蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和功能

1、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和功能1.構(gòu)象(conformation)指的是，一個(gè)由多個(gè)碳原子組成的分子，因單鍵的旋 轉(zhuǎn)而形成的不同碳原子上各取代基或原子的空間排列，只需單鍵的旋轉(zhuǎn)即可造 成新的構(gòu)象。多肽鏈主鏈在形式上都是單鍵。因此，可以設(shè)想一條多肽主鏈可 能有無(wú)限多種構(gòu)象。然而，一種蛋白質(zhì)的多肽鏈在生物體正常的溫度和pH下只 有一種或很少幾種構(gòu)象，并為生物功能所必需。這種天然的構(gòu)象是什么樣的因 素促成的？答：由于肽鍵因共振結(jié)構(gòu)而使C-N鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)，不能自由旋 轉(zhuǎn)，因而使得一條多肽主鏈構(gòu)象的數(shù)目受到了極大限制。與位于相鄰剛性平面 交線上的Ca相連接的側(cè)鏈基團(tuán)的結(jié)構(gòu)、大小和性質(zhì)對(duì)于主鏈構(gòu)象的形成及

2、穩(wěn)定 有很大的影響，使多肽鏈主鏈構(gòu)象數(shù)目又受到很大的限制。因?yàn)镃a與兩個(gè)剛性 平面連接的單鍵的旋轉(zhuǎn)度不同程度受到側(cè)鏈的限制。各種側(cè)鏈基團(tuán)相互作用所 形成的各種力使蛋白質(zhì)在熱力學(xué)上達(dá)到了一種最穩(wěn)定的構(gòu)象2 .假若一條多肽鏈完全由丙氨酸構(gòu)成，什么樣的環(huán)境促使它很可能形成a -螺旋，是疏水環(huán)境還是親水環(huán)境？答；一條多肽鏈呈a -螺旋構(gòu)象的推動(dòng)力是所有肽鍵上的酰胺氫和羰基氧之間形成的鏈 內(nèi)氫鍵。在水環(huán)境中，肽鍵上的酰胺氫和羰基氧既能形成內(nèi)部(a-螺旋內(nèi))的氫鍵，也能與水 分子形成氫鍵。如果后者發(fā)生，多肽鏈呈現(xiàn)類(lèi)似變性蛋白質(zhì)那樣的伸展構(gòu)象。疏水環(huán)境對(duì)于 氫鍵的形成不能提供任何競(jìng)爭(zhēng)，因此，更可能促進(jìn)a -

3、螺旋結(jié)構(gòu)的形成。以nm為單位計(jì)算a -角蛋白卷曲螺旋(coiled coil)的長(zhǎng)度。假定肽鏈?zhǔn)怯?00個(gè) 殘基構(gòu)成。答：a -角蛋白的每條肽鏈呈a -螺旋構(gòu)象，而每個(gè)a -螺旋含3.6個(gè)殘基。在a -角蛋白 中，每輪螺旋的長(zhǎng)度為0.51nm。因此，a-角蛋白卷曲螺旋(coiled coil)的長(zhǎng)度是：(100 殘基-4-3.6 個(gè)殘基/輪)X0.51/輪= 14.2nm一種叫做Schistosoma mansoni寄生蟲(chóng)的幼蟲(chóng)能感染侵入人的皮膚。這種幼蟲(chóng)分泌 出能裂解的-Gly-Pro-X-Y- (X和Y可能是幾種氨基酸中的任何一種)順序中的X和Y之間 肽鍵的酶。為什么該酶活性對(duì)這種寄生蟲(chóng)侵

