醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)：假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）基因診斷

1、假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）基因診斷 掌握PCR技術(shù)用于基因診斷的原理及方法 了解并熟悉單基因遺傳病基因診斷策略一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康腄MD疾病簡(jiǎn)介Duchenne muscular dystrophy (DMD)進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良兒童最常見的致死性肌肉疾病遺傳方式： X連鎖隱性遺傳病發(fā)病率：1/3500活產(chǎn)嬰兒致病基因：DMD基因5-6歲發(fā)病，雙下肢無(wú)力，腓腸肌假性肥大，逐漸下肢癱瘓，20歲前死于呼吸及心力衰竭DMD基因DMD基因有79個(gè)外顯子，編碼抗肌萎縮蛋白dystrophin常見的突變形式：第58, 59, 60，61,62號(hào)外顯子缺失 病例： 趙某，女，生育有一個(gè)6歲DMD患兒，請(qǐng)針對(duì)常見突變位

2、點(diǎn)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，采用PCR技術(shù)對(duì)患兒進(jìn)行基因診斷，明確基因缺失范圍，并分析II-2及II-3是否攜帶致病基因。常見突變位點(diǎn)：第58, 59, 60，61,62號(hào)外顯子缺失第一部分：PCR檢測(cè)DMD基因缺失 DMD基因診斷 第二部分：STR連鎖分析突變攜帶者第一部分：PCR-凝膠電泳檢測(cè)DMD基因缺失實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案：DMD基因第58, 59, 60，61,62號(hào)外顯子引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果：外顯子正常可以檢測(cè)到擴(kuò)增條帶缺失缺失不能檢測(cè)到擴(kuò)增條帶實(shí)驗(yàn)原理 （1）聚合酶鏈反應(yīng) Polymerase Chain Reaction（PCR） 在模板DNA、引物

3、和4種脫氧核苷酸存在條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。變性: 9095Denatures the double stranded DNA into single strands957255聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）退火: 5068Allows the primers to attach to complementary strand of DNA957255聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）變性: 9095延伸: 7072Optimal temperature for Taq polymerase to attach to and extend the new strand of DNA957255聚合

4、酶鏈反應(yīng)（PCR）變性: 9095退火: 5068PCR：變性退火延伸 （2）瓊脂糖凝膠電泳 DNA帶有電荷，可在電場(chǎng)下運(yùn)動(dòng)，熒光染料與DNA結(jié)合，通過Marker及熒光信號(hào)，可粗略判斷PCR產(chǎn)物片段大小實(shí)驗(yàn)材料 （1）PCR反應(yīng)：患者DNA 2ul（30ng/ul）、PCR 反應(yīng)Mix（15ul）、擴(kuò)增引物（5對(duì) E58,E59,E60,E61,E62） （2）產(chǎn)物檢測(cè)：2%瓊脂糖凝膠、1XTAE、DNA Marker、熒光染料（3）實(shí)驗(yàn)儀器： 微量加樣器、PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳 裝置。擴(kuò)增引物E58-Forward primer：AGAGCTATCCAGACCCTGGCE58-Rever

5、se primer ：AATGCCACAAGCCAAATAAGCA 片段大?。?61bpE59-Forward primer：CGTGGCCTCTTGAAGTTCCCE59-Reverse primer：GCCTAAAACCTTGTCATATTGCC 片段大?。?91bpE60-Forward primer: ATACGGTGAGAGCTGAATGCCE60-Reverse primer: TGGCACTGCACCCTAAAGA 片段大小：193bpE-61-Forward primer：TTGGCCTTCCTCTTCCTAACCTE-61-Reverse primer：TGGTCCAGCAT

6、CTCAGCACT 片段大小：214bpE-62-Forward primer: GTCGTTCCCCATTGCATCAGE-62-Reverse primer: CGCCAAACAAAGTGCCCTAC 片段大?。?21bpPCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物 PCR產(chǎn)物電泳 結(jié)果觀察及分析 實(shí)驗(yàn)流程及時(shí)間40分鐘20分鐘25分鐘實(shí)驗(yàn)步驟1、 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系DND模板1ul (100ng)2X PCR-Mix(包含Taq酶，dNTP)10ul 引物（58/59/60/61/62）1ulddH2O8 ul合計(jì)20ul學(xué)員分為10個(gè)小組，1-2組用58號(hào)引物，3-4組用59號(hào)引物，依次類推; 2 反應(yīng)條件

7、：預(yù)變性95 2min 變性95 15s 褪火60 15s 延伸72 15s 補(bǔ)充延伸72 2min 36 Cycle 3 瓊脂糖凝膠(2 %電泳) 檢測(cè)PCR產(chǎn)物片段： PCR的產(chǎn)物8l與21的熒光染料，混勻后加樣，120V電壓電泳20分鐘。1 避免污染、記好各自擴(kuò)增的外顯子號(hào)2 PCR結(jié)果 PCR的優(yōu)化提高特異性3 電泳凝膠濃度的選擇注意事項(xiàng) 觀察PCR的電泳結(jié)果并記錄，根據(jù)電泳結(jié)果分析第58-62號(hào)外顯子是野生型還是缺失型，最終確定缺失范圍。 野生型：檢測(cè)到200bp左右大小條帶 缺失型：無(wú)條帶 結(jié)果觀察及分析第二部分：連鎖分析判斷攜帶者思考：PCR-凝膠電泳檢測(cè)能判斷攜帶者嗎？實(shí)驗(yàn)原理

8、連鎖分析 （1）突變的DMD基因與同一染色體附近遺傳標(biāo)記相連鎖；同理，野生型的DMD基因與同一染色體附近遺傳標(biāo)記相連鎖。 （2）分析遺傳標(biāo)記的傳遞規(guī)律X染色體（野生型DMD）X染色體（突變型DMD ）X染色體（野生型DMD）X染色體（突變型DMDDMD基因區(qū)域配子野生型DMD基因突變型DMD基因連鎖：同一條染色體上距離較近的區(qū)域組成一個(gè)整體往后代傳遞AB2C3A3B4C8DMD基因內(nèi)含子區(qū)域STR重復(fù)序列實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 對(duì)DMD基因區(qū)域的STR遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因分型，采用毛細(xì)管電泳分析出每個(gè)STR標(biāo)記的重復(fù)次數(shù)。根據(jù)基因型分析突變DMD基因的傳遞情況。STR1STR2STR3 STR4 STR5STR分型原理PCR擴(kuò)增STR位點(diǎn)，單向引物標(biāo)記有熒光，采用毛細(xì)管電泳的方法，對(duì)照marker, 就可以推算出PCR產(chǎn)物的具體長(zhǎng)度，進(jìn)而推算出重復(fù)次數(shù)實(shí)驗(yàn)步驟1、對(duì)DMD基因STR遺傳標(biāo)記基因分型 （PCR-毛細(xì)管電泳得到重復(fù)次數(shù)，實(shí)驗(yàn)