MMFSCNJ出口蜂產(chǎn)品中四環(huán)素族殘留量

1、MM_FS_CNJ_0253口蜂產(chǎn)品 四環(huán)素族 殘留量 微生物牛津杯法MM_FS_CNJ_0253出口蜂產(chǎn)品中四環(huán)素族殘留量適用范圍本方法適用于出口蜂王漿和蜂蜜中四環(huán)素族殘留量的檢驗。原理概要蜂王漿樣品溶解于三氯乙酸或檸檬酸后，經(jīng)離心去除樣品中的蛋白質(zhì)，然后用乙醚除去蜂王漿中的癸烯酸等天然抗生物質(zhì)。通過色譜柱內(nèi)的樹脂吸附和解 脫，用微生物牛津杯法進(jìn)行鑒別試驗，與標(biāo)準(zhǔn)比較進(jìn)行定量。蜂蜜樣品經(jīng)溶解后，直接通過色譜柱內(nèi)的樹脂吸附和解脫，以下檢驗的操作與蜂王漿相同。主要試劑和儀器主要試劑乙醚、甲醇、三氯甲烷以及正己烷；甲醇溶液： 60%(V/ V) ；檸檬酸緩沖溶液： pH 4.0 ；三氯乙酸溶液：2

2、%(V/ V) ；檸檬酸溶液： 2%(V/ V) ；氯化錢-磷酸溶液：稱取1.0g氯化錢，吸取2mL85%|酸液，量取160mL蒸儲 水配制而成；氫氧化鈉溶液： 40%(m/ m) ；磷酸鹽緩沖溶液： 0.1mol/L 。 pH4.5， pH8.0；準(zhǔn)確稱取13.6g磷酸二氫鉀置于950mLTK中溶解，用氫氧化鉀或磷酸二氫鉀調(diào)節(jié) 至pH4.5和pH8.0,然后加水至1 000mL;生理鹽水：0.85%的氯化鈉溶液；吸附樹脂 XAD-2(Amberlite ，苯酚甲醛離子交換樹脂 ) ；處理方法：用甲醇浸泡30min以上，然后用水以傾析法洗滌 56次，浸泡于水 中備用?？股貥?biāo)準(zhǔn)品：四環(huán)素(TC

3、), 土霉素(OTC),金霉素(CTC)。由國家衛(wèi)生部藥 品生物制品檢定所規(guī)定之標(biāo)準(zhǔn)品；抗生素標(biāo)準(zhǔn)貯備液及工作溶液：抗生素標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確地分別稱取 0.050 0g(精確至0.000 1g)抗生素TC, OTCf口 CTC供效彳介為1 000單位/mg),各用0.01mol/L鹽酸溶液溶解后并定容至 50mL抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液為1 000 Ng/mL。配置后在冰箱中保存，在一周內(nèi)使用。 如抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的效價低于1 000單位/mg(1單位=1(1g)。配制時，則換算為 1 000 單位 /mg；抗生素標(biāo)準(zhǔn)工作液：在工作時，吸取抗生素標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用 pH4.5磷酸鹽緩 沖液稀釋配制成 0.05、0

4、.10、0.20、0.40、0.80、1.0和2.0仙g/mL的抗生素 標(biāo)準(zhǔn)工作液；色譜用的展開劑：正丁醇+乙酸+水=4+1 + 5或 正丁醇+甲醇+水=4+1+2培養(yǎng)基及菌種制備：菌種用培養(yǎng)基：胰蛋白胨 .10.0g ；牛肉膏.5.0g ；氯化鈉.2.5g ；瓊脂.14.0 16.0g ;蒸餾水.1 000mL ；制備時，將上述ad各組成分加入e中，攪拌加熱至溶解。于121C,高壓 滅菌 15min,最終 pH為 0.5 0.1 ;檢定用培養(yǎng)基：胰蛋白胨 .6.0g ；牛肉膏.1.5g ；酵母膏.3.0g ；瓊脂.14.0 16.0g ;蒸餾水.1 000mL ；制備時，將上述ad各組成分加

