酶工程-試題及答案

1、酶工程試題一參考答案：一、填空題（每空1分，共28分）1、日本稱為酵素”的東西，中文稱為酶，英文則為Enzyme,是庫尼（Kuhne ）于1878年首先使用的。 其實(shí)它存在于生物體的細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞外。2、1926年，薩姆納（Sumner）首先制得脲酶結(jié)晶，并指出酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)。他因這一杰出貢獻(xiàn)，獲1947 年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng).3、目前我國廣泛使用的高產(chǎn)糖比酶優(yōu)良菌株菌號為As3.4309,高產(chǎn)液化酶優(yōu)良菌株菌號為近7。658。在微 生物分類上，前者屬于霉菌后者屬于細(xì)菌。4、1960年，查柯柏（Jacob）和莫洛德（Monod）提出了操縱子學(xué)說，認(rèn)為DNA分子中，與酶生物合成 有關(guān)的基因有四種，即

2、操縱基因、調(diào)節(jié)基因、啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因。5、借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法.6、酶的分離純化方法中，根據(jù)目的酶與雜質(zhì)分子大小差別有凝膠過濾法，超濾法和超離心法三種。7、由于各種分子形成結(jié)晶條件的不同，也由于變性的蛋白質(zhì)和酶不能形成結(jié)晶，因此酶結(jié)晶既是純化手段， 也是純化標(biāo)志。名詞術(shù)語的解釋與區(qū)別（每組6分，共30分）1、酶生物合成中的轉(zhuǎn)錄與翻譯酶合成中的轉(zhuǎn)錄是指以核苷三磷酸為底物，以DNA鏈為模板在RNA聚合酶的作用下合成RNA分子。酶 合成中的翻譯是指以氨基酸為底物，以mRNA為模板，在酶和輔助因子的共同作用下合成蛋白質(zhì)的多肽鏈。2、誘導(dǎo)與阻遏

3、酶合成的誘導(dǎo)是指加入某種物質(zhì)使酶的合成開始或加速進(jìn)行的過程;酶合成的阻遏作用則是指加入某種物質(zhì) 使酶的合成中止或減緩進(jìn)行的過程.這些物質(zhì)分別稱為誘導(dǎo)物及阻遏物。3、酶回收率與酶純化比（純度提高比）酶的回收率是指某純化步驟后酶的總活力與該步驟前的總活力之比。酶的純化比是之某純化步驟后的酶的比(完整word版)酶工程_試題及答案 活力與該步驟前的比活力之比.4、酶的變性與酶的失活酶的變性是指酶分子結(jié)構(gòu)中的氫鍵、二硫鍵及范德華力被破壞，酶的空間結(jié)構(gòu)也受到破壞源來有序、完整的 結(jié)構(gòu)變成了無序，松散的結(jié)構(gòu)，失去了原有的生理功能酶的失活則是指酶的自身活性受損(包括輔酶、金屬 離子受損)，失去了與底物結(jié)合的

4、能力。5、a-淀粉酶與&-淀粉酶二者的區(qū)別在于a-淀粉酶是一種內(nèi)酶,可以跨越淀粉分子的a-1,6鍵到分子內(nèi)部進(jìn)行隨機(jī)切割，所得的 產(chǎn)物為a型的麥芽糖和環(huán)糊精，它使碘色消失的速度較快，但還原糖較慢阡淀粉酶則是一種夕卜酶，不能跨 越a-1,6鍵，只能從淀粉的非還原末端2個(gè)2個(gè)地進(jìn)行切割，所得的產(chǎn)物為P型的麥芽糖和界限糊精， 它使碘色消失較慢，但還原糖較快二者的共同點(diǎn)在于都能水解a-1,4鍵和都不能水解a-1,6鍵。四、問答題1、舉出四例，說明酶在醫(yī)學(xué)上有廣闊的用途。 醫(yī)藥用酶：a。消化用酶：a、&-淀粉酶、胰酶、胰蛋白酶b。消炎用酶：木瓜蛋白酶、菠蘿酶c。溶纖維酶：尿酸酶、鏈激酶、溶栓酶d。腫瘤用

