DNA損傷與修復(fù)要求及毒理學(xué)DNADamageandRepair

1、DNA損傷與修復(fù)要求及毒理學(xué)DNA Damage and Repair 第一節(jié) DNA的突變和損傷1.1 突變的概念1.2 突變的類型1.3 突變的原因1.4 突變的后果1.1 DNA突變的概念突變：發(fā)生在DNA分子上可遺傳的永久性結(jié)構(gòu)變化通常稱為突變。突變體：帶有一個(gè)特定突變的基因、基因組、細(xì)胞或個(gè)體。 生命和生物多樣性依賴于突變與突變修復(fù)之間的良好平衡。1.2 突變的類型1、點(diǎn)突變：DNA分子中一個(gè)堿基對替換另一個(gè)堿基對，也稱堿基對的置換（substitution）。 轉(zhuǎn)換(Transition)： 最普通的一種點(diǎn)突變，嘧啶 嘧啶，嘌呤 嘌呤。 A G T C 顛換(Transversio

2、n)： 另一種不常見的點(diǎn)突變，嘌呤 嘧啶。ATTACG堿基替換導(dǎo)致mRNA中密碼子的改變，多肽鏈中氨基酸發(fā)生影響，可能出現(xiàn)幾種不同的效應(yīng)：同義突變（synonymous mutation）:由于密碼子具有兼并性，單個(gè)堿基置換后密碼子所編碼的是同一種氨基酸，表型不改變。 正常 同義突變AGT CAG CAG CAG TTT TTA CGT AAC CCG DNA Met Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro AGT CAG CAG CAG TTT TTG CGT AAC CCG DNA Met Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro 錯(cuò)義突變（M

3、issense mutation）:DNA分子中的堿基置換后，形成新的密碼子，從而導(dǎo)致所編碼的氨基酸發(fā)生改變，產(chǎn)生活性降低、無活性或無功能的蛋白質(zhì)。 正常 錯(cuò)義突變AGT CAG CAG CAG TTT TTA CGT AAC CCG DNA Met Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro AGT CAG CAG CAG TTT TCA CGT AAC CCG DNA Met Gln Gln Gln Phe Ser Arg Asn Pro 無義突變（Nonsense mutation）:DNA分子中的堿基置換后，使編碼一個(gè)氨基酸的密碼子變?yōu)椴痪幋a任何氨基酸的終止密碼子（

4、UAA、UAG、UGA），肽鏈合成提前終止，產(chǎn)生短的、沒有活性的多肽片段。 正常 無義突變AGT CAG CAG CAG TTT TTA CGT AAC CCG DNA Met Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro AGT CAG CAG CAG TTT TGA CGT AAC CCG DNA Met Gln Gln Gln Phe 終止 Arg Asn Pro 終止密碼突變（Termination codon mutation）:當(dāng)DNA分子中的一個(gè)終止密碼發(fā)生突變，使多肽鏈的合成繼續(xù)進(jìn)行下去，一直延長至下一個(gè)終止密碼子時(shí)停止，產(chǎn)生延長的異常多肽鏈，稱延長突變（el

5、ongation M）?；貜?fù)突變：突變體經(jīng)過第二次突變又完全的或部分的恢復(fù)為原來的基因型和表現(xiàn)型。 完全恢復(fù)是由于堿基順序經(jīng)過第二次突變后又變?yōu)樵瓉淼膲A基順序，故亦稱真正的回復(fù)突變； 部分恢復(fù)是由于第二次突變發(fā)生在另一部位上，其結(jié)果是部分恢復(fù)原來的表現(xiàn)型，亦稱為第二位點(diǎn)突變（second site mutation）或基因內(nèi)校正（intragenic suppression）。抑制基因突變（Suppressor gene mutation）：基因內(nèi)部不同位置上的不同堿基發(fā)生了兩次突變，其中一次抑制了另一次突變的遺傳效應(yīng)。 例：血紅蛋白病單純6 谷氨酸 纈氨酸 血紅蛋白病，致死同時(shí)6 谷氨酸 纈

6、氨酸 + 73 天冬氨酸 天冬酰胺 Hb Harlem，臨床癥狀較輕，原因是73突變抑制了6的突變效應(yīng)。 2、插入和缺失移碼突變（frameshift mutation）：DNA編碼序列中插入（增加）或缺失一個(gè)或幾個(gè)堿基，其下游閱讀框發(fā)生改變，導(dǎo)致氨基酸順序及蛋白質(zhì)異?；驘o活性，稱為移碼突變。 -插入突變：DNA分子中插入一個(gè)或幾個(gè)堿基對。 -缺失突變：DNA分子中缺失一個(gè)或多個(gè)堿基對。 半胱 絲氨 谷氨 纈氨 半胱 精氨 賴氨 亮氨DNA TGC TCG CAA GTT GA TGC CGC AAG TTG 插入或缺失會造成其下游三聯(lián)密碼子錯(cuò)讀，生成完全不同的肽鏈。 改變讀碼框缺失T整碼突變