5、入e中，攪拌加熱至溶解，經(jīng)121c高壓滅 菌 15min,最終 pH為 5.8 0.1 ;試驗菌種：蠟樣芽孢桿菌 （Bacilluscereus Varmycoides） ，菌種號 63301， 由國家衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所規(guī)定的菌種；菌種培養(yǎng)：將菌種安瓿瓶管的上部敲碎后，加入少量肉湯培養(yǎng)基，使其溶解并移至肉湯管中混勻。置于30 1C培養(yǎng)24 ho取菌種單個菌落接種于菌種培養(yǎng)基中。采用試管斜面或克氏瓶內(nèi)培養(yǎng)， 置于 30 1培養(yǎng)1 周。 鏡檢芽孢菌數(shù)達(dá)到85%以上，便可制備芽孢懸浮液；芽孢懸浮液制備：用適量滅菌的生理鹽水洗下菌苔，于 65恒溫水浴中加熱30min， 再以 2 000r/min

6、離心20min,棄去上清液，重復(fù)23次。最終用適量的滅菌生理鹽水稀釋， 即為芽孢懸浮液，置于冰箱中保存使用。有效期為一個月；平板制備：于滅菌后冷卻至5055c的檢定培養(yǎng)基中加入適量的菌液（如抱子懸浮液中 的菌數(shù)在107個/mL時，則按約0.1%量加入；如果106個/mL時，則按約0.5咐口 入，使0.05 （ig/mL的TC標(biāo)準(zhǔn)液抑菌圈直徑達(dá)到12mm）混勻后，立即注入平 板。每個平板直接注入檢定用培養(yǎng)基6.0mL,凝固后備用。儀器培養(yǎng)皿：內(nèi)徑90mm底部平整光滑的玻璃皿，或塑料皿上用陶瓦蓋；牛津杯：外徑80.1mm內(nèi)徑6 + 0.1mm1高100.1mm的不銹鋼杯，重量誤差不超過 0.05g

7、 ；游標(biāo)卡尺：測量范圍，0150mm精度為0.1mm長方形培養(yǎng)皿：1.5cm X8cmX 23cm；色譜柱：內(nèi)徑1cm,長30cmi具有活塞調(diào)節(jié)流速；層析柱的制備：先用少許玻璃棉置于柱的底部，然后加入經(jīng)處理的 XAD-2 樹脂15mL樹脂上端加入少許玻璃棉，并用 300mL*,以150mL/h流速洗柱后備用；色譜缸：20cmx 15cmx 30cmi微量注射器：10L或50仙L;半對數(shù)方格紙。離心機(jī)：轉(zhuǎn)速范圍04000r/min ；旋轉(zhuǎn)式真空濃縮器；恒溫培養(yǎng)箱： 30 1，隔層置玻璃板并調(diào)節(jié)水平位置；恒溫水浴鍋；高壓滅菌器；水平臺，帶水平器；色譜紙：6cmx 20cm過濾紙；分液漏斗。氮氣：純

8、度99.99%;其他玻璃器皿。試樣的抽取與制備檢驗批蜂王漿以每一生產(chǎn)缸（ 約 300kg） 為一檢驗批。蜂蜜以不超過1000件為一檢驗批。同一檢驗批的樣品，應(yīng)具有相同的特征，如包裝、標(biāo)記、產(chǎn)地、規(guī)格和等級等。抽樣數(shù)量對蜂王漿，每一生產(chǎn)缸取一份樣。對蜂蜜，不超過 50件包裝取5件；51 100件，取10件；101500件，每增加100件，增取5件；501件及以上，每 增加100件，增取2件。每件抽取樣品不少于100g,作為原始樣品。抽樣工具取樣器：不銹鋼匙。不銹鋼管，長約115cm直彳約2.5cm,或帶活塞玻璃管；混樣器：搪瓷桶或杯；單套桿：不銹鋼制；樣品瓶：100mL 500mL磨砂蓋廣口玻璃

9、瓶。抽樣方法蜂王漿：按每缸的上、中、下三個部位抽樣，樣品混勻后，裝入樣品瓶內(nèi)，標(biāo)明標(biāo)記并及時送實驗室冰箱中保存。蜂蜜：按 4.2 的抽樣件數(shù)隨機(jī)抽取，逐件開啟。將玻璃取樣管緩緩放入，吸取樣品。如遇蜂蜜結(jié)晶時，則用單套桿或不銹鋼取樣管插到底，抽取樣品。將所取樣品傾入混樣器，混和均勻，裝入清潔的樣品瓶內(nèi)，加封后，標(biāo)明標(biāo)記，及時送實驗室。試樣制備蜂王漿樣品從冰箱中取出后，在室溫下融化，攪拌均勻。蜂蜜中未結(jié)晶的樣品將其用力攪拌均勻， 對有結(jié)晶析出的樣品可將樣品瓶蓋塞緊后，置于不超過40的水浴中溫?zé)幔龢悠啡咳诨髷噭颍杆倮鋮s至室溫，在融化時必須注意防止水分揮發(fā)。上述蜂王漿及蜂蜜試樣均分成兩份，裝入