5、酶：L-天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶診斷用酶：a。尿酸酶：用于檢測血液和尿液中的尿酸含量b。甘油激酶:由于檢測血液中甘油三酯的含量檢測用酶:a。脫羧酶：由于檢測L-賴氨酸和L-谷氨酸b.蟲熒光素酶：用于檢測ATP2、3、試述采用雙酶法生產(chǎn)固體麥芽糊精的工藝過程及主要工藝條件。應(yīng)用雙酶法生產(chǎn)固體麥芽糊精的工藝流程及主要工藝條件如下：（完整word版）酶工程_試題及答案 淀粉調(diào)漿（淀粉與水）配料缶廠除渣齊L噴射液化器90oC液化維持罐30 - 40而廣氣液混合滅酶（加入蒸汽）滅酶維持罐一氣液分離罐板式冷卻L 糖化貳氣液混合滅酶器中和脫色罐板框過濾濾清糖液貯寸采用凝膠層析除雜進(jìn)一步精制，干燥的固體麥芽糊精

6、4、今欲生產(chǎn)糖化酶結(jié)晶產(chǎn)品，試擬出合理的工藝步驟，并說明下游工程的主要工藝條件。生產(chǎn)糖化酶的結(jié)晶產(chǎn)品，可采用鹽析結(jié)晶法。得到糖化酶粗酶液后，須進(jìn)行分離純化，使其達(dá)到一定的濃度和 純度（50%）,向濃酶液中緩慢加入飽和中性鹽溶液（NH4） 2SO4 ），至出現(xiàn)稍渾濁，于低溫下（0 -4oC） 靜置，待溶液中有晶體析出，可向溶液中補(bǔ)充少量飽和鹽溶液（操作過程中保證PH”4.5），也可采用有機(jī)溶 劑法結(jié)晶。向濃酶液中緩慢加入有機(jī)溶劑3混合均勻，于低溫下靜置一段時(shí)間，離心去除沉淀物，取上清液靜 置于低溫下，可析出晶體.發(fā)酵生產(chǎn)糖化酶工藝流程：斜面菌種一小米三角曠孢子懸浮礦種子蓄 發(fā)酵罐糖化酶粗酶液一、

7、填空題（每空1分，共20分）1制備固定化酶最早采用的方法是1953年德國的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯樹脂為載體與 羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等結(jié)合，制成固定化酶 。2酶的常見發(fā)酵生產(chǎn)方式有兩種,一種是 液體深層發(fā)酵產(chǎn)酶另一種是固體培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)酶3乙醇能用于酶的分離是 由于有機(jī)溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低，使酶分子表面的水膜破壞，也使 其溶解度降低而沉淀析出 的結(jié)果。4國際酶學(xué)委員會根據(jù)酶的 反應(yīng)類型而將酶分為六大類、例如常見的谷氨酸脫羧酶是裂解酶，限制性核酸內(nèi)切酶是水解酶，而丙氨酸消旋酶是 異構(gòu)酶 .6酶的生物合成模式多樣，其中同步合成型，也常稱為生長偶聯(lián)

8、型，其特點(diǎn)是屬于該合成型的酶，其生物(完整word版)酶工程_試題及答案 合成伴隨著細(xì)胞的生長而開始；在細(xì)胞進(jìn)入旺盛生長期時(shí)，酶大量生成；當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶的合 成隨著停止。而滯后合成型，也常稱為非生長偶聯(lián)型，其特點(diǎn)是屬于滯后合成型的酶，之所以要在細(xì)胞 生長一段時(shí)間甚至進(jìn)入平衡期以后才開始合成。7酶的非水相催化中，必需水是指維持酶分子完整的空間構(gòu)象所必需的最低水量.8 The property of enzyme usually changes after immobilization, like:Km increase 、Vmax decreaseetc。二、名詞解釋(每題4分，共2

9、0分)1交聯(lián)型固定化酶借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法。常用的雙功能試劑有戊二醛、 己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應(yīng)用最廣泛的是戊二醛.交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體結(jié)合 牢固，可以長時(shí)間使用。但由于交聯(lián)反應(yīng)條件較激烈酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，致使酶活力損失較大，而且 制備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小，給使用帶來不便.為此，可將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用， 以取長補(bǔ)短。2超濾借助超濾膜將不同大小的物質(zhì)顆粒或分子分離的技術(shù).超濾膜截留的顆粒直徑為20-2000埃,主要用于分離病 毒和各種生物大分子.3氨基酸置換修飾將蛋白質(zhì)中某個(gè)氨基酸替換為另