7、（Codon mutation）：DNA鏈的密碼之間插入或缺失一個(gè)或幾個(gè)密碼子，導(dǎo)致肽鏈增加了或減少了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，稱為整碼突變或稱密碼子插入或缺失。 如： AAG GAC CCG GCG -正常密碼子順序 AAG GAC AAA CCG GCG -插入 AAG GAC GCG -缺失 舉例 -T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-轉(zhuǎn)換 -T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-插入A -T-C-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失T

8、野生型基因 -T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C- -T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C-顛換堿基對的置換(substitution)移碼突變(framesshift mutation)轉(zhuǎn)換顛換插入缺失3、動態(tài)突變動態(tài)突變：鄰近基因或位于基因序列中的單核苷酸重復(fù)拷貝數(shù)，在一代代傳遞過程中會發(fā)生明顯的增加，如(CGG)n、(CAG)n等，從而導(dǎo)致某些遺傳疾病的發(fā)病。該突變可遺傳并產(chǎn)生表型效應(yīng)引起疾病，多為神經(jīng)系統(tǒng)疾病。代表疾?。篐utington舞蹈病(CAG)n、強(qiáng)制性肌營養(yǎng)不良，脆

9、性X綜合癥(CCG)n。動態(tài)突變正常動態(tài)突變（CAG三核苷酸重復(fù)）AGT CAG CAG CAG TTT TTA CGT AAC CCG DNA Met Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro AAsAGT CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG TTT TTA CGT AAC CCG DNA Met Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro AAs正常人：n=650 多態(tài)受累個(gè)體：n50 copies 多者幾百幾千copies隨著世代傳遞長度增加，發(fā)病年齡提前，病情加重。1.3 突變的原因兩個(gè)概念：

10、自發(fā)突變（spontaneous mutation)：由于正常的細(xì)胞活動，或細(xì)胞與環(huán)境的隨機(jī)相互作用，這些過程所引起的生物DNA序列的改變。誘發(fā)突變（induced mutation): 特定的化學(xué)或物理因素引起的DNA序列改變。Note: 所有突變都包含DNA序列的改變1.3.1 DNA分子的自發(fā)性損傷1、DNA復(fù)制中的錯(cuò)誤 以DNA為模板按堿基配對進(jìn)行DNA復(fù)制是一個(gè)嚴(yán)格而精確的事件，但也不是完全不發(fā)生錯(cuò)誤的。正常情況下，大腸桿菌復(fù)制過程中的錯(cuò)配率為1010左右。 2、DNA的自發(fā)性變化 生物體內(nèi)DNA分子可以由于各種原因發(fā)生變化，至少有： 堿基的異構(gòu)互變：例如，腺嘌呤（A）的互變異構(gòu)體（

11、A）可以與胞嘧啶（C）配對，模板鏈上存在這些異構(gòu)體的時(shí)候，子代鏈上就可能發(fā)生錯(cuò)誤，形成損傷。 脫嘌呤與脫嘧啶，使脫氧核糖和堿基G（A）或T（C）連接的糖苷鍵被打斷，從而失去G、A或T、C。 堿基的脫氨基作用：如C脫氨基后形成了U，在復(fù)制過程中將與A配對，從而引起GC AT轉(zhuǎn)換突變。 G A A C U T突變脫氨基復(fù)制3、轉(zhuǎn)座子的插入轉(zhuǎn)座子 (transposon 或 transposable element)是基因組內(nèi)相對獨(dú)立的、可移動序列，它們不必借用噬菌體或質(zhì)粒的形式就可以從基因組的一個(gè)部位直接轉(zhuǎn)移到另一個(gè)部位，這個(gè)過程稱為轉(zhuǎn)座（transposition）。轉(zhuǎn)座子每次移動時(shí)攜帶著轉(zhuǎn)座必

