基因組測(cè)序原理

1、 基因組測(cè)序原理自1977年，桑格測(cè)定了第一個(gè)基因組序列（噬菌體X174的，全長(zhǎng)5375個(gè)堿基）開(kāi)始，基因測(cè)序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到了第三代，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究對(duì)象為特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的總和，主要包括 mRNA和非編碼RNA 。支撐基因組測(cè)序的共有一下幾大技術(shù)：Sanger雙脫氧末端終止法、PCR技術(shù)，這里主要介紹一下第一種技術(shù)。Sanger雙脫氧末端終止法：其基本原理即雙脫氧核苷三磷酸 (ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3-OH，因此每當(dāng) DNA 鏈加入分子 ddNTP，延伸便終止。每一次 DNA 測(cè)序是由 4個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)組成，將模板、引物和 4 種含有不同的放射性

2、同位素標(biāo)記的核苷酸的 ddNTP 分別與DNA 聚合酶混合形成長(zhǎng)短不一的片段，大量起始點(diǎn)相同、終止點(diǎn)不同的 DNA 片段存在于反應(yīng)體系中，具有單個(gè)堿基差別的 DNA 序列可以被聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離出來(lái)，得到放射性同位素自顯影條帶。依據(jù)電泳條帶讀取 DNA 雙鏈的堿基序列，如下圖。 另外，大規(guī)模基因組測(cè)序有兩種方法：逐步克隆法與全基因組霰彈法。 定位克隆原理 定位克隆（positoinal cloning），又稱圖位克?。╩ap-basedclonig），1986年首先由劍橋大學(xué)的AlanCoulson提出。用該方法分離基因是根據(jù)功 能基因在基因組中都有相對(duì)較穩(wěn)定的基因座，在利用分離群體的

3、遺傳連鎖分析或染色體異常將基因佇到染色體的1個(gè)具體位置的基礎(chǔ)上，通過(guò)構(gòu)建高密度的分子連鎖 圖，找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，不斷縮小候選區(qū)域進(jìn)而克隆該基因，并單明其功能和疾病的生化機(jī)制。 人類基因組計(jì)劃已確定了一系列分布于全基因組24條染色體上的分子標(biāo)記。根據(jù)這些分子標(biāo)記的序列和定位信息，結(jié)合雜交或PCR的方法可以快速檢測(cè)染色體上與腫瘤或遺傳性疾病相關(guān)的熱點(diǎn)位置，進(jìn)而從中克隆疾病相關(guān)基因。定位候選克隆克服了經(jīng)典的定位克隆純粹依靠連鎖分析進(jìn)行染色體定位的繁冗而緩慢的弊端，大大加快了克隆工作的進(jìn)程，而且它也不僅僅局限于遺傳病，現(xiàn)在已更多地運(yùn)用于腫瘤易感基因的克隆工作。 定位克隆技術(shù)主要包括以下

4、6個(gè)步驟：1.篩選與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記。利用目標(biāo)基因的近等基因系或分離群體分組分析法（BSA） 進(jìn)行連鎖分析，篩選出目標(biāo)基因所在局部區(qū)域的分子標(biāo)記。2.構(gòu)建并篩選含有大插入片段的基因組文庫(kù)。常用的載體有柯斯質(zhì)粒（cosmid）， 酵母人工染色體（YAC）以及P1，BAC，PAC等幾種以細(xì)菌為寄主的載體系統(tǒng)。用與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫(kù)，得到陽(yáng)性克隆。3.構(gòu)建目的基因區(qū)域跨疊克隆群（contig）。以陽(yáng)性克隆的末端作為探針基因組文庫(kù)，并進(jìn)行染色體步行，直到獲得具有目標(biāo)基因兩側(cè)分子標(biāo)記的大片段 跨疊群。4.目的基因區(qū)域的精細(xì)作圖。通過(guò)整合已有的遺傳圖譜和尋找新的分子標(biāo)記，提高

5、目的基因區(qū)域遺傳圖譜和物理圖譜的密譜的密度。5.目的基因的精細(xì)定位和染色體登陸。利用側(cè)翼分子標(biāo)記分析和混合樣品作圖精確定位目的基因。接著以目標(biāo)基因兩側(cè)的分子標(biāo)記為探針通過(guò)染色體登陸獲得含 目標(biāo)基因的陽(yáng)性克隆。6.外顯子的分離、鑒定。陽(yáng)性克隆中可能含有多個(gè)候選基因。用篩選cDNA文庫(kù)，外是子捕捉和cDNA直選法等技術(shù)找到這些候選基因，再進(jìn)行共分離，時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)，同源性比較等分析確定目標(biāo)基因。 qRT-PCR原理qRT-PCR即實(shí)時(shí)熒光定量PCR，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。qRT-PCR在RT-PCR體系中同時(shí)加

6、入內(nèi)參標(biāo)基因的引物，使目的基因和內(nèi)參基因在同一條件下同時(shí)擴(kuò)增。在擴(kuò)增反映結(jié)束之后，可以通過(guò)凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析，但分析的是PCR終產(chǎn)物，不能準(zhǔn)確分析未經(jīng)PCR信號(hào)放大之前的起始模板量。普通PCR技術(shù)主要是在PCR結(jié)束后對(duì)終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析而qRT-PCR技術(shù)是實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對(duì)起始模板進(jìn)行定量。qRT-PCR涉及到一個(gè)關(guān)鍵詞Ct值，是指擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。此時(shí)擴(kuò)增是呈對(duì)數(shù)期增長(zhǎng)。如下圖所示。定量PCR的數(shù)學(xué)原理理想的PCR反應(yīng)：X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：X=X0(1+Ex)nn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí):XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)XCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量.在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們?cè)O(shè)為M 方程式(1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得:log M=log X0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log M (3)最后