10、一種氨基酸的修飾方法?，F(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點(diǎn)突變技 術(shù)。定點(diǎn)突變(site directed mutagenesis)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種基因操作技術(shù).是指在DNA 序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù).是蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering)和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。定點(diǎn)突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提 供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。4 Michaelis constantKm is referred to as the Michaelis constant （ 米氏常數(shù)）.When S is equal

11、to Km, the reaction velocity is equal to Vmax/2。The experimentally determined value Km is considered a constant that is characteristic of the enzyme and the substrate under specified conditions It may reflect the affinity of the enzyme for its substrate。5 Fluidized Bed Reactors , FBRIn fluidized bed

12、 reactor （FBR） , flow of gas and/or substrate keeps the immobilized enzyme particles in a fluidized state.三、問答題（每題12分，共60分）1 What characteristics of enzyme protein could be used as the groundwork of separation and purification methodology? Please describe the separation and purification techniques w

13、hich are base on it.Answer as the following tableThe characteristicseparation and purification techniquesMolecule weightUnltra一filtrationNet chargeElectrophoresisIon exchange chromatographyAffinityAffinity chromatographyExtractionParticle sizeGel chromatographyDensityCentrifugationetc.。etc.（完整word版）

14、酶工程_試題及答案 2 The users of industrial enzyme have an instant demand that the thermo stability and operational ability of enzyme should be enhanced much more So how can we get some specific thermophilic enzyme?Outline of answer :1、screening from the specific organism in some extreme hot environment, in

15、 which there might exist the objective enzyme ；2、Modify the enzyme skeleton, micro-environment or some functional group to enhance the thermostability ；3、use site-directed mutation （protein engineering） or directed evolution method to change the structure of enzyme. It is operated on the gene level。

16、3分子篩、離子交換和親和層析是三種分離、純化酶蛋白的方法，你如何根據(jù)所要分離、純化的酶制劑的性 質(zhì)選擇使用。參考答案提綱：1、分子篩：以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá) 到物質(zhì)分離;2、離子交換：利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各種離子的親和力不同而達(dá)到分 離目的；3、親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化;4、 分離純化步驟組合規(guī)律：考慮速度、成本、分辨率等等。4舉例說明什么是酶的生物合成過程中基因表達(dá)的誘導(dǎo)與阻遏，正調(diào)控與負(fù)調(diào)控模式？（1）誘導(dǎo):酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象一Jacob and Monod的工作：已知

17、分解利用乳糖的酶有:b一半乳糖苷酶；b 一半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。實(shí)驗(yàn)中：1。大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)無上 述三種酶合成；2。大腸桿菌生長在唯一碳源乳糖培養(yǎng)基上時(shí),細(xì)胞內(nèi)有上述三種酶合成;當(dāng)換成葡萄糖培養(yǎng)基 時(shí)，三種酶基本消失；3.表明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則：需要時(shí)才合成。某些代謝物可以誘導(dǎo)某些酶的合成， 是通過促進(jìn)為該酶編碼的基因的表達(dá)而進(jìn)行的，這種現(xiàn)象叫做酶合成的誘導(dǎo)。（2 ）阻遏：酶合成阻遏的現(xiàn)象一 Jacob and Monod的工作：實(shí)驗(yàn)中:1.大腸桿菌生長在無機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時(shí),檢測到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；2.在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)

18、現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失.3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌生長的經(jīng)濟(jì)原則：不需要就不合成。某些代謝物可 以阻止某些酶的合成，是通過阻止為該酶編碼的基因的表達(dá)而進(jìn)行的，這種現(xiàn)象叫做酶合成的阻遏。（3）負(fù) 調(diào)控：乳糖操縱子的誘導(dǎo)機(jī)制 （4）正調(diào)控：分解代謝物阻遏調(diào)控機(jī)制5 Please use the data in the following figure to calculate the specific activity of enzyme after eachstep of purification， and the total efficiency