12、需的基因一起在基因組內(nèi)躍遷，所以轉(zhuǎn)座子又稱跳躍基因（jumping gene）。轉(zhuǎn)座子特點(diǎn)轉(zhuǎn)座以很低的頻率發(fā)生，而且轉(zhuǎn)座子的插入是隨機(jī)的。轉(zhuǎn)座子有時(shí)插入到一個(gè)結(jié)構(gòu)基因或基因調(diào)節(jié)序列內(nèi)，引起基因表達(dá)的改變。轉(zhuǎn)座子也可以引起基因組序列的重排，它們的移動也和進(jìn)化有關(guān)。現(xiàn)在認(rèn)為轉(zhuǎn)座子存在于地球上所有的生物。1.3.2 物理因素引起的DNA損傷 1、紫外線引起的DNA損傷當(dāng)DNA受到最易被其吸收波長（260 nm）的紫外線照射時(shí)，主要是使同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價(jià)鍵連成嘧啶二聚體。 2、電離輻射引起的DNA損傷電離輻射損傷DNA有直接效應(yīng)和間接效應(yīng)兩種途徑，直接效應(yīng)是DNA直接吸收射線能量而遭損傷

13、；間接效應(yīng)是指DNA周圍其他分子（主要是水分子）吸收射線能量產(chǎn)生具有很高反應(yīng)活性的自由基進(jìn)而損傷DNA。損傷包括： 堿基變化; 脫氧核糖變化; DNA鏈斷裂; 交聯(lián)。1.3.3 化學(xué)因素引起的DNA損傷1、烷化劑對DNA的損傷如甲基磺酸乙酯EMS，烷化劑能在DNA上的四個(gè)堿基發(fā)生作用，使其增加烷基側(cè)鏈，其最大的特異性是在鳥嘌呤的6位氧上增加一個(gè)烷基側(cè)鏈導(dǎo)致與T錯(cuò)配，從而在下個(gè)復(fù)制周期中產(chǎn)生GC AT轉(zhuǎn)換。2、羥胺HA：NH2OH也是一種特定誘發(fā)GC AT轉(zhuǎn)換的誘變劑。能在胞嘧啶4位上的氨基氮上發(fā)生羥基化作用，產(chǎn)生N4羥基胞嘧啶，它能像T那樣與A配對，產(chǎn)生GC AT轉(zhuǎn)換。3、亞硝酸鹽能使胞嘧啶（

14、C）脫氨變成尿嘧啶（U），經(jīng)過復(fù)制就可使DNA上的G-C變成A-T對，誘發(fā)GC AT；亞硝酸鹽還能誘發(fā)腺嘌呤（A）脫氨基形成次黃嘌呤H，H能和C配對，誘發(fā)AT GC轉(zhuǎn)換突變。 亞硝酸鹽可誘發(fā)兩個(gè)方向上的轉(zhuǎn)換。4、堿基類似物、修飾劑對DNA的損傷 如:人工可以合成一些堿基類似物用作促突變劑或抗癌藥物，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）等。胸腺嘧啶類似物5溴尿嘧啶（5-BU），由于胸腺嘧啶中5CH3被Br取代會導(dǎo)致5BU變換異構(gòu)體，使其堿基的配對能力發(fā)生變化。酮式烯醇式酮式腺嘌呤烯醇式鳥嘌呤轉(zhuǎn)換突變 ATGC A A G G T 5-BUT 5-BUC

15、 CGCAT G G A A C 5-BUC 5-BUT T摻入異構(gòu)體復(fù)制突變摻入異構(gòu)體復(fù)制突變1.4 突變的后果根據(jù)基因突變對機(jī)體的影響，有以下幾種情況：中性突變：變異后果輕微，對機(jī)體效應(yīng)不明顯。造成個(gè)體間的生物化學(xué)組成的遺傳學(xué)差異，一般對機(jī)體無影響；如：ABO血型，HLA，同功酶等。有利于個(gè)體生存生育；如Hbs突變基因雜合子比正常純合子對抗瘧疾。產(chǎn)生遺傳易感性；如：腫瘤易感性。引起遺傳病。每個(gè)健康人均由5-6個(gè)有害突變。致死突變：造成死胎、自然流產(chǎn)、生后夭折。第二節(jié) DNA損傷的修復(fù)機(jī)制 為了保證遺傳信息的高度穩(wěn)定性，生物細(xì)胞在進(jìn)化過程中形成了一系列多步驟的修復(fù)機(jī)制。 目前對DNA損傷和修

16、復(fù)的研究還不多，僅限于輻射生物反應(yīng)方面。2.1 DNA直接修復(fù)2.2 錯(cuò)配修復(fù)2.3 切除修復(fù) 堿基切除修復(fù)(base excision repair, BER) 核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair, NER)2.4 SOS反應(yīng)誘導(dǎo)的修復(fù)2.5 重組修復(fù)2.1 直接（回復(fù)）修復(fù)（direct repair）生物體內(nèi)存在多種DNA損傷以后而并不需要切除堿基或核苷酸的機(jī)制，這種修復(fù)方式稱為DNA的直接修復(fù)。直接修復(fù)即簡單地把損傷的堿基回復(fù)到原來狀態(tài)的修復(fù)，可分為以下幾種：1. O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶直接修復(fù) 通過從O6-甲基鳥嘌呤上把甲基直接轉(zhuǎn)移到酶的

