藥物分析學(xué)課件：第五章 體內(nèi)藥物分析

1、藥物分析 Pharmaceutical Analysis第五章 體內(nèi)藥物分析 2022/8/43第五章體內(nèi)藥物分析常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏 1體內(nèi)樣品分析的前處理 2體內(nèi)樣品分析方法與方法驗證 32022/8/44第五章熟悉: 體內(nèi)樣品的采集與制備方法 體內(nèi)樣品分析方法驗證的技術(shù)要求 了解: 體內(nèi)藥物分析的性質(zhì)與意義 掌握: 體內(nèi)藥物分析的特點和應(yīng)用 體內(nèi)樣品分析的前處理 體內(nèi)樣品分析方法驗證的內(nèi)容 2022/8/45概述體內(nèi)藥物分析方法建立與驗證凈化與濃集原形,代謝物體液或組織色譜; 免疫分析; 生物 全面驗證和部分驗證 原形藥物或其代謝物 綴合物, 蛋白結(jié)合物 體內(nèi)樣品存在形式樣品制備分析

2、方法去蛋白; 萃取; 膜分離水解; 化學(xué)衍生化血液是主要樣品尿液,唾液,頭發(fā)和臟器2022/8/46概述1. 體內(nèi)樣品的特點 (1) 采樣量少: mll級; 且不易重新獲得 (2) 待測物濃度低:g/ml ng/ml級, 甚至pg/ml (3) 干擾物質(zhì)多: 尤其是血樣和組織中的蛋白質(zhì) 2. 體內(nèi)藥物分析的特點(1) 樣品需經(jīng)純化濃集, 或化學(xué)衍生化處理 (2) 對分析方法的靈敏度及專屬性要求較高 (3) 分析工作量大, 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果闡明繁雜 體內(nèi)藥物分析的特點主要來自于體內(nèi)樣品的特點特點2022/8/47第一節(jié)常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏 體內(nèi)樣品的種類1體內(nèi)樣品的采集與制備 2體內(nèi)樣品的貯藏

3、與處理 32022/8/48體液組織排泄物一、體內(nèi)樣品的種類體內(nèi)樣品血液; 唾液腦脊液;胃液;膽汁;乳汁;精液;淚液尿液糞便; 汗液胃;腸;肝;腎;肺,腦;肌肉;頭發(fā)2022/8/49常見體內(nèi)樣品1. 血樣的采集 靜脈, 1-5ml 1/10 2. 血漿的制備 抗凝劑, 1000g離心 5-10min 淡黃色上清液 3. 血清的制備 30min-1h 1000g離心 5-10min 上層淡黃色液體 4. 全血的制備 抗凝劑, 不離心1. 尿樣的特點 原形,代謝物及綴合物 藥物濃度較高 收集量大(15L) 2. 尿樣的采集 自然排尿 規(guī)定時間段(6-8h)(時間尿) 3. 尿樣的貯藏 加入適當(dāng)防

4、腐劑 TDM測定S代替P進(jìn)行臨床監(jiān)測 1. 唾液的組成 腮腺, 舌下腺和頜下腺 2. 唾液的采集 漱口15min, 安靜狀態(tài), 自然流出的唾液 物理或化學(xué)方法刺激 3. 樣品的制備 3000r/min離心10min,上清液 1. 樣品的制備 制成水性基質(zhì)勻漿溶液 2. 樣品的處理 (1)沉淀蛋白法 (2)酸/堿水解法 (3)酶水解法 蛋白水解酶中的枯草菌溶素 血樣尿樣唾液組織二、體內(nèi)樣品的采集與制備50-60 20-40 2022/8/410三、體內(nèi)樣品的貯存與處理(一) 冷藏與冷凍 短期保存: 冰箱(4)冷藏 長期保存: 冷柜(-20/-70-80)冷凍, 小體積分裝1. 血漿/血清: 分離

