手性化合物的微生物轉化終課件

1、手性化合物的微生物轉化報告人：張 楠 王佳寧 楊廣磊01一、手性分子及手性化合物的合成 手性（chirality）是三維物體的基本特性。如果一個物體不能與其鏡像重合，該物體就稱為手性物體，這兩種互成鏡像的形態(tài)被稱為對映體。 手性分子(chiral molecules)的立體構型即為對映體結構。手性是自然界的本質屬性之一，分子手性識別在研究生命活動和生命物質產生中都起著極為重要的作用。一、手性分子及手性化合物的合成1.概念10 八月 20224 1815年布勞特發(fā)現(xiàn)樟腦、月桂油等具有旋光性，建立liot-savart定律。第一個研究旋光性的人1848年巴斯德通過緩慢蒸發(fā)結晶外消旋酒石酸鉀氨溶液得

2、到兩種對映體。后來，通過化學法和微生物拆分了對映異構體。Fischer發(fā)明了氫氰酸和糖的反應，得到了不同比例的氫羥化物異構體。2001年諾爾斯、夏普雷斯和野依良治獲得諾貝爾化學獎他們發(fā)現(xiàn)了某些手性分子可用作某些化學反應的催化劑，為合成對人類有用的重要化學物開辟了一個全新的研究領域2.研究歷史非生物法 不對稱合成法制備手性化合物 手性源合成 選擇吸附拆分法 結晶法拆分 化學拆分法 動力學拆分 色譜分離生物法 利用水解酶類 微生物或酶直接轉合成方法3.不對稱合成反應過程不對稱合成前手性原料目的產物不對稱生物催化化學催化不對稱合成手性中間體3.不對稱合成反應過程生物反應器產物底物產物手性化合物水 o

3、r有機溶劑底物潛手性化合物EEEEEEEEEEE生物催化劑生物催化法:是利用生物細胞的提取物也就是各種生物酶或者是直接利用活性生物細胞催化反應的方法，它的產生是由于生命科學的巨大進步和生物技術的迅速發(fā)展。生物催化的活性物質是酶，酶幾乎都是具有單一催化活性的蛋白質，少數(shù)屬于核酸類物質，能夠催化多種反應4.目的意義手性化合物非手性化合物 充分利用生物催化技術的優(yōu)點、特點 更多更普遍地應用生物催化不對稱合成技術制備手性化合物 建立生物催化不對稱合成手性化合物或其中間體的技術平臺 對手性化合物或其中間體的平臺技術進行深入的應用基礎研究 揭示生物催化不對稱合成反應的規(guī)律 合成一系列新的手性化合物或重要中

4、間體。 5.生物催化不對稱合成研究的問題 應用不夠 缺少技術平臺 缺少高立體選擇性的生物催化劑 反應類型有限，底物結構有限 反應的對映選擇性不盡理想 對生物催化反應過程缺乏了解6.生產單一對映體 手性化合物的方法生物催化與手性技術生物催化生物轉化手性技術 手性源 消旋體拆分 不對稱合成技術路線7. 難點底物/產物抑制的解除輔酶依賴與 輔酶再生立體專一性生物催化劑發(fā)現(xiàn)與改造難點酶的來源02手性化合物的微生物轉化一 微生物種類 所用的微生物種類包括酵母菌，細菌、霉菌等，也有用植物細胞催化前手性化合物獲得手性化合物的。面包酵母廉價易得，年世界總產量達 60 萬噸。同時，它的培養(yǎng)和分離也比較簡單，反應

5、時無需滅菌，只要將底物與細胞混合，在室溫即可反應，對反應選擇性也比較專一。面包酵母獲得容易，無污染，含有的酶系多，底物廣泛等。因而得到廣泛的應用。細菌菌落霉菌菌落面包酵母菌落二 微生物不對稱合成的優(yōu)勢微生物中含有多種多樣的酶異構反應，取代反應，消除反應，加成反應異構酶，裂解酶水解反應水解酶氨基酸合成（CN鍵）轉氨酶糖苷鍵形成糖苷酶縮醛反應（CC鍵）醛縮酶磷酸化作用（與ATP的生成相關） 激酶氧化反應、環(huán)氧化反應過氧化酶氧化反應氧化酶（單、雙加氧酶）醇、酮氧化還原反應脫氫酶氨水解、合成反應酰胺酶酯水解、合成反應脂化酶，酯化酶ReactionsEnzymes不需要進行酶的提純、添加輔酶等 通過微生

