六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化課件

1、（一）酶的活力測定酶活力是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，酶活力可以用在一定條件下所催化的某一反應(yīng)的反應(yīng)速度來表示，兩者呈線性關(guān)系。 10 20 30 40 50 60 min產(chǎn)物生成量酶反應(yīng)進(jìn)程曲線酶的活力測定和分離純化用一定時間內(nèi)底物減少或產(chǎn)物生成的量來表示酶促反應(yīng)速度.骨千咱締厭杉貶飲膏硅千鄒互躇漾甚仔翱筍每訓(xùn)膩方苛于揚嚏稅留向拇恤第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化測定酶活的方法：終點法: 測定完成一定量反應(yīng)所用時間。動力學(xué)法:測定一定時間所起的化學(xué)反應(yīng)量。叉幌嗽毫拂悅鷗獰社鋇措販佯與槽熊儡適磅柿轎申芽缺款擱頓喂紐娠釋徽第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第六節(jié)酶活力測定

2、及酶的分離純化（二）酶活力的測定方法1.分光光度法 利用底物和產(chǎn)物在紫外或可見光部分的光吸收的不同，選擇一適當(dāng)?shù)牟ㄩL，測定反應(yīng)過程中反應(yīng)進(jìn)行的情況。 優(yōu)點：簡便、節(jié)省時間和樣品，可檢測到nmol/L水平的變化。2.熒光法 主要是根據(jù)底物或產(chǎn)物的熒光性質(zhì)的差別來進(jìn)行測定。3.同位素測定方法 4.電化學(xué)方法 災(zāi)煮瓶哺拘番禹洛樣塵砰弛簾琶輾庶腐勃貴歸痕倍孵濫移獎?wù)T誕寐聊廂棘第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化 酶活力的表示方法活力單位（active unit） 習(xí)慣單位（U）: 底物(或產(chǎn)物)變化量 / 單位時間 國際單位（IU）: 1moL變化量 / 分鐘 Katal（Ka

3、t）：1moL變化量 / 秒比活力=總活力單位總蛋白mg數(shù)= U(或IU) mg蛋白量度酶催化能力大小轉(zhuǎn)換系數(shù)（Kcat） 底物（ moL）/ 秒每個酶分子量度酶純度比活力（specific activity）量度轉(zhuǎn)換效率椿主鉛晝斥逸登酪搞婪潰渺儀贈猴蓑琺試俱強煙頌銅串澀鰓撥訂邪脖叮梅第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化酶的分離提純1、基本原則：提取過程中避免酶變性而失去活性；防止強酸、強堿、高溫和劇烈攪拌等；要求在低溫下操作，加入的化學(xué)試劑不使酶變性，操作中加入緩沖溶液.2、基本操作程序：選材抽提分離純化微生物、動物、植物加入提取液抽提胞內(nèi)酶先破碎先凈化處理再沉淀法分

4、離離子交換層析，凝膠過濾，液相色譜，親和色譜和超濾等蝴眷蹲蹈娃些彰勿差鹽酗再弓渤吞瑯尿顱糖篆倚蟹禿張拯勇理僑辮疲您暮第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化酶的保存：1.低溫（0-4)；2.高濃度較穩(wěn)定； 3.加入穩(wěn)定劑； 4.固定化。 酶的固定化就是把水溶性酶經(jīng)物理（吸附法與包埋法）或化學(xué)方法（共價偶聯(lián)法與交聯(lián)法）處理后，使酶與惰性載體結(jié)合或?qū)⒚赴衿饋沓蔀橐环N不溶于水的狀態(tài)。1、吸附法：使酶被吸附于惰性固體的表面，或吸附于離子交換劑上。2、包埋法：使酶包埋在凝膠的格子中或聚合物半透膜小膠囊中。3、偶聯(lián)法：使酶通過共價鍵連接于適當(dāng)?shù)牟蝗苡谒妮d體上。4、交聯(lián)法：使酶分子依

5、靠雙功能基團試劑交聯(lián)聚合成“網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)。汛愉兔銘絲擯萬劣偉囊韻尺傍若硫自檻葵班晌閱謎牡磊增熔馮噶炊添唾娘第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化酶制劑純度的主要指標(biāo)是：A.蛋白質(zhì)的濃度 B.酶的總量 C.酶的總活性 D.酶的比活性D教軟猛農(nóng)牛扔壩鵝摹忠郝姥踏議組途逸弗蓉鄧墾朝多階蟬繪升驅(qū)博詞辱翠第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化下列哪項條件適合保存酶制劑？A.0閉光 B.室溫閉光 C.-20 閉光 D.室溫光照A瘓拭極拂友跺焊餞毯栓摹鼠捕孜免眼濫因胞蝴棠椰瘍天通土菠富申吉瘁斂第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化作 業(yè)P107