5、(2h), 硬質(zhì)玻璃/聚乙烯管(EP), 冷凍2. 尿樣: 冷藏(2436h)加防腐劑3. 唾液: 冷凍保存時, 解凍后充分?jǐn)噭蚝笤儆?二) 去活性 采樣后立即終止酶的活性 常用方法: 液氮速凍, 微波照射, 勻漿/沉淀, 加酶活性阻斷劑(氟化鈉)或抗氧劑(VC), 煮沸 2022/8/411第二節(jié)體內(nèi)樣品分析的前處理 體內(nèi)樣品預(yù)處理的目的1常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法 2 前處理(分離, 濃集, 改性) 為藥物的測定提供條件 前處理是體內(nèi)藥物分析過程中重要且繁復(fù)的工作 2022/8/412儀器污染,劣化(去蛋白)提高測定靈敏度/選擇性化學(xué)改性(衍生化) 血漿蛋白結(jié)合物;綴合物使待測藥物/代謝物釋放

6、測定藥物/代謝物總濃度 1. 使待測組分游離 2. 滿足測定方法的要求 3. 改善分析環(huán)境 一、體內(nèi)樣品前處理的目的樣品介質(zhì)組成復(fù)雜: 分離待測組分濃度低: 濃集 前處理2022/8/413二、體內(nèi)樣品前處理的方法 去除蛋白質(zhì)法 分離與濃集法 綴合物水解法 (一)(二)(三)化學(xué)衍生化法 (四)2022/8/414(一) 去除蛋白質(zhì)法加入與水混溶的有機(jī)溶劑, 蛋白析出藥物釋放乙腈,甲醇,丙酮,四氫呋喃等 血漿/血清與有機(jī)溶劑的體積比1(2-3) 飽和硫酸銨,硫酸鈉,硫酸鎂,氯化鈉等血清與飽和硫酸銨溶液的比12 10%三氯醋酸或6%高氯酸溶液血清與強酸的比10.6上清液呈強酸性(pH4)酸性分解

7、的藥物不宜用 熱變性蛋白質(zhì)沉淀通常90方法簡單只能除去熱變性蛋白待測物熱穩(wěn)定性好 1. 溶劑沉淀法2. 中性鹽析法3. 強酸沉淀法 4. 熱凝固法 2022/8/415(二) 分離與濃集法液相萃取法固相萃取法 超濾法1.2.3.2022/8/4161. 液相萃取法溶劑的選擇原則溶劑的用量 水相的pH (1)(2)(3)提取操作 (4)2022/8/417(1) 溶劑的選取原則對藥物分子未電離形式可溶, 對電離形式不溶；沸點低,易揮發(fā);與水不相混溶;無毒, 不易燃燒;具有化學(xué)穩(wěn)定和惰性;不影響紫外檢測 溶劑紫外截止波長(nm)沸點()極性增加正己烷21069環(huán)己烷21081甲苯285111異丙醚

8、*22068乙醚*22035醋酸戊酯285149三氯甲烷24561甲基異丁基酮230116醋酸乙酯26077正丁醇215118輔助試劑的使用 乙醚(1.2%水): 氯化鈉混合溶劑的使用 正己烷-異丙醇(95:5)2022/8/418(2) 溶劑的用量有機(jī)相與水相(樣品)體積比為1:15:1堿性藥物pH高于pKa 12單位酸性藥物pH低于pKa 12單位堿性下提取, 可減少內(nèi)源性物質(zhì)(酸性)的干擾堿性下不穩(wěn)定, 在中性用三氯甲烷和異丙醇提取 (3) 水相的pH提取1次若提取回收率較低(低于50%), 提取23次脂溶性干擾物, 可進(jìn)行小體積水溶液反提取 (4) 提取操作 2022/8/4192.

9、固相萃取法固相萃取法的原理 固相萃取法操作步驟 注意事項 (1)(2)(3)固相萃取法的特點 (4)自動化固相萃取 (5)2022/8/420(1) 固相萃取法的原理含藥物體內(nèi)樣品通過小柱時, 受到“吸附”,“分配”,“離子交換”或其它親和力作用, 藥物及內(nèi)源性物質(zhì)同時被保留在固定相(填料)洗脫方式有兩種: 沖洗溶劑洗去干擾物, 再用對藥物親和力更強的溶劑洗脫藥物; 藥物直接被洗脫, 干擾物保留2022/8/421(2) 固相萃取法操作步驟 第1步: 甲醇潤濕小柱, 活化填料; 凈化填料 第2步: 水/緩沖液沖洗小柱, 去除甲醇; 甲醇含量 過低(低于5%)致C18鏈彎曲折疊, 回收率降低 第