4、入是重要的。答：-Gly-Pro-X-Y-順序頻繁出現(xiàn)在膠原蛋白分子中，在身體的各部位都存在，包括皮膚。 由于該幼蟲(chóng)酶能催化膠原蛋白多肽鏈裂解，故該寄生蟲(chóng)能進(jìn)入宿主皮膚而生存。是Trp還是Gln更有可能出現(xiàn)在蛋白質(zhì)分子表面？是Ser還是Val更有可能出 現(xiàn)在蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部？是Leu還是Ile更少可能出現(xiàn)在a -螺旋的中間？是Cys還是 Ser更有可能出現(xiàn)在0新疊中？答：蛋白質(zhì)氨基酸殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的位置與這些氨基酸殘基的親水性或疏水性 相關(guān)。親水性殘基（極性殘基）通常位于蛋白質(zhì)分子的表面，而疏水性殘基（非極性殘基） 通常位于蛋白質(zhì)分子疏水的內(nèi)部。Gln是親水性殘基，它比Trp更有可能出

5、現(xiàn)在蛋白質(zhì)分 子表面。Vd是非極性殘基，它比Ser更有可能位于蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部。Ile在它的8碳 位上有分支，不利于a -螺旋的形成，因此它通常不出現(xiàn)在a -螺旋中。側(cè)鏈小的氨基酸殘 基常出現(xiàn)在8 -折疊中，因?yàn)檫@有利于片層的形成。所以Ser更有可能出現(xiàn)在8-折疊中。下面的多肽哪種最有可能形成a 螺旋？哪種多肽最難以形成P 折疊？ CRAGNRKIVLETY； SEDNFGAPKSILW； QKASVEMAVRNSG答：多肽最有可能形成。-螺旋，因?yàn)樗娜齻€(gè)帶電荷的殘基（Lys,Glu,Arg） 在該螺旋的一側(cè)相間排成一行。一個(gè)有鄰近堿性殘基（Arg和Lys）的多肽會(huì)使螺 旋去穩(wěn)定。多肽含有G

6、ly和Pro,這兩種氨基酸是螺旋的強(qiáng)破壞者。Gly和Pro 的存在也會(huì)阻止8 -折疊的形成。所以多肽最難以形成8 -折疊。胰島素是由A、B兩條鏈組成的，兩條肽通過(guò)二硫鍵連接。在變性條件 下使二硫鍵還原，胰島索的活性完全喪失。當(dāng)巰基被重新氧化后，胰島素恢 復(fù)的活性不到天然活性的10%請(qǐng)予以解釋。答：胰島素是以前體的形式合成的。前體分于是一條單一的肽鏈。在前體 合成及折疊后，切除前體分子的一部分（包括連接肽C肽），留下由二硫鍵連接的 A和B兩條肽鏈。這樣，天然的胰島素由于缺少C肽，因而也就缺乏指導(dǎo)肽鏈 折疊的某些所必需的信息。所以當(dāng)胰島素變性和還原，隨之復(fù)性，二硫鍵的形成 是隨機(jī)的。在這種情況下是

7、不能完全恢復(fù)到天然活性的。這并不與氨基酸順序指 導(dǎo)蛋白質(zhì)折疊的基本原則相矛盾。對(duì)于密度均一的球狀蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，隨著蛋白質(zhì)分子增大，其表面積/ 體積（A/V）的比例是增大還是減?。侩S著蛋白質(zhì)分子增大，其親水側(cè)鏈氨基 酸殘基與疏水側(cè)鏈氨基酸殘基的比例是增大還是減小？答：對(duì)于密度均一的球狀蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，隨著分子量（即分子大小）增大，其 半徑（r）也增大。由于表面積= 4nr2，體積=4/3nr3，因此點(diǎn)面租4禪寸=_3_從這個(gè)表達(dá)式來(lái)看，隨著蛋白質(zhì)分子量的增大，它的表面積/體積的比例減小了。 即隨著蛋白質(zhì)分子的增大，體積的增大比表面積增大更快。由于極性基團(tuán)的親水性，大多數(shù)分布在球狀分子的表面，非極性側(cè)鏈