6、物整細胞內的酶系 進行轉化，不需要對酶進行提純， 也不需額外添加昂貴的輔酶， 因而減少工序并降低成本。羰基還原酶用糖作為能量供體保持輔酶再生循環(huán)氧化還原酶輔酶再生的解決辦法 水-溶劑雙相體系 解除底物抑制非水相生物催化利于產物的分離和提取底物抑制與溶解度問題有機相產物回收溶劑羰基還原酶催化不對稱還原反應水-溶劑雙相體系 解除底物抑制立體選擇性鏡平面對映體 A對映體 BOHH3CHCO2HC*CH3HHOCO2HC*微生物轉化反應屬于酶的催化反應,保持了酶催化反應所具有的高度立體選擇性它不僅對結構有化學選擇性和非對映異構體選擇性,并且有嚴格的區(qū)域選擇性和對映異構體選擇性。對手性藥物合成來說,具有

7、嚴格的立體結構選擇性非常重要。三 提高微生物立體選擇性的方法催化劑最重要的性質不是它的活性，而是其選擇性，然后是穩(wěn)定性生物催化劑的最大優(yōu)勢在于它們無以比擬的選擇性，尤其是其對映異構體選擇性 篩選高立體選擇性的生物催化劑 對產酶微生物細胞進行預處理 控制微生物細胞的生理狀態(tài) 固定化微生物細胞 篩選適宜的底物 添加共底物或抑制劑 選擇合適的反應體系 不同種類的生物催化劑（酶或其細胞）作用于同一種底物可產生不同對映體的產物可用于還原羰基化合物的微生物種類很多，包括各種細菌，放線菌，酵母，霉菌應該根據(jù)不同產物要求篩選不同的產酶菌株 篩選高立體選擇性的生物催化劑 篩選得到的產酶菌株往往對映異構選擇性不能

8、滿足要求有時可以用加熱、調pH、添加表面活性劑等方法進行預處理改善其對映異構選擇性 對產酶微生物細胞進行預處理 微生物的生理狀態(tài)不同在催化不對稱還原時的產物手性醇構型有可能不一樣調節(jié)細胞的生理狀態(tài)有可能獲得理想構型的產物 Allan C. Dahl 等人曾報道：厭氧發(fā)酵狀態(tài)的酵母在高底物濃度時可將3-氧-酯還原為D-型3-羥-酯，有氧狀態(tài)下生長的酵母在低底物濃度時可將3-氧-酯還原為L-型3-羥-酯 控制微生物細胞的生理狀態(tài) 固定化微生物細胞 固定化微生物也會影響不對稱還原反應的立體選擇性 如:Kaoru Nakamura等人報道游離面包酵母還原-酮酯生成D-羥酯，而固定在藻酸鎂中的面包酵母還

9、原-酮酯則生成L-羥酯潘冰峰等人采用二甲基硅橡膠包埋白地霉菌體與游離菌體轉化-羰基苯丙酸乙酯生成(R)-羥基苯丙酸乙酯對比時，固定化后產物的對映體過剩值從49%提高到81%ee。底物分子結構中前手性碳原子周圍的基團不同，對產物的手性構型有很大影響產物手性的構型主要取決于羰基酯基團中烷基鏈的長短，當烷基鏈很短(5個C)時產生R-型醇 篩選適宜的底物 在反應體系中添加不同的共底物，有時會對產物的構型引起變化 如Allan C.等人報道用面包酵母還原羰基酯時，以蔗糖為共底物產物為R-型醇，以葡萄糖為共底物產物為S-型醇可選用的共底物還有甘油，甲醇，乙醇，2-丙醇，,正丁醇，葡萄糖酸內酯等在反應體系中

10、加入某些抑制劑可抑制某一種構型酶(R-型或S-型酶)的活力，使產物的另一種對映體大量生成不對稱還原所使用的抑制劑有烯丙基醇，烯丙基溴，,不飽和羰基化合物，金屬鹽(氯化鎂)，氯乙酰乙酯，五羥黃酮等 添加共底物或抑制劑 選擇合適的反應體系 相同酶在不同有機溶劑體系反應所得產物的構型相反 生物催化的不對稱性（Stereochemistry）有機溶劑對立體選擇性的影響 早有報道不同的有機溶劑體系中會產生不同構型的手性產物選取合適有機溶劑有可能改變產物構型，或提高產物光學純度03手性化合物微生物轉化的應用微生物催化不對稱還原反應的工業(yè)應用“手性中間體 ”手性砌塊手性藥物成功實例很少微生物轉化法 通過微生