10、3步: 加樣, 使樣品通過小柱, 并棄去濾過液 第4步: 水/緩沖液沖洗 小柱, 去除內(nèi)源性及其 它干擾物質(zhì)第5步: 洗脫溶劑洗脫 待測物, 收集洗脫液, 平衡2022/8/422(3) 注意事項 樣品(血漿)通過萃取柱的流速在 1-2ml/min; 沖洗液和洗脫劑的強度與用量適當(dāng), 否則導(dǎo)致藥物損失/選擇性下降, 通常選用可與水混溶的洗脫劑; 萃取堿性藥物時, 洗脫劑中常加酸, 有機(jī)胺, 氨水, 醋酸銨或離子對試劑 2022/8/423(5) 自動化固相萃取法對于單個樣品處理, SPE操作省時對于大量樣品的處理半自動SPE: 萃取過程機(jī)械化全自動化儀器: 通過柱切換技術(shù) 實現(xiàn)固相萃取與HPL

11、C聯(lián)用2022/8/4243. 超濾法ultrafiltration是一種膜分離技術(shù)按照截留分子量,選擇半透膜,可分離可溶性生物大分子無化學(xué)試劑,無相變化提取操作 (4)簡便, 游離藥物分析的首選方法; 尤其適合TDM2022/8/425(三) 綴合物水解法 簡便, 快速 水解過程中發(fā)生藥物分解 專一性較差 葡萄糖醛酸苷酶或/和硫酸酯酶 專屬性強 時間較長 可引入粘蛋白 溶劑萃取過程中綴合物(尤其硫酸酯)直接分解 測定尿藥總量, 水解綴合物 趨向于直接測定綴合物 1. 酸水解法2. 酶水解法 3.溶劑解法 2022/8/426(四) 化學(xué)衍生化法1. 在GC中的應(yīng)用(1) 硅烷化: 三甲基硅烷

12、(TMCS)(2) 酰化: 三氟乙酸酐(TFAA)(3) 烷基化: 碘庚烷(C7H15I)(4) 不對稱衍生化: (S)-N-三氟 乙酰脯氨酰氯(ST-FPC) 2. 在HPLC中的應(yīng)用(1) 衍生化的分類 柱前/柱后;在線/離線(2) 衍生化方法 (1) 紫外衍生化 (2) 熒光衍生化 (3) 非對映體衍生化 GC: 提高藥物的揮發(fā)性; 增加藥物的 穩(wěn)定性; 生成非對映異構(gòu)體 HPLC: 提高檢測靈敏度; 改善色譜分離 分析法2022/8/427第三節(jié)體內(nèi)樣品分析方法與方法驗證分析方法的建立一、分析方法的驗證 二、2022/8/428一、分析方法的建立分析方法的選擇分析方法建立的一般程序 (

13、一)(二)2022/8/429(一) 分析方法的選擇 HPLC, GC HPLC-MSn, GC-MS RIA, EIA, FIA; 適用于大分子 TDM應(yīng)用較多 抗生素生物利用度, 等效性, TDM 應(yīng)用較少常用的檢測方法: 色譜分析法, 免疫分析法和生物學(xué)方法 免疫分析法色譜分析法生物學(xué)方法 2022/8/430(二) 分析方法建立的一般程序 待測物,內(nèi)標(biāo)(必要時)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 色譜柱(填料),流動相,溶劑,進(jìn)樣量 試劑/溶劑試驗; 生物介質(zhì)試驗 質(zhì)控樣品試驗 代謝產(chǎn)物對待測物,內(nèi)標(biāo)物的干擾 配伍用藥的干擾分析方法的建立和驗證過程系同步進(jìn)行 為便于討論, 以色譜分析法為例分別敘述1. 色譜條