8、基團(tuán) 的疏水性，大多數(shù)聚集在球狀分子的內(nèi)部.由于隨著分子量增大而體積增大，內(nèi) 部空間也增大。因此內(nèi)部就可以容納更多的具疏水側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸殘基。所以 隨著球狀蛋白質(zhì)分子量的增大，親水側(cè)鏈氮基酸殘基與疏水側(cè)鏈氨基酸殘基的比 例將減小。胎兒血紅蛋白（HbF）在相當(dāng)于成年人血紅蛋白（Hb A） p鏈143殘基位置含有 Ser,而成年人p鏈的這個(gè)位置是具陽(yáng)離子的His殘基。殘基143面向P亞基之間的中央空 隙。為什么2,3二磷酸甘油酸（2,3-BPG）同脫氧Hb A的結(jié)合比同脫氧HbF更緊？ Hb F對(duì)2,3-BPG的低親和力如何影響到Hb F對(duì)氧的親和力？Hb F的P50是18托（torr）, Hb

9、 A的P50是26托?；谶@兩個(gè)數(shù)值如何解釋氧從母親血液有效轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒。答：由于2,3-BPG是同脫氧Hb A中心空隙帶正電荷的側(cè)鏈結(jié)合，而脫氧HbF缺少 帶正電荷的側(cè)鏈（6鏈143位的His殘基），因此2,3-BPG是同脫氧Hb A的結(jié)合比同脫氧 Hb F的結(jié)合更緊。2,3-BPG穩(wěn)定血紅蛋白的脫氧形式，增高脫氧血紅蛋白的份數(shù)。由于 Hb F同2,3-BPG親和力比Hb A低，Hb F受血液中2,3-BPG影響小，分子的氧合形式的份 數(shù)較大，因此Hb F在任何氧分壓下對(duì)氧的親和力都比Hb A大。在20-40氧分壓下，Hb F對(duì)氧的親和力比Hb A大，親和力的這種差別允許氧從母親血向胎兒有效轉(zhuǎn)

10、移。在生理?xiàng)l件下，多聚賴(lài)氨酸呈隨機(jī)卷曲的構(gòu)象。在什么條件下它可以形成a -螺旋？答：在生理?xiàng)l件下，賴(lài)氨酸殘基的帶增電荷的側(cè)鏈彼此排斥，不能形成a-螺旋。當(dāng)它 所處環(huán)境的pH上升超過(guò)它的側(cè)鏈可界離基團(tuán)的pK （10.5）時(shí)才能形成a-螺旋。某蛋白質(zhì)用凝膠過(guò)濾法測(cè)定的表觀分子量是90kD；用SDS測(cè)定時(shí)，它 的表觀分子量是60kD，無(wú)論2-巰基乙醇是否存在。哪種測(cè)定方法更準(zhǔn)確？為什 么？答：蛋白質(zhì)的分子形狀影響它在凝膠過(guò)濾時(shí)的行為。分子形狀較長(zhǎng)的蛋白質(zhì) 在凝膠過(guò)濾時(shí)具有類(lèi)似于分子較大的蛋白的行為。用SDS測(cè)定的蛋白質(zhì)分 子量應(yīng)該是比較準(zhǔn)確的，因?yàn)樽冃魏蟮牡鞍踪|(zhì)的遷移速度只取決于它的分子大 小。請(qǐng)根

11、據(jù)下面的信息確定蛋白質(zhì)的亞基組成：用凝膠過(guò)濾測(cè)定，分子量是200kD； 用SDS測(cè)定，分子量是100kD；在2-巰基乙醇存在下用SDS測(cè)定，分子 量是40kD和60kD。答：凝膠過(guò)濾分離的蛋白質(zhì)是處在未變性的狀態(tài)，如果被測(cè)定的蛋白質(zhì)的分子形狀是相 同的或者是相似的，所測(cè)定的分子量應(yīng)該是較準(zhǔn)確的。SDS測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量只是 根據(jù)它們的大小。但這種方法能破壞寡聚蛋白質(zhì)亞基間的非共價(jià)作用力，使亞基解離。在這 種情況下，所測(cè)定的是亞基的分子量。如果有2-疏基乙醇存在，則能破壞肽鏈內(nèi)或肽鏈間 的二硫鍵。在這種情況下進(jìn)行SDS，所測(cè)定的分子量是亞基的分子量（如果亞基間沒(méi) 有二硫鍵）或者是肽鏈的分子量（如

