種子擴(kuò)大培養(yǎng)

1、關(guān)于種子的擴(kuò)大培養(yǎng)第一張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定發(fā)酵產(chǎn)量高、數(shù)量充足、無(wú)污染的生產(chǎn)菌種的過(guò)程。第一節(jié) 種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求種子擴(kuò)大培養(yǎng)第二張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月種子擴(kuò)培的目的 接種量的需要 菌種的馴化 縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平第三張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月作為種子的準(zhǔn)則 細(xì)胞生長(zhǎng)活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長(zhǎng)，遲緩期短； 生理性狀穩(wěn)定； 菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；無(wú)雜菌污染； 保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。 第四張，

2、PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4.1 種子的制備工藝第五張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第六張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)室階段：所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)設(shè)備，在工廠中培養(yǎng)過(guò)程一般都在菌種室完成。生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進(jìn)行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理。第七張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第八張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、實(shí)驗(yàn)室種子的制備一般采用兩種方式：對(duì)于產(chǎn)孢子能力強(qiáng)及孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子。對(duì)于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法，獲得

3、菌絲體，作為種子。 第九張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月、斜面 (AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化鈉 0.5 瓊脂 2%， pH 7.0-7.2培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，原料比較精細(xì)培養(yǎng)條件：32，生長(zhǎng)18-24小時(shí) 對(duì)于不產(chǎn)孢子和孢子發(fā)芽慢的微生物獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，如谷氨酸的種子培養(yǎng)。第十張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月. 一級(jí)種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32培養(yǎng)12小時(shí)。培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿 2.5%， K2HPO4 0.1%培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，所使用的原料已經(jīng)基本

4、接近于發(fā)酵培養(yǎng)基 對(duì)于不產(chǎn)孢子和孢子發(fā)芽慢的微生物第十一張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月.二級(jí)種子(種子罐)培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%(10%)），32培養(yǎng)7-10個(gè)小時(shí)培養(yǎng)基：和一級(jí)種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%培養(yǎng)基的特點(diǎn)：長(zhǎng)菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基第十二張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月種子的質(zhì)量要求：108-109個(gè)/ml大小均勻，呈單個(gè)或八字排列PH 7.0-7.2時(shí)結(jié)束，6.887.0-7.2活力旺盛第十三張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子 與菌絲體培養(yǎng)相比步驟少，因而更容易獲得量和質(zhì)穩(wěn)定的種子

5、，但操作繁瑣。 對(duì)于產(chǎn)孢子的微生物 獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體便于操作，但需要更仔細(xì)的控制。第十四張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、培養(yǎng)基選擇的原則 有利于菌體的生長(zhǎng)，對(duì)孢子培養(yǎng)基應(yīng)該是有利于孢子的生長(zhǎng)。 在原料方面，實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細(xì)。第十五張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、生產(chǎn)車間種子制備 種子罐的培養(yǎng)基成分原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時(shí)還需供給足夠的無(wú)菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。 第十六張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)

6、作于2022年6月1、培養(yǎng)物的選擇原則在生產(chǎn)車間階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體。 縮短發(fā)酵時(shí)間 有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果菌絲體比孢子要有利：第十七張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、培養(yǎng)基選擇的原則目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，培養(yǎng)基首先考慮有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。在原料方面：不如實(shí)驗(yàn)室階段那么精細(xì)，基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基: 一是成本 二是馴化第十八張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月例：檸檬酸發(fā)酵 以蔗糖為原料成分 斜面 種子罐 發(fā)酵麥芽汁 麥汁 蔗糖 2.5-5% 20%NH4NO3 0.225% 0.11%K2HPO4 0.03% Mg

