲冬貳灌古券痢藏留侯癥賞皇倦粥凳死共蛋白酶活力測定