12、果亞基是由二硫鍵連接的幾個(gè)肽鏈組成）。根據(jù)題中給 出的信息，該蛋白質(zhì)的分子量是200kD，由兩個(gè)大小相同的亞基（100kD）組成，每個(gè)亞基 由兩條肽鏈（40kD和60kD）借二硫鍵連接而成。每分子人細(xì)胞色素c含有18分子的賴(lài)氨酸。100克細(xì)胞色素c完全水解得到18. 7克的賴(lài)氨酸。求細(xì)胞色c的分子量。答：根據(jù)組分的百分含量求蛋白質(zhì)的最低分子量可按下式計(jì)算:財(cái)蹦隔&心。=島* N J卵4細(xì)胞色素c的真實(shí)分子量二最小分子量X某氨基酸數(shù)=684X18 = 12300.這一 結(jié)果與用物理方法測(cè)定的結(jié)果很接近。3-14.有一種混 合液含有五種多肽 （P1、P2、P3、P4 和 P5）,在pH8.5的條

13、件下進(jìn)行電泳分離， 染色后揭示出如圖條帶相應(yīng)的多肽；現(xiàn)有一種pl為10.2的多肽（P6），它的分子量大約為600。 該肽若與上述五肽一起在pH8.5下電泳，請(qǐng)你指出它的位置。圖2毛幾種蛋白質(zhì)2-6a的遷移圖譜。已知這五種多肽的p/是：P1為9.0, P2為5.5, P3為10.2, P4為8.2, P5為7.2。并且已知它們的分子量都接近1200。請(qǐng)?jiān)趫D上鑒定出每的電泳遷移圖（a）和它們遷移的相對(duì)位置（b）答：根據(jù)它們的等電點(diǎn)以及它們?cè)趐H8.5條件下所帶凈電荷的多少，很容 易鑒定出它們?cè)陔娪緢D譜上的位置（圖2-6b）。?6與P3具有相同的p/，即是說(shuō)，在pH8. 5的條件下，它們帶有等量的

14、凈電荷。但P6的分子量?jī)H是P3的一半，它的遷移率是P3的2倍，電泳后它在支 持物上位置應(yīng)比P3更接近于負(fù)極（如圖2-6b所示）。（在一定粘度的介質(zhì)中，在恒壓下，帶電顆粒的遷移率由電荷與顆粒大小的 比例決定，即：M （遷移率）8（Q （電荷）/r （大?。?。為了在Q/r基礎(chǔ)上 估計(jì)出相對(duì)遷移率，可用物質(zhì)的分子量去除p/pH，p/-pH視為Q值的一種量 度。）15. 一種純凈的蛋白質(zhì)樣品用普通的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）在pH8.2 條件下進(jìn)行分析鑒定，得到如圖2-7（A）的結(jié)果。該蛋白質(zhì)樣品在用SDS處理后， 接著用SDS進(jìn)行分析，得到如圖2-7（B）的結(jié)果。通過(guò)對(duì)上述兩種電泳結(jié) 果的比較，

15、關(guān)于該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)你將得出什么樣的結(jié)論？該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是 低于pH8.2還是高于pH8.2?答：普通聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)時(shí)主要是根據(jù)各組分的p/的差別。 圖2-7（A）的結(jié)果只呈現(xiàn)單一的帶，表明該蛋白質(zhì)是純凈的。由于SDS是一種帶負(fù)電荷的陰離子去垢劑，并且具有長(zhǎng)長(zhǎng)的疏水性碳?xì)滏湣?它的這種性質(zhì)不僅使寡聚蛋白質(zhì)的亞基拆離，而且還能拆開(kāi)肽鏈的折疊結(jié)構(gòu)，并 且沿伸展的肽鏈吸附在上面。這樣，吸附在肽鏈上的帶負(fù)電荷的SDS分子使肽 鏈帶凈負(fù)電荷，并且吸附的SDS的量與肽鏈的大小成正比。結(jié)果是，不同大小 的肽鏈將含有相同或幾乎相同的Q/r值。由于聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)具有篩分效 應(yīng)，所以，分子較小的