11、物細胞內的酶系進行轉化,不需要對酶進行提純,也不需額外添加昂貴的輔酶,因而減少了工序并降低了成本,但發(fā)酵終產物較為復雜,副產物相對增加。 優(yōu)點(1) 有利于提高酶的穩(wěn)定性, 延長催化劑的使用壽命(2)可以降低生產成本。(3) 簡化工藝; (4)對于較復雜的反應, 微生物可利用其體內精巧的酶系進行催化, 避免副產物的形成; (5) 由于微生物細胞內含有輔助因子, 其優(yōu)點更為明顯。微生物催化不對稱還原反應的轉化方法微生物催化不對稱還原反應的工業(yè)應用生物催化不對稱還原制備 (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯江南大學研究了水/有機溶劑兩相體系中整細胞催化不對稱還原，在沒有添加輔酶和葡萄糖脫氫酶的條件下，

12、產物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯在單一水相系中的濃度20.3g/l。在兩相體系中，有機相產物濃度達到了56.8g/l，摩爾轉化率為94.8%，產物光學純度均大于97%e.e. 手性鹵代羥基酯HMG-CoA還原酶抑制劑（56.8g/L，94.5%）4-羥基吡咯啉L-肉堿1,4-二氫吡啶類-阻滯劑 可用于合成：鏈接：美國環(huán)保局（EPA）鑒定一項綠色化學研發(fā)課題，降低膽固醇藥物Lipitor用關鍵手性砌塊(R)-4-氰基-3-羥基腈 (HN)的酶法制備工藝，該項目由美國Codexis公司、Merck 公司和哥倫比亞州Missouri大學共同開發(fā)。微生物催化不對稱還原反應 在手性合成中的研究實例羰

13、基還原酶催化不對稱還原反應制備(R)-硫辛酸微生物轉化合成苯乙醇微生物轉化合成(R)-4,4,4-三氟-3-羥基丁酸乙酯微生物轉化法制備(RM-)-扁桃酸甲酯1微生物轉化合成苯乙醇苯乙酮還原反應原理面包酵母細胞中存在氧化還原酶和脫氫酶，在輔酶 NAD(P)H 的參與下，面包酵母通過這兩種酶可以實現(xiàn)對各種前手性酮分子中羰基的還原，形成相應的手性醇分子得到的手性苯乙醇以 S-型構型為主，且反應的轉化率最高大約為 35%；產物 e.e.值比較高，基本保持在 95%以上，反應立體選擇性高面包酵母還原苯乙酮反應曲線2微生物轉化合成(R)-4,4,4-三氟-3-羥基丁酸乙酯Saccharomyces uv

14、arum摩爾轉化率達到89.7%，總的產物達到26.9g/L ,對映體純度 85.6%e.e ,重結晶產物的e.e.值可達到97.3% 添加樹脂耦合轉化工藝時間曲線 (R)-4,4,4-三氟-3-羥基丁酸乙酯是 單胺氧化酶-A抑制劑貝氟沙通（Befloxatone）的手性中間體3羰基還原酶催化不對稱還原反應制備(R)-硫辛酸6-羰基-8-氯辛酸乙酯 R(+)6-羥基-8-氯辛酸 R(+)6,8-二氯辛酸 R(+) -硫辛酸 -硫辛酸被稱為“萬能抗氧化劑”。在醫(yī)藥、保健食品與食品添加劑、化妝品及其它方面有廣泛應用。 R-硫辛酸是人體內硫辛酸的天然形式 S-硫辛酸在人體內不具有活性 目前混旋硫辛酸

15、的市場報價在250 元/公斤，而R-硫辛酸達到2000-3000 元/公斤 在R 型硫辛酸關鍵手性中間體的反應之中主要可以采用三種方法進行, 即全細胞轉化法、純化酶轉化法及基因工程菌轉化法。4微生物轉化法制備(RM-)-扁桃酸甲酯微生物法不對稱還原制備(R)-(-)-扁桃酸甲酯水/有機溶劑兩相體系:利用該體系進行生物轉化反應能有效地解決底物在水相中溶解度低,底物濃度高對細胞毒性和酶的抑制等問題水/機溶劑兩相體系中 B5微生物細胞催化苯甲酰甲酸甲酯生成(R)-(-)-扁桃酸甲酯不對稱還原反應的最大摩爾轉化率和產物(R)-(-)-扁桃酸甲酯的光學純度分別達到了 60.8%和100%討論和建議有專家認為國外在手性化合物（藥物）的開發(fā)與研究方面已取得了可喜成績，但我國目前還沒有一個真正屬于自己創(chuàng)新的手性藥物進入臨床和生產階段。建議 首先要提高手性制備技術，研究實用的手性合成方法，特別是發(fā)展生物催化制備技術。 建議將研究及開發(fā)手性催化劑、手性骨架、手性中間體等作為重點。 另外，研究及開發(fā)理想的光學結晶劑、不對稱化學觸媒、手性輔料性溶劑、手性醇、手性酸、手性堿等，有重要前景。 能以較低的生產成本，大量生產商品化手性化合物。前景與展