17、半胱氨酸殘基上來直接回復(fù)DNA的損傷。酶DNA甲基轉(zhuǎn)移酶O6-甲基轉(zhuǎn)移酶使O6-甲基化鳥嘌呤恢復(fù)成鳥嘌呤2. 光解酶復(fù)活（photoreactivation） 光裂合酶（photolyase）酶學(xué)光復(fù)活過程是修復(fù)UV導(dǎo)致的環(huán)丁烷嘧啶二聚體的直接機(jī)制，這種修復(fù)具有高度的專一性。3. 單鏈斷裂修復(fù)DNA單鏈斷裂是損傷的一種常見形式，可以通過DNA連接酶的重接而修復(fù)。 光復(fù)活作用環(huán)丁烷嘧啶二聚體Light UV引起的光損傷嘧啶二聚體能被光裂合酶修復(fù)，該酶能在暗處和嘧啶二聚體結(jié)合，形成酶和DNA復(fù)合體，在光照條件下，復(fù)合體分解，使嘧啶二聚體分解為原先正常的堿基。2.2 錯(cuò)配修復(fù)（Mismatch re

18、pair) 大腸桿菌中的DNA腺嘌呤甲基化（DAM）修復(fù)途徑 原核細(xì)胞內(nèi)存在Dam甲基化酶，能使位于5GATC序列中腺苷酸甲基化。 復(fù)制后DNA在短期內(nèi)（數(shù)分鐘）為半甲基化的GATC序列，一旦發(fā)現(xiàn)錯(cuò)配堿基，即將未甲基化鏈切除一段包含錯(cuò)誤堿基的序列，并以甲基化的鏈為模板進(jìn)行修復(fù)。參與錯(cuò)配修復(fù)的酶與蛋白質(zhì)Dam甲基化酶；MutH、MutL、MutS多肽；解螺旋酶；DNA聚合酶；外切酶、；RecJ核酸酶DNA連接酶；SSBDNA甲基化酶2.3 切除修復(fù)（暗復(fù)活）1. 堿基切除修復(fù)（base excise repair，BER）BER可以去除因脫氨基或堿基丟失，無氧射線輻射或內(nèi)源性物質(zhì)引起的環(huán)氮類的甲

19、基化等因素產(chǎn)生的DNA損傷。BER是維持DNA穩(wěn)定的重要修復(fù)方式。AP核酸內(nèi)切酶修復(fù)途徑單個(gè)嘌呤或嘧啶脫去后的位點(diǎn)成為AP位點(diǎn)。細(xì)胞中自發(fā)產(chǎn)生AP位點(diǎn)的頻率很高。由一種專門在AP位點(diǎn)上切割的酶切斷DNA上的磷酸二酯鍵，然后再啟動由DNA外切酶、DNA聚合酶和連接酶參與的切除修復(fù)過程。 糖基化酶是損傷特異性的，細(xì)胞中有多種具有不同特異性的DNA糖基化酶 糖基化酶通過水解糖苷鍵去除受損堿基 切除后在DNA上形成AP位點(diǎn)，再經(jīng)過AP核酸內(nèi)切酶途徑修復(fù)。 DNA糖基化酶（glycosylate）修復(fù)途徑2、核苷酸切除修復(fù) ( nucleotide-excision repair，NER ) 當(dāng)DNA鏈

20、上相應(yīng)位置的核苷酸發(fā)生損傷，導(dǎo)致雙鏈之間無法形成氫鍵，在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除掉，并以完整的那一條鏈為模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)的過程。 NER可以修復(fù)UV照射形成的嘧啶二聚體，還能消除體內(nèi)產(chǎn)生的各種嘌呤和嘧啶加合物。NER的關(guān)鍵特征是對損傷的DNA鏈的兩端進(jìn)行切割。 NER在已研究過的真核生物中都很相似，說明其在進(jìn)化過程中高度保守。 在人類中這是一種重要的修復(fù)途徑。著色性干皮癥是由于缺乏切除修復(fù)酶造成的遺傳性缺陷，正常人的皮膚細(xì)胞和該缺陷者的皮膚細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)對UV的敏感性有很大差異，具有該缺陷的人在30歲之前就易死于皮膚癌。2.4 SOS反應(yīng)誘導(dǎo)的修復(fù)（易錯(cuò)修復(fù)）SOS response & DNA repairSOS反應(yīng)：細(xì)胞DNA受到損傷或復(fù)制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，為求得生存而出現(xiàn)的應(yīng)急效應(yīng)。SOS反應(yīng)誘