14、件 的篩選2. 色譜條件 的優(yōu)化3. 實際樣品 的測試2022/8/431二、分析方法的驗證特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍定量下限 (一)(二)(三)精密度與準(zhǔn)確度 (四)樣品穩(wěn)定性 (五)提取回收率 (六)方法樣品2022/8/432二、分析方法的驗證分析過程的質(zhì)量控制未知樣品濃度超限的處理藥用內(nèi)源性物質(zhì)的測定 (七)(八)(九)微生物/免疫學(xué)方法的驗證(十)名詞解釋(十一)分析其他2022/8/433(一) 特異性 比較標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與6個不同個體的空白生物介質(zhì)和QC樣品 軟電離質(zhì)譜(LC-MS)介質(zhì)效應(yīng) 比較QC樣品和至少6個不同個體用藥后的實際樣品 必要時LC-DAD/MS確證峰的單一/同一 比較

15、待測藥物, 同服藥物,待測藥物的QC樣品和添加有同服藥物的干擾樣品 特異性(specificity), 又稱專屬性或?qū)Ｒ恍? 通常與選擇性(selectivity)互用 1.內(nèi)源性物質(zhì)2.未知代謝物 3.伍用藥物 4.參比方法 參比方法橫坐標(biāo)(x), 擬定方法縱坐標(biāo)(y), 最小二乘 y=a+bx a 恒定干擾 b 比例干擾(如, 標(biāo)記抗原不純, 交叉免疫) 2022/8/434(二) 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立(二) 少數(shù)方法(如,IA IA)外, 通常為線性模式 線性回歸: 最小二乘法或加權(quán)最小二乘法 自變量(x)為藥物濃度, 因變量(y)為響應(yīng)信號強度(1) 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液:

16、n6(不包括0點); 等比系列(23); 通常為1001000倍(2) 內(nèi)標(biāo)溶液: 濃度相當(dāng)于系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的幾何平均濃度 (3) 系列標(biāo)準(zhǔn)樣品: 空白生物介質(zhì), 加入系列標(biāo)準(zhǔn)溶液 (4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制: 藥物濃度, 以單位體積(如血漿)或質(zhì)量(如肝臟)的生物介質(zhì)中加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量表示 2022/8/435(二) 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍2. 限度要求通常用至少6個濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線非線性相關(guān)(如IA)可能需要更多濃度點定量范圍覆蓋全部待測樣品濃度范圍定量上限(ULOQ)高于用藥后的峰濃度(Cmax)定量下限(LLOQ)低于Cmax的10%5%(1/101/20)標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點的回歸計算值(x)與標(biāo)

17、示值(x)之間的偏差bias=(x-x)/x100%在可接受的范圍之內(nèi)最低濃度點的偏差在20%以內(nèi)其余濃度點的偏差在15%以內(nèi)2022/8/436(三) 定量下限1. 測定法取同一生物介質(zhì),制備至少5個獨立的標(biāo)準(zhǔn)樣品,其濃度應(yīng)使信噪比(S/N)大于5,依法進(jìn)行精密度與準(zhǔn)確度驗證 定量下限(LLOQ): 標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點 符合準(zhǔn)確度和精密度要求2. 限度要求準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示濃度的80%120%范圍內(nèi),相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)應(yīng)小于20%2022/8/437(四) 精密度與準(zhǔn)確度1. 測定法高中低3個濃度的QC樣品, 制備至少5個獨立的樣品低:LLOQ的23倍;高:ULOQ的80%; 中:幾何平均

18、濃度同法獨立測定3天 方法精密度除評價批內(nèi)(日內(nèi))RSD外, 同時還應(yīng)評價 批間(日間)RSD2. 限度要求準(zhǔn)確度: 低,80%120%; 中高, 85%115%RSD: 低,20%; 中高, 15%2022/8/438(五) 穩(wěn)定性1. 測定法(高低濃度)室溫考察1個工作日(如1,2,4,8或24h) 冷藏(4)數(shù)個工作日(標(biāo)準(zhǔn)儲備液至整個分析完成)冷凍(-20/-80)至整個分析完成凍-融至少經(jīng)歷3個循環(huán) 短期穩(wěn)定性: 在1個分析批內(nèi),樣品室溫等待處理; 處理后溶液在特定(HPLC進(jìn)室)溫度等待進(jìn)樣期間穩(wěn)定性 長期穩(wěn)定性: 在整個樣品分析期間, 體內(nèi)樣品的長期儲藏, 凍融; 以及標(biāo)準(zhǔn)儲備液