19、of the purification process.（ 8 分）specific activity 10、specific activity 10、32、200、600、15000unit/mgProcedure pr MepFraction volume （袖Total protein （mg）Activityfun福1.Crude cellular extractlr40010,000100r0002Precipitation with ammonium sulfate2803,00096rOOOlon-exchangchromatography9040080f0004.Size-ex

20、cl us ion chromatography8010060,0005.Affinity chromatography6345,000answer:efficiency 45000/100000 二 45%（or酵母泥） （or酵母泥） （or過濾除雜）（or反復(fù)凍融）養(yǎng)菌離心取菌體細(xì)曠清洗細(xì)胞超聲波破碎細(xì)胞鹽析沉淀分離透析除鹽（or雙水相萃取）i 葡聚糖凝膠G10PAGE電泳法（鑒定乙醇脫氫酶純度）注：每一步都要進(jìn)行酶活測定后方可進(jìn)行下一步操作（完整word版）酶工程_試題及答案一,啤酒廢酵母預(yù)處理工藝：廢酵母泥加水稀釋過篩除雜離心分離1、稱取廢酵母泥20g ；2、加60ml（3倍于酵母泥

21、的體積）5C的冷水稀釋；3、過篩除雜:將稀釋的酵母泥充分?jǐn)嚢杈鶆?，?0目的篩子篩分一次，即除去80%的雜質(zhì)，再用100目的 篩子篩分一次，即可除去酵母泥中的全部可見雜質(zhì)；4、離心分離：經(jīng)過篩分后的酵母乳液，2000r/min,離心5min,傾出上清液，即得不含雜質(zhì)的酵母。5、脫苦脫臭:將上述處理的酵母用10C無菌水以酵母量/水量二1/4,洗3次再用5%NaCl溶液洗一次，即 可達(dá)到脫苦脫臭的目的；6、離心分離：經(jīng)脫苦脫臭的酵母乳進(jìn)行離心分離2000r/min，離心5min，即得脫苦脫臭的酵母泥。21、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的一般步驟？1.根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)和培養(yǎng)基成分確定時(shí)一些必須考慮的問題，初步確定可能的

22、培養(yǎng)基成分2。通過單因子實(shí)驗(yàn)最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分；3。當(dāng)培養(yǎng)基成分確定后，剩下的問題就是各成分最適的濃度，由于培養(yǎng)基成分很多，為減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)常采用一些合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法.22、培養(yǎng)基成分選擇考慮的問題？1。菌種的同化能力2.代謝的阻遏和誘導(dǎo)3.合適的C、N比4。pH的要求23、讀書報(bào)告：舉例說明培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的方法與步驟？24、討論:培養(yǎng)基優(yōu)化在發(fā)酵優(yōu)化控制中的作用與地位？發(fā)酵優(yōu)化控制分兩個(gè)階段：第一階段控制菌體的生長，目的是使長好的菌體能處在最佳的產(chǎn)物合成狀態(tài)。培養(yǎng)基優(yōu)化應(yīng)該保證菌體快速 （完整word版）酶工程_試題及答案 生長，有利于產(chǎn)物合成和分泌的酶系開啟，而不利于產(chǎn)物合成酶系的

23、關(guān)閉,處于最佳的產(chǎn)物合成狀態(tài)，并且副產(chǎn)物合成和分泌的酶系盡可能的少開啟第二階段控控制產(chǎn)物的合成.該階段，培養(yǎng)基優(yōu)化應(yīng)使產(chǎn)物合成能較長時(shí)間保持在最大合成速度。副產(chǎn)物的的合成速率盡可能小.25、什么是種子的擴(kuò)大培養(yǎng)？種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。26。種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求？種子擴(kuò)培的目的:接種量的需要，菌種的馴化，縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平種子的要求：總量及濃度能滿足要求，生理狀況穩(wěn)定，個(gè)體與群體，活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長， 無雜菌污染27、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的一般

24、步驟？休眠孢子T母斜面活化T搖瓶種子或茄子瓶斜面或固體培養(yǎng)基孢子T一級種子罐一二級種子罐T發(fā)酵罐28、在大規(guī)模發(fā)酵的種子制備過程中，實(shí)驗(yàn)室階段和生產(chǎn)車間階段在培養(yǎng)基和培養(yǎng)物選擇上各有何特點(diǎn)？ 實(shí)驗(yàn)室階段培養(yǎng)物選擇的原則：種子能擴(kuò)培到一定的量和質(zhì)，獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子/菌體。培養(yǎng)基的選 擇應(yīng)該是有利于菌體的生長，對孢子培養(yǎng)基應(yīng)該是有利于孢子的生長。在原料方面，實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)階段， 規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細(xì)。生產(chǎn)車間階段培養(yǎng)物的選擇原則最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體。培養(yǎng)基選擇首先考慮的是有利于孢子 的發(fā)育和菌體的生長，所以營養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富.