7、SO4.H2O 0.025% 0.025% KCl 0.015%瓊脂 2%第十九張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、種子罐的作用：使孢子發(fā)芽，生長(zhǎng)繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長(zhǎng)，達(dá)到一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。第二十張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月種子罐級(jí)數(shù)：指制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，取決于： 菌種生長(zhǎng)特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；所采用發(fā)酵罐的容積 4、種子罐級(jí)數(shù)的確定 第二十一張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月谷氨酸：三級(jí)發(fā)酵一級(jí)種子（搖瓶）二級(jí)種子 （小罐）發(fā)酵青霉素：三級(jí)發(fā)酵一級(jí)種子 （小罐）二級(jí)種子（中罐）發(fā)酵 一般由菌絲體培養(yǎng)開(kāi)始計(jì)算發(fā)

8、酵級(jí)數(shù)，但有時(shí)工廠從第一級(jí)種子罐開(kāi)始計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)第二十二張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月發(fā)酵級(jí)數(shù)確定的依據(jù) 級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)特性、接種量的影響 級(jí)數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級(jí)。 在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級(jí)數(shù)的確定是非常重要的一個(gè)方面第二十三張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)菌：生長(zhǎng)快，種子用量比例少，級(jí)數(shù)也較少，二級(jí)發(fā)酵。 茄子瓶種子罐發(fā)酵罐 霉菌：生長(zhǎng)較慢，如青霉菌，三級(jí)發(fā)酵 孢子懸浮液一級(jí)種子罐（27C,40小時(shí)孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲 ）二級(jí)種子罐（ 27C,1024小時(shí)，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）發(fā)酵罐 放線菌：生長(zhǎng)更慢，采用四級(jí)發(fā)酵酵母：

9、比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級(jí)種子 第二十四張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月種子級(jí)數(shù)越少越好，可簡(jiǎn)化工藝和控制，減少染菌機(jī)會(huì)種子級(jí)數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機(jī)會(huì)雖然種子罐級(jí)數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級(jí)數(shù)。 確定種子罐級(jí)數(shù)需注意的問(wèn)題第二十五張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5、接種量的確定 移入種子的體積接種量 接種后培養(yǎng)液的體積接種量過(guò)多，菌絲生長(zhǎng)過(guò)快、溶氧不足，衰老細(xì)胞增加等，發(fā)酵后勁不足種量過(guò)少延長(zhǎng)發(fā)酵周期，形成異常形態(tài)，而且

10、易造成染菌。 以生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中的繁殖速度為依據(jù)接種量的大小直接影響發(fā)酵周期。第二十六張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月雙種：兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來(lái)源于種子罐，一部分來(lái)源于發(fā)酵罐。 過(guò)大過(guò)小都不好，最終以實(shí)踐定，如大多數(shù)抗生素為7-15%。但是一般認(rèn)為大一點(diǎn)好。第二十七張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月采用被孢霉進(jìn)行亞麻酸發(fā)酵時(shí)接種量可以明顯影響菌絲體接種量對(duì)菌體形態(tài)和產(chǎn)亞麻酸的影響 楊博， 中國(guó)油脂，2002第二十八張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月研究發(fā)現(xiàn)，采用被孢霉進(jìn)行亞麻酸發(fā)酵時(shí)接種量可以明顯影響菌絲體的形態(tài)，從而影響菌體干重和亞麻酸

11、產(chǎn)量。第二十九張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 不同接種量影響菌體的生長(zhǎng)和發(fā)酵第三十張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月發(fā)酵前期發(fā)酵液作為種子，發(fā)酵指數(shù)明顯提高發(fā)酵后期菌體自溶明顯，影響提煉收率第三十一張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月20%種子罐10%發(fā)酵罐前期發(fā)酵液效果最好第三十二張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月6、種齡指種子罐中培養(yǎng)的菌體開(kāi)始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。種齡短：菌體太少；種齡長(zhǎng)：易老化。原則：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對(duì)較大，但是最終由實(shí)驗(yàn)結(jié)果定。第三十三張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月大量地接入培養(yǎng)成熟的菌