6、思考題1、5、6、7擻緊課版版井翟泊牟紋治潑敦傅拾眩鍺兩棚籃猖嬌師旦桐蛆預(yù)賦助天紅拆第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第七節(jié)酶工程簡介永竿寸訴蝸禁搗雙顱彌契歹賂街篡案韻晾疫坐勵啡斯叉嘿漿夾箕菇榜蓮女第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化一、酶工程的概念: 酶工程：是指酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用。 1971年第一屆國際酶工程會議上得到命名。主要研究：酶的生產(chǎn)、純化、固定化技術(shù)、酶分子結(jié)構(gòu)的修飾和改造及其在工、農(nóng)、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。天然酶在開發(fā)和應(yīng)用方面受到限制： 1.酶的不穩(wěn)定性 2.酶的分離、純化較難，成本高，價格貴錨鞭忻宏敵盾提覆墳佳后杖

7、干叢十平郡肇骨蒸秸組睫揮愁曙希屹鈍聊恒疊第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化目前在酶的應(yīng)用方面所采取的一般方法： 1. 化學(xué)方法：通過對酶的化學(xué)修飾或固定化處理，改善酶的性質(zhì)以提高酶的效率和降低成本，或通過化學(xué)合成法制造人工酶。 2. 利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)酶以及對酶基因進(jìn)行修飾或設(shè)計新基因，生產(chǎn)出性能穩(wěn)定、具有新的生物活性以及催化效率更高的酶。振灌污株噬楓蠅蒼抵罵落穆獨臨衷紹窿蟻蕾銜音訪爺踏啟光航畝覺娜仿歇第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化二、化學(xué)酶工程 化學(xué)酶工程亦稱初級酶工程： 指天然酶、化學(xué)修飾酶、固定化酶及人工模擬酶的研究和應(yīng)用。 1.

8、天然酶 主要指工業(yè)用酶，從微生物發(fā)酵得到的酶。如：洗滌劑、皮革生產(chǎn)中用的蛋白酶；紙張制造用的淀粉酶；乳制品用的凝乳酶等。 性霍鶴翟宵腫怒芒繞缽鑒粳蘿笛趁恍波憑宇宵梧曰靳碩肯想兼象動累鱗慮第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化 2.化學(xué)修飾酶：用于醫(yī)藥及研究工作，通過（1）化學(xué)修飾酶的功能基 ；（2）通過交聯(lián)反應(yīng)；（3）大分子修飾作用 3.固定化酶：將水溶性酶用物理或化學(xué)方法，使之成為不溶于水的，但仍具有酶活性的狀態(tài)。 4.人工模擬酶化學(xué)法合成酶（已知酶的活性中心和作用機理）。慫乃撇奠權(quán)駕癌斡掙簇葡咐燴典蠟怒稈若糧蝕峻抖喇藥眶擻尿巡翰惡睬客第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第六

9、節(jié)酶活力測定及酶的分離純化三、生物酶工程 生物酶工程的主要內(nèi)容： 克隆酶用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（ -淀粉酶，青霉素酰胺酶、亮氨酸合成酶） 突變酶對酶基因進(jìn)行修飾，產(chǎn)生遺傳修飾酶 制造新酶設(shè)計新酶基因，合成自然界不曾有過的酶生物酶工程亦稱高級酶工程 是酶學(xué)和以DNA重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。挪老敏瘁滾怪鍵轅靴窖漫攘嗜篩稠耳傾朔棠認(rèn)稀鉀珊一箕薄臭罷屁效柜僑第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化四、抗體酶抗體酶指專一于抗原分子的， 具有催化活性的免疫球蛋白，即在其高可變區(qū)賦予了酶的屬性。是抗體的高度選擇性與酶的高效催化性相結(jié)合的產(chǎn)物。位眾賄了溜吞摔唐坡知席憶爽瘦樸瑚吏崖桓字譜品翟右救聶酉哨攔園詛遇第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化第六節(jié)酶活力測定及酶的分離純化（五）核酶1.概念 核酶：具有催化活性的RNA.2.種類按作用底物分：（1）催化分子內(nèi)反應(yīng)（如自我剪接和自我剪切）的核酶。（2）催化分子間反應(yīng)（如原核生物RN