25、在原料方面：不如實(shí)驗(yàn)室階段那么精細(xì)，而是基本接近 于發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個(gè)方面的原因：一是成本二是馴化29、什么是接種量？對于細(xì)菌、放線菌及霉菌常用的接種是多少？接種量=移入種子的體積/接種后培養(yǎng)液的體積細(xì)菌5%、放線菌20%霉菌10%30什么是發(fā)酵繃數(shù)？發(fā)酵級數(shù)對發(fā)酵有何影響，影響發(fā)酵級數(shù)的因素有哪些？一般由菌絲體培養(yǎng)開始計(jì)算發(fā)酵級數(shù)，但有時(shí)，工廠從第一級種子罐開始計(jì)算發(fā)酵級數(shù)發(fā)酵級數(shù)對發(fā)酵影響:1。種子級數(shù)少，可簡化工藝和控制，減少染菌機(jī)會2。種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時(shí)間延長,降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機(jī)會3。級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級。4。在發(fā)酵產(chǎn)品的放大

26、中，反應(yīng)級數(shù)的確定是非常重要的一個(gè)方面影響發(fā)酵級數(shù)的因素:（1）菌種生長特性， 孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度;（2）發(fā)酵規(guī)模.（3）工藝要求.（4）接種量的影響。31、什么是種齡？事宜種齡確定的依據(jù)？種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。原則：對數(shù)生長期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對較大，但是最終由實(shí)驗(yàn)結(jié)果定。32、讀書報(bào)告:結(jié)合具體的產(chǎn)品理解種子質(zhì)量控制的方法，以及認(rèn)識種子質(zhì)量對發(fā)酵的影響？影響斜面種子質(zhì)量的因素:（1）原材料質(zhì)量，水質(zhì)，培養(yǎng)基pH。（ 2）滅菌條件,（3）接種量，（4）溫度，通風(fēng)、（5）培養(yǎng)時(shí)間（6）有害氣體或揮發(fā)物（7）冷藏條件種子質(zhì)量好：1.縮短發(fā)

27、酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平.2。無雜菌污染。3移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長.4.泡末產(chǎn)生少.5.產(chǎn)物生成速率大.6。副產(chǎn)物合成少。7.對下游分離純化有利33、接種、倒種、雙種？接種：接入種子罐后直接移種到發(fā)酵罐。雙種：兩個(gè)種子罐種子接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。倒種一部分種子來源 于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。34、什么是菌體的生長比速？產(chǎn)物的形成比速？基質(zhì)的消耗比速？維持消耗？菌體的比生長速率：單位重量的菌體瞬時(shí)增量M= （ dx/dt）/x ;單位為1/h，其中x一菌體濃度（g/L ）產(chǎn)物的形成比速：單位時(shí)間內(nèi)單位菌體形成產(chǎn)物（菌體）的量n= （ dp/dt）/x ,;單位為1/h,其中p產(chǎn)物濃度（g/L ）基質(zhì)的比消耗速率：單位時(shí)間內(nèi)單位菌體消耗基質(zhì)的量=（ds/dt）/x ;單位為1/h，其中s底物濃度（g/L ）35、什么是Monod方程其使用條件如何?各參數(shù)的意義與求解？當(dāng)培養(yǎng)基中不存在抑制細(xì)胞生長的物質(zhì)時(shí)，細(xì)胞的生長速率與基質(zhì)濃度關(guān)系（Monod方程式）如下:p = pmax S/（Ks+ S）廠菌體的生長比速.S :限制性基質(zhì)濃度.Ks :半飽和常數(shù)pmax :最大比生長速度Monod方程的參數(shù)求解（雙倒數(shù)法）：將Monod方程取倒數(shù)可得：1