12、種的優(yōu)點(diǎn)：縮短生長(zhǎng)過(guò)程的延緩期，因而縮短了發(fā)酵周期，提高了設(shè)備利用率節(jié)約發(fā)酵培養(yǎng)的動(dòng)力消耗有利于減少染菌機(jī)會(huì)第三十四張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月舒琴， 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2004鏡檢：24小時(shí)多個(gè)桿菌首位相連成線形，處于繁殖旺盛期 30小時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)芽孢第三十五張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4.2 影響種子質(zhì)量的因素原材料質(zhì)量培養(yǎng)溫度濕度通氣與攪拌斜面冷藏時(shí)間培養(yǎng)基pH第三十六張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月原材料質(zhì)量原材料質(zhì)量波動(dòng)引起種子質(zhì)量不穩(wěn)定原材料質(zhì)量波動(dòng)的主要原因：無(wú)機(jī)離子含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少

13、也會(huì)影響孢子的質(zhì)量）。 第三十七張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 培養(yǎng)溫度 溫度過(guò)低，菌種生長(zhǎng)發(fā)育緩慢溫度過(guò)高會(huì)使菌絲過(guò)早自溶在制備土霉素生產(chǎn)種子過(guò)程中，高于37培養(yǎng)時(shí)，孢子接入發(fā)酵罐后表現(xiàn)出糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過(guò)早自溶，效價(jià)降低等現(xiàn)象。第三十八張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月濕度濕度低，孢子生長(zhǎng)快；濕度大，孢子生長(zhǎng)慢 制備土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌孢子時(shí)發(fā)現(xiàn)，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長(zhǎng)得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干癟狀，孢子稀少第三十九張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 通氣與攪拌 足夠的通氣量，以保證菌種代謝正常，提高種子的質(zhì)量

14、攪拌可提高通氣效果，促進(jìn)生長(zhǎng)繁殖，過(guò)度攪拌導(dǎo)致培養(yǎng)液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化變性，泡沫過(guò)多增加染菌機(jī)會(huì)，增加能耗。絲狀微生物不宜劇烈攪拌。第四十張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月斜面冷藏時(shí)間 對(duì)孢子的生產(chǎn)能力有較大影響 冷藏時(shí)間越長(zhǎng)，生產(chǎn)能力下降越多 鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6冷藏兩個(gè)月后的發(fā)酵單位比冷藏一個(gè)月的降低18，比冷藏3個(gè)月的降低35。 第四十一張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月培養(yǎng)基培養(yǎng)種子的目的：擴(kuò)大培養(yǎng)，增加細(xì)胞數(shù)量；同時(shí)也必須培養(yǎng)出強(qiáng)壯、健康、活性高的細(xì)胞。為了使細(xì)胞迅速進(jìn)行分裂或菌絲快速生長(zhǎng)。第四十二張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月有較完全和豐

15、富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，糖分少，需充足氮源和生長(zhǎng)因子，無(wú)機(jī)氮源比例大；各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度不必太高；供孢子用的種子培養(yǎng)基，可添加易被吸收利用的碳源和氮源；應(yīng)考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分相近。種子培養(yǎng)基特點(diǎn)第四十三張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 pH 選擇最適種子培養(yǎng)pH的原則是獲得最大比生長(zhǎng)速率和適當(dāng)?shù)木颗囵B(yǎng)最后一級(jí)種子的培養(yǎng)基的pH應(yīng)接近于發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，以便種子能盡快適應(yīng)新的環(huán)境 第四十四張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月種子質(zhì)量的控制措施 菌種穩(wěn)定性的檢查 測(cè)定其生產(chǎn)能力，從中挑選高產(chǎn)菌株，并及時(shí)對(duì)退化菌種進(jìn)行復(fù)壯 提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境種子無(wú)雜菌檢查，保證純種發(fā)酵。 種子液生化分析項(xiàng)目主要有：營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的消耗速度、pH變化、溶氧變化、色澤和氣味等第四十五張，PPT共四十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1、細(xì)胞或菌體菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀（色素、顆粒等）單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)；霉菌、放線菌：