PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

1、PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的分析Gel electrophoresisRestriction endonucleaseMolecular hybridizationNucleic acid sequence1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析瓊脂糖凝膠電泳常用于臨床檢測（定性）聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中可用于科研及檢測分析2瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物根據(jù)瓊?cè)芙鉁囟龋循傊欠譃橐话悱傊呛偷腿埸c瓊脂糖低熔點瓊脂糖熔點為6265，溶解后在37下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時，主要用于DNA片段的回收，質(zhì)粒與外源

2、性DNA的快速連接等3凝膠濃度選擇瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍4電泳緩沖液 常用三種緩沖液 Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）TBE與TPE：緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀TAE：緩沖容量低，但價格較便宜，因而推薦選用TAE。緩沖液中的 EDTA 可螯合二價陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物降解510TBE緩沖液的配制配方Tris 10

3、8克EDTA 9.3克硼酸 55克H2O至 1000mlpH應(yīng)為8.08.2臨用時用水稀至0.5TBE（20倍稀釋）6核酸電泳的指示劑指示劑：溴酚蘭二甲苯青溴酚蘭：在堿性液體中呈紫蘭色電泳中，溴酚蘭的遷移率與雙鏈線性DNA片段瓊脂糖凝膠濃度0.6%1%1.4%2%遷移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb7核酸電泳的指示劑二甲苯青：水溶液呈蘭色，電泳時，其遷移速率與雙鏈線性DNA大致相當(dāng)瓊脂糖凝膠濃度1%1.4%遷移率2Kb1.6Kb8載樣緩沖液指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液作用：增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預(yù)測

4、核酸電泳的速度和位置使樣品呈色，使加樣操作更方便9核酸電泳的染色劑最常用的染色劑溴化乙錠銀染色10核酸電泳的染色劑溴化乙錠（ethidium bromide，EB）是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的EB，有時亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色1015min瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見核酸電泳帶，其DNA量一般5ng溴化乙錠太多，凝膠染色過深，核酸電泳帶看不清時，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察11核酸電泳的染色劑銀染色：銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如

5、甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色靈敏度比EB高200倍，但銀染色后，DNA不宜回收12電泳電泳裝置電泳儀電泳槽灌膠模具等13電泳儀普通電泳儀高壓電泳儀14電泳槽水平平板垂直平板15電泳方法用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈，放在水平桌面上，并架好梳子根據(jù)核酸分子量的大小配制不同濃度的瓊脂糖凝膠，一般 200400 bp 的DNA片段（可配制1.21.7%）16電泳方法配制瓊脂糖凝膠及倒膠0.5TBE電泳緩沖液100ml于三角燒瓶中，稱取一定量的瓊脂糖粉放入后沸水鍋或微波爐內(nèi)加熱熔化，冷卻至60(需要時可加入EB)，倒入電泳槽中，

6、待凝固向電泳槽中倒入0.5 TBE，其量以沒過膠面2mm為宜，小心移去梳子（如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)除去）17電泳方法上樣與通電在DNA樣品中加入0.2體積的載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內(nèi)接通電源，一般紅色為正極黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動（靠近加樣孔的一端為負(fù)），電壓為1 5V/cm（長度以兩個電極之間的距離計算）根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳，一般 200400bp 的PCR產(chǎn)物50V電壓，電泳2040min18電泳方法結(jié)果觀察紫外儀上觀察電泳帶及其位置并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小19聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于1Kb的DNA片段和DNA

7、序列分析其裝載的樣品量大，回收DNA純度高，長度僅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分離20聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED（N，N，N，N一四甲基乙二胺）和過硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N，N一亞甲雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定的21不同濃度丙烯酰胺和DNA有效分離范圍 丙烯酰胺（%）有效分離范圍（bp）溴酚蘭*二甲苯青*3.510020001004605.080500652608.0604004516012.040200307015.0251501560

8、20.010100124522材料電泳儀器：電泳儀垂直電泳槽及其附件.30%丙烯酰胺丙烯酰胺，29克N，N一亞甲基雙丙烯酰胺，1克H2O，加至100ml裝于棕色瓶內(nèi)，4可保存二個月23材料10%過硫酸銨過硫酰銨，1克，加水至 10 ml4可保存一周，-20可保存一個月1TBE電泳緩沖液TEMED（四甲基乙烯基二胺）24聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳配膠：根據(jù)分離DNA片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出將裝好的玻璃電泳板傾斜成4560角按表3配制所需%濃度凝膠的毫升數(shù)加入TEMED后，立即混勻