19、的穩(wěn)定性2. 期限要求短期: 通常1工作日, 不超過3工作日; 長期: 整個分析完成期限2022/8/439(六) 提取回收率1. 測定法高中低3個濃度的QC樣品, 制備至少5個獨立的樣品另取空白生物介質(zhì),照QC樣品同法處理,加入等量的標(biāo)準(zhǔn)溶液(必要時除去溶劑)同法處理高中低3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)對照樣品(不含生物介質(zhì)) 樣品處理方法的評價重點在于結(jié)果的精密與重現(xiàn); 而非待測物提取的完全與否 2. 限度要求RSD: 低,20%; 中高, 15%2022/8/440(七) 分析過程的質(zhì)量控制每個未知樣品測定一次, 必要時進(jìn)行復(fù)測來自同一個體的體內(nèi)樣品在同一分析批中測定每個分析批, 建立批標(biāo)準(zhǔn)曲線; 并隨

20、行3濃度QC樣品 QC樣品每個濃度至少雙樣本, 并均勻分布在未知樣品順序(低高/高低順序均勻穿插整個分析批)中一個分析批內(nèi)未知樣品數(shù)目較多時, 應(yīng)同時增加各濃度QC樣品數(shù), 使QC樣品數(shù)大于未知樣品總數(shù)的5%QC樣品測定結(jié)果的偏差不大于15%, 低濃度點偏差不大于20%; 允許1/3非同濃度QC樣品結(jié)果超限不符合上述要求, 則該分析批樣品測試結(jié)果作廢2022/8/441(八) 未知樣品濃度超限的處理標(biāo)準(zhǔn)曲線不能外延, 濃度超限的樣品處理后再測定濃度高于ULOQ部分樣品用空白生物介質(zhì)稀釋至規(guī)定體積再測定同時制備濃度高于ULOQ的QC樣品, 同法稀釋(濃度不低于LLOQ)后測定濃度低于LLOQ增加

21、樣品體積(制備樣品濃度高于LLOQ); 同法進(jìn)行QC樣品和空白介質(zhì)試驗特異性不降低, 準(zhǔn)確度和精密度符合要求生物利用度/生物等效性研究, 不需處理2022/8/442(九) 作為藥用的內(nèi)源性物質(zhì)的測定 對生物介質(zhì)進(jìn)行處理生物介質(zhì)通過活性炭濾過、透析等技術(shù)去除所含的該內(nèi)源性物質(zhì)后, 作為空白生物介質(zhì)使用使用特定生物周期階段的生物介質(zhì) 適用于呈周期性變化的內(nèi)源性物質(zhì)(如雌激素)使用替代介質(zhì) 如兔血漿, 人血清蛋白, 緩沖液, 0.9氯化鈉溶液等; 測得的濃度需進(jìn)行校正采用標(biāo)準(zhǔn)加入法 適用于內(nèi)源性物質(zhì)含量較低的藥物; 結(jié)果為總濃度2022/8/443(十) 微生物學(xué)/免疫學(xué)方法的驗證微生物學(xué)或免疫學(xué)

22、分析法的標(biāo)準(zhǔn)曲線本質(zhì)上是非線性的, 應(yīng)盡可能采用更多的濃度點建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如果重復(fù)測定能夠改善準(zhǔn)確度, 則應(yīng)在方法驗證和未知樣品測定中采用同樣的步驟(如雙樣本分析) 微生物學(xué)或免疫學(xué)分析方法驗證實驗應(yīng)包括在幾天內(nèi)進(jìn)行的6個分析批, 每個分析批應(yīng)包括4個濃度(LLOQ、低、中、高濃度)的質(zhì)控雙樣本2022/8/444(十一) 名詞解釋1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(reference standard): 用于制備標(biāo)準(zhǔn)樣品和QC樣品的待測物的參比標(biāo)準(zhǔn)在結(jié)構(gòu)上可以是待測物本身, 也可以是其游離堿或酸, 鹽或酯常用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要有三種來源: 法定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(如ChP標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌?USP標(biāo)準(zhǔn)品); 市售標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(來自于具有良好信譽的供應(yīng)商); 或分析實驗室或科研機(jī)構(gòu)自行合成和/或純化的具有一定純度的化合物生物介質(zhì)(biological matrix): 生物來源的物質(zhì), 能以可重復(fù)的方式采