16、肽鏈將比較大的、但具有相同的Q/r值的肽鏈遷移得更 快。若蛋白質(zhì)是由單一肽鏈或共價(jià)交聯(lián)的幾條肽鏈構(gòu)成，那么在用SDS處理后 進(jìn)行SDS，其結(jié)果仍是單一的一條帶。若蛋白質(zhì)是由幾條肽鏈非共價(jià)結(jié)合 在一起，在用SDS處理后進(jìn)行SDS，則可能出現(xiàn)兩種情況：一種仍是一 條帶，但其位置發(fā)生了變化（遷移得更快），表明該蛋白質(zhì)是由幾條相同的肽鏈構(gòu) 成，另一種可能出現(xiàn)幾條帶，則可以認(rèn)為該蛋白質(zhì)是由大小不同的幾條肽鏈構(gòu) 成圖2-7蛋白質(zhì)的鑒定圖2-7（B）的結(jié)果表明該蛋白質(zhì)是由兩種大小不同的肽鏈借非共價(jià)鍵結(jié)合在一起的寡聚體蛋白質(zhì)。從圖2-7的電泳結(jié)果我們可以斷定該蛋 白質(zhì)的等電點(diǎn)低于pH8.2。16 .一個(gè)蛋白質(zhì)

17、混合物含有下面幾種不同的組分：a Mr= 12，000pI=10；b Mr=62，000pI=4c Mr= 28，000pI=7；d Mr=9，000pI= 5不考慮其他因素，分別指出在下述情況下被洗脫的順序。該混合物用DEAE務(wù)維素柱層折時(shí)，以逐漸增高洗脫液的鹽濃度方式進(jìn) 行洗脫。該混合物用SephadexG-50凝膠柱層析分析。答：DEAE-纖維素是一種常用于蛋白質(zhì)分離的陰離子交換劑。在分離蛋白 質(zhì)樣品之前，DEAE-纖維素先用較低的離子強(qiáng)度和pH為8的緩沖液平衡， 蛋白質(zhì)樣品也溶于同樣的緩沖液中。在這樣的條件下，DEAE-纖維素大部分 解離，并且?guī)Ч潭ǖ恼姾?。在這種pH下，蛋白質(zhì)樣品中

18、各組分帶凈正電 荷（但有差異，或帶相反性質(zhì)的電荷），這些帶不同電荷的組分與DEAE- 纖維素的結(jié)合力不同。洗脫液的離子強(qiáng)度影響帶電顆粒與交換劑間的結(jié)合 力。當(dāng)升高洗脫液的離子強(qiáng)度時(shí)，會(huì)降低交換劑與被分離組分的靜電吸引力。 由上所述，該蛋白質(zhì)混合物各組分被洗脫下來(lái)的先后順序是:acdb。Sephadex是葡聚糖凝膠，它是具有不同交聯(lián)度的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其顆粒內(nèi)部的 孔徑大小可以通過(guò)控制交聯(lián)劑與葡聚糖的比例來(lái)達(dá)到.因此它具有篩分效 應(yīng).用它作為填充料制成層析柱，可以根據(jù)被分離物質(zhì)的大小進(jìn)行分離。已 有不同型號(hào)的葡聚糖凝膠用于不同物質(zhì)的分離。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合樣品隨洗脫液 向下流動(dòng)時(shí)，比凝膠顆?？讖酱蟮牡鞍踪|(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)格內(nèi)，被排阻 在凝膠顆粒的外部；比凝膠顆?？讖叫〉牡鞍踪|(zhì)分子則能進(jìn)入到網(wǎng)格內(nèi)部。其結(jié)果是，分子