10、潔凈容器內(nèi)，密封，并標(biāo)明標(biāo)記。試樣保存蜂王漿：將試樣于 18冷凍保存。蜂蜜：將試樣于室溫保存。注：在抽樣和制樣的操作過程中，必須防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。過程簡述樣液提取蜂王漿樣液提取準(zhǔn)確稱取5.0g（精確至0.1g）蜂王漿于小燒杯中，用80mL2喔氯乙酸溶液分 數(shù)次溶解。 定量地移入離心管中， 以 2000r/min 離心 10min。 將上清液移入250mL分液漏斗中。下層沉淀物再分別加入 40、20mL2%氯乙酸溶液攪勻后離心，合 并上清液于分液漏斗中。上述上清液分別用60、60和30mL乙醴振搖，提去癸烯 酸，棄去上層乙醚，將下層水溶液收集于燒杯中，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)

11、節(jié)pH至4.5,并加入pH4.5磷酸鹽緩沖溶液60mL備用?；驕?zhǔn)確稱取蜂王漿5.0g（ 精確至 0.1g） 于小燒杯中，加入100mL 2%檸檬酸溶液，搖勻后，加入100mL氯甲烷，振搖后移入離心管中，并以 2000r/min離心 10min。棄去下層三氯甲烷，加入100mL乙醴，充分振搖，離心后棄去上層乙醴 層。再加100mL乙醴重復(fù)一次。于留下水相中加入20mL氯化錢-磷酸溶液，用40%氧化鈉?液調(diào)節(jié)pH至5.0,再加入100mLE己烷，振搖后離心。去除正己 烷層，用氮氣流吹除樣液中有機(jī)試劑。將經(jīng)上述步驟中任一種提取的試樣溶液，移入裝有XAD-2樹脂的層析柱中，并以 100mL/h 的流速

12、過柱， 使樣液中的四環(huán)素族被吸附。 四環(huán)素族被樹脂吸附后，用200mL蒸儲水洗柱，流速控制為150mL/h。繼用90mL 60刈醇洗脫四環(huán)素族， 其流速為90mL/h,并用甲酉!定容至100mL#用。蜂蜜樣液提取準(zhǔn)確稱取約50g（精確至0.1g）蜂蜜于300m設(shè)杯中，加入200mLpH4.0檸檬 酸緩沖溶液， 攪拌均勻， 使試樣充分溶解后， 用 2%檸檬酸溶液或40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH至4.5,并加入60mLpH4.5磷酸鹽緩沖溶液。然后移入裝有XAD-2 樹脂的色譜柱中，以100mL/h流速過柱，使樣液中的四環(huán)素族被吸附。以下操作 步驟與上述蜂王漿的步驟相同。收集甲醇淋洗液于100mL

13、容量瓶中,并用60%ff醇定容至刻度，備用。定量試驗標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取 5個試驗用的平板， 每個平板上放5 個牛津杯， 分別注滿 0.05、0.10 、0.20 、0.40和0.80 Ng/mL的TC標(biāo)準(zhǔn)工作液，并于30 1C培養(yǎng)201 h。然后測量各 濃度的TC的抑菌圈直徑，求得各自的平均值，并經(jīng)回歸方程校正后，在半對數(shù) 紙上，以抑菌圈直徑為縱坐標(biāo)， TC 濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次試驗時都需制備相應(yīng)的TG OTC CTC標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣液的定量試驗準(zhǔn)確吸取50mLM王漿的甲醇提取液于梨形瓶中；而蜂蜜僅取10mL的甲醇提取液。在40減壓濃縮至干后，準(zhǔn)確加入5.0mL pH4.5 磷酸鹽緩沖液，

