免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的檢測課件

1、第十三章 免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的檢測 免疫缺陷癥自身免疫病腫瘤 淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和功能的變化 機(jī)體細(xì)胞免疫水平 第一節(jié) 免疫細(xì)胞的分離與純化 外周血的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板，可根據(jù)它們的理化特性，如細(xì)胞大小、密度、表面電荷和粘附能力等存在差異，分離不同的細(xì)胞群體。但淋巴細(xì)胞理化特性與其它細(xì)胞差異甚微，不容易分純，所以產(chǎn)生了專門的淋巴細(xì)胞分離純化技術(shù)，旨在于獲得高純度、高收率和高活性的不同類型和不同亞群特點(diǎn)的淋巴細(xì)胞。 一、白細(xì)胞分離：自然沉降法紅細(xì)胞密度1.093白細(xì)胞密度1.092灰白層 二、外周血單個(gè)核細(xì)胞分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）：包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)

2、胞。 紅細(xì)胞密度1.093粒細(xì)胞密度1.092單個(gè)核細(xì)胞密度1.075-1.090血小板密度1.030-1.035 密度為1.075-1.092的等滲分離溶液 離心可分離各種血細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞 分離溶液的基本要求： 對(duì)細(xì)胞無毒； 基本等滲； 不溶于血漿等分離物質(zhì)； 有一定的比重。較理想的細(xì)胞分層液：聚蔗糖泛影葡胺，商品名為：Ficoll Ficoll分離液法：單次差速密度梯度離心的分離法。方法：1、細(xì)胞分層液置試管底層；2、將肝素抗凝全血以Hanks液或PBS液作適當(dāng)稀釋后，輕輕疊加在分層液上面；3、水平式離心；4、離心管中會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)不同層次的液體和細(xì)胞帶（見圖） 本法分離的單個(gè)核細(xì)胞純度可達(dá)

3、95%，淋巴細(xì)胞約占90%95%，細(xì)胞收率可達(dá)80%以上，但室溫超過25時(shí)可影響細(xì)胞收率。 用Percoll原液（密度1.135）與約等量的磷酸緩沖液均勻混合，經(jīng)高速離心后，可使分離液形成一個(gè)從管底到液面密度逐漸遞減的連續(xù)密度梯度，再將已制備的單個(gè)核細(xì)胞懸液輕輕疊加在液面上，低速離心后，便得四個(gè)細(xì)胞層。（見圖） 三、淋巴細(xì)胞的純化與亞群的分離（一）淋巴細(xì)胞的純化1、貼壁粘附法：利用單核細(xì)胞貼壁生長的特點(diǎn)；B細(xì)胞會(huì)有所損失。2、吸附柱過濾法：同樣利用單核細(xì)胞具有貼壁生長的特點(diǎn)，粘附能力為：巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞樹突細(xì)胞B細(xì)胞T細(xì)胞=紅細(xì)胞。3、磁鐵吸引法：利用單核細(xì)胞縣有吞噬的特性，加入直徑為3m的

4、羰基鐵顆粒。（二）、淋巴細(xì)胞亞群的分離1、E花環(huán)沉降法：基本原理是利用T細(xì)胞有羊紅細(xì)胞受體（E受體），可以與羊紅細(xì)胞結(jié)合形成較大的E花環(huán)的特性，可將T細(xì)胞和B細(xì)胞分離。2、尼龍毛柱分離法：利用B細(xì)胞和單核細(xì)胞具有易粘附于尼龍纖維表面的特性，將T細(xì)胞和B細(xì)胞分離。 3、親和板結(jié)合分離法：利用親和層析和抗體固相包被原理。第二節(jié) 淋巴細(xì)胞數(shù)量的檢測一、T淋巴細(xì)胞數(shù)量的檢測 （一）、免疫熒光法：直接法、間接法 （二）、酶免疫組織化學(xué)法：以酶作為抗體標(biāo)記物細(xì)胞酶免疫組化生物素鏈霉親和素放大系統(tǒng)提高靈敏度（三）、花環(huán)技術(shù)1、E花環(huán)試驗(yàn)2、抗體致敏花環(huán)法 用相應(yīng)的抗CD3單克隆抗體吸附于醛化的紅細(xì)胞（致敏）

5、+受檢細(xì)胞抗原抗體反應(yīng)受檢細(xì)胞周圍粘附3個(gè)或3個(gè)以上紅細(xì)胞為花環(huán)形成細(xì)胞，計(jì)算花環(huán)形成細(xì)胞與計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞之比。（見圖） E花環(huán)試驗(yàn)結(jié)果示意圖 二、B淋巴細(xì)胞數(shù)量的檢測（一）、CD抗原的檢測（二）、SmIg的檢測：鑒定B細(xì)胞可靠的指標(biāo)。 第三節(jié) 淋巴細(xì)胞功能的檢測淋巴細(xì)胞功能測定是在免疫缺陷病及多種疾病的發(fā)病機(jī)制、療效判斷、免疫治療及預(yù)后的重要依據(jù)?？煞譃轶w內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)。 一、T淋巴細(xì)胞功能的檢測1、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 刺激物 基本原理：T細(xì)胞敏感刺激物在體外刺激T細(xì)胞T細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化根據(jù)其增殖轉(zhuǎn)化能力評(píng)定相應(yīng)的細(xì)胞功能。非特異性特異性形態(tài)法外周血或單個(gè)核細(xì)胞+刺激物涂片染色鏡檢參考值：60%

6、80%，小于50%視為降低。 評(píng)價(jià)：方法簡便易行，受主觀因素影響大。37培養(yǎng)72小時(shí)放射性核素法外周血或單個(gè)核細(xì)胞+刺激物 加適量3H-TdR 記錄每分鐘脈沖數(shù)（cpm）SI=PHA刺激管cpm均值/空白對(duì)照管cpm均值。評(píng)價(jià)：結(jié)果客觀，但價(jià)格昂貴，有放射性核素污染。37培養(yǎng)56小時(shí)培養(yǎng)16小時(shí)MTT比色法 外周血或單個(gè)核細(xì)胞+刺激物加適量MTT混勻比色法測OD值。評(píng)價(jià)：方法敏感、簡單、快速、無污染。37培養(yǎng)70小時(shí)培養(yǎng)46小時(shí)二、B淋巴細(xì)胞功能的檢測臨床常檢測各類抗體 B細(xì)胞的功能對(duì)于免疫缺陷患者或科研實(shí)驗(yàn)時(shí)：反向溶血空斑試驗(yàn)：檢測人類Ig分泌細(xì)胞.淋巴細(xì)胞+SPA-SRBC+抗人Ig抗體+

7、補(bǔ)體 溶血空斑。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)：檢測抗體分泌細(xì)胞，又可檢測抗體分泌量?？乖还滔噍d體淋巴細(xì)胞酶標(biāo)二抗 底物顯色。評(píng)定3735小時(shí)第四節(jié) 吞噬細(xì)胞功能的檢測吞噬細(xì)胞單核一巨噬細(xì)胞系統(tǒng)：非特異性地吞噬；特異性免疫過程起作用。中性粒細(xì)胞：以吞噬功能為主，發(fā)揮非特異性免疫防疫作用并參與機(jī)體的免疫應(yīng)答炎癥損傷等。吞噬活動(dòng)：趨化、吞噬、胞內(nèi)殺滅作用三個(gè)階段。一、中性粒細(xì)胞功能的檢測（一）、中性粒細(xì)胞趨化功能的測定 瓊脂糖凝膠平板法（二）、中性粒細(xì)胞吞噬功能測定 待檢細(xì)胞懸液+白色念珠菌懸液 美藍(lán)染色涂片鏡檢吞噬率61%-64%，對(duì)大腸桿菌殺菌率90%，對(duì)金葡菌殺菌率85%保溫二、巨噬細(xì)胞功能檢測基本原

8、理：人巨噬細(xì)胞與雞紅細(xì)胞（CRBC）混合后孵育，通過計(jì)算巨噬細(xì)胞吞噬CRBC百分率和吞噬指數(shù)判斷人巨噬細(xì)胞的吞噬功能。參考值：吞噬率61%64%；吞噬指數(shù)接近于1。第五節(jié)、細(xì)胞因子的檢測細(xì)胞因子：是由活化的免疫細(xì)胞及某些基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)并分泌的活性物質(zhì)，其生物學(xué)功能是介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)或多肽。測定方法：分子生物學(xué)測定方法，免疫測定方法、生物學(xué)測定方法。種類：白細(xì)胞介素、集落刺激因子、干擾素、腫瘤壞死因子、生長因子、趨化因子。表現(xiàn)為細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。1、 免疫學(xué)檢測定法細(xì)胞因子的化學(xué)本質(zhì)是蛋白或多肽，因而很容易制備得到相應(yīng)的抗細(xì)胞因子的特異單克隆和（或）多克隆抗體，從而建立相應(yīng)細(xì)胞因子的高特異性的免疫測定方法。主要方法：1、ELISA：用于可溶性細(xì)胞因子測定；2、流式細(xì)胞分析法3、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的免疫測定2、生物學(xué)測定方法基本原理：根據(jù)待測細(xì)胞因子特定的生物學(xué)活性，應(yīng)用相應(yīng)的靶細(xì)胞指示系統(tǒng)，如各種依賴性細(xì)胞株，加入特定的細(xì)胞因子，觀察靶細(xì)胞的相應(yīng)反應(yīng)，同時(shí)與特定的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，從而由已知標(biāo)準(zhǔn)品推知標(biāo)本中特定的細(xì)胞因子的活性水平，結(jié)果以活性單位（u/ml）表示。（1）、細(xì)胞增殖法（2）、靶細(xì)胞殺傷法 （3）、細(xì)胞病變抑制法 3、分子生物學(xué)測定法