14、使?jié)饪s物被溶解。此樣液中，相當(dāng)于蜂王漿試樣濃度為0.5g/mL ，相當(dāng)于蜂蜜試樣濃度1.0g/mL 。取5個試驗平板，每個平板放 4個牛津杯。每板分別注滿一個 0.05 Ng/mL 和一個0.10仙g/mL的TCfe準(zhǔn)工作液及二個蜂王漿試樣提取液或二個蜂蜜試樣提 取液。置于30 1培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 1 h 后，測量抑菌圈直徑，分別求得它們的平均值。經(jīng)校正后，檢液的抑菌圈大于12mniM,應(yīng)進(jìn)行鑒別試驗并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出檢液中的TC含量。如果檢液的抑菌圈小于 0.05祖g/mL的TC標(biāo)準(zhǔn)液的抑 菌圈時，則可報告為“未檢出抗生素” 。試驗不用進(jìn)行下去。鑒別試驗加熱分解反應(yīng)試驗取50mLt王漿的甲醇提

15、取液,而對蜂蜜則取 10mL的甲醇提取液，置于犁形 瓶中，于40c減壓濃縮至干。加入 5.0mL pH8.0磷酸鹽緩沖溶液，備作加熱分 解反應(yīng)。取2支刻度試管，每管加入2.5mL上述溶液，其中1支置于沸水浴中， 加熱30min,然后用1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)2支試管內(nèi)檢液至pH4.5,再用pH4.5 磷酸鹽緩沖溶液分別定容至 5.0mL。同時于2支刻度試管中分別吸取 2.5mL0.2 卜g/mL的TC標(biāo)準(zhǔn)工作液(用pH8.0磷酸鹽緩沖溶液配制成)，按試樣提取液同樣 操作，最終定容至？.0mL。取2個平板，各放4個牛津杯，每個杯中分別注入加熱檢液、未加熱檢液、加熱后的TC標(biāo)準(zhǔn)工作液和未加熱的TC

16、標(biāo)準(zhǔn)工作液。然后將平板置于30 1C培 養(yǎng)20 1h,觀察和測量各抑菌圈直徑。在未加熱的0.1仙g/mL TC標(biāo)準(zhǔn)工作液呈現(xiàn)出正常的抑菌圈，而加熱的0.1(1 g/mL TC標(biāo)準(zhǔn)工作液不出現(xiàn)抑菌圈的條件下，說明人工合成的抗生素在加熱中 被分解破壞。因此，未加熱檢液的抑菌圈直徑在12mn上，而加熱檢液的抑菌圈直徑在10mmz下，可初步推定檢液中含有 TC族抗生素，并需作定性試驗。 5.3.2.定性試驗本法采用微生物色譜法進(jìn)行定性試驗。用pH4.5磷酸鹽緩沖溶液噴涂于色譜 用紙(7cm x 22cm)上，自然干燥后備用。定性試驗的檢液的制備，如是蜂王漿試樣，準(zhǔn)確稱取5.0g試樣后按5.1.1中樣液

17、提取的操作步驟進(jìn)行，收集 100mL甲醇提取液于40c減壓濃縮至干，用 0.1mL甲醇溶解。如是蜂蜜試樣，按5.1.2樣液的提取操作步驟進(jìn)行，所收集的 100mL甲醇提取液中，吸取20mL置于40c減壓濃縮至干，用0.1mL甲醇溶解。取TC和OTCfe準(zhǔn)工作液的濃度為2.0仙g/mL, CTC勺標(biāo)準(zhǔn)工作7W勺濃度為1.0 g/mL,以及定性用的試樣提取液各1020 pL,分別用微量注射器吸取并點在 上述備用濾紙上。將濾紙移放在盛有展開液的色譜缸中，展開35 h后，取出。待溶劑揮發(fā)后，將濾紙輕輕貼在事先加有60mL含有菌液的檢定用培養(yǎng)基的長方形培養(yǎng)皿中，移至4c的冰箱中放置1 h 0取出培養(yǎng)皿，棄去濾紙，將培養(yǎng)皿置 于30 1C進(jìn)行培養(yǎng)201 h0根據(jù)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基上出現(xiàn)的抑菌圈的位置，測 得各抗生素的Rf值，對照標(biāo)準(zhǔn)，以確定被檢試樣中所含 TC族抗生素的種類。 6.結(jié)果計算檢液的抑菌圈平均直徑小于 0.05 pg/mL的TC標(biāo)準(zhǔn)工作液抑菌圈平均直徑 的，可以結(jié)束試驗，出具結(jié)果為“未檢出抗生素”。2.如在定量試驗中，檢