9、，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時為止25聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，密切注意防止梳齒下產(chǎn)生氣泡，用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成10角，可減少液體泄漏的機(jī)會室溫聚合一小時后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入0.1TBE緩沖液26聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因為梳子取出后，梳子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn)生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后DNA電泳帶型不規(guī)則將DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內(nèi)，加樣時不要產(chǎn)生氣泡27聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳接好電極，電壓為

10、1-8V/cm，進(jìn)行電泳電泳畢，切斷電源，取出膠床板，小心移去一塊玻璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上，浸入含0.5ug/ml的溴化乙錠溶液中，1530min后取出水洗，紫外儀下觀察結(jié)果聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出10ng以上量的DNA條帶（要求更高的靈敏度，可用銀染）282930電泳結(jié)果分析DNA Marker DNA人工片段100 bp ladder31酶切分析根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應(yīng)的酶進(jìn)行酶切酶切產(chǎn)物電泳分離后，獲得符合理論的片段此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究32分子雜交檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)檢測PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法主要的雜

11、交 Southern印跡雜交斑點雜交33Southern印跡雜交：在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈并作標(biāo)記（探針）與 PCR 產(chǎn)物雜交此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測 PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。3435斑點雜交：將PCR 產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼龍膜薄膜上寡核苷酸探針雜交觀察有無著色斑點主要用于 PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析36RDB檢測 -地中海貧血突變基因-29（AG）-28（ AG）17（ AT，AAG TAG）E （CD26 GAG AAG）IVS-I-1（ GT ）IVS-I-5（ GC）27-28（+C）41-42（-CTTT）43（ GT

12、）71-72（+A或+T）654（ CT）37微孔板夾心雜交法通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域特異性雜交，使PCR產(chǎn)物間接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的檢測探針與產(chǎn)物的另一區(qū)域特異性雜交，漂洗后顯色即可判斷結(jié)果該法使用了兩個雜交過程來檢測一個產(chǎn)物，其特異性較一次雜交的檢測法高38Principle：NOS（11014/cm2） N-羥化琥珀酰亞胺酯39Principle -CCCCCCCapture Probe:：NH2Detection Probe:：Biotin40Principle41：NH2標(biāo)記的探針：Biotin標(biāo)記的探針Avidin-H

13、RP 顯色系統(tǒng)：NOS基團(tuán)Principle42微孔板夾心雜交法 方法學(xué)評價敏感度：該法檢測HBV，敏感度達(dá)5個HBV DNA分子敏感性和特異性與 PCR 32P 探針的Southern雜交法相當(dāng)PCR微孔板夾心雜交法：操作簡便、快速、避免了同位素標(biāo)記探針的危害，顯色反應(yīng)類似于臨床常規(guī)應(yīng)用的ELISA43微孔板直接雜交不是采用夾心法，而是直接將特異的探針固定于微孔板上，然后用生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與之雜交只進(jìn)行一次雜交，方法簡單，但特異性不高44微孔板雜交的基本過程DNA的固定探針的雜交酶聯(lián)顯色45DNA的固定在一定鹽濃度條件下，DNA單鏈的一端可固定在微孔板上不同來源的微孔板固定DNA時所需

14、鹽濃度不同。因此，必須用一系列的鹽濃度（0.153.0mol/L NaCl）來固定加熱變性的核酸，然后，用固定濃度的標(biāo)記探針雜交。顯色后，判斷合適的固定鹽濃度46DNA的固定固定方法的選擇必須使DNA最大量的固定，且不影響雜交用合適濃度的 NaCl 或（NH4）2SO4 可達(dá)到此目的。硫氰酸鈉則無固定作用。鹽濃度合適時，DNA應(yīng)為一端固定到微孔板上，而太低或太高濃度的鹽可能使DNA “平躺”固定在孔內(nèi)而影響雜交47DNA的固定Mg2+雖有促進(jìn)DNA固定的作用，但它可激活Dnase，所以，一般不用被固定的DNA應(yīng)大于300bp，否則影響雜交結(jié)果。每孔可固定高達(dá) 200ng（624bp）的DNA鹽

15、濃度和固定量確定后，按下法固定DNA48DNA的固定待固定DNA 100加熱 5min 變性，并立即冷卻，與合適的固定液混合后，加入微孔板的孔內(nèi)固定液：10mmol/L磷酸鈉-10mmol/L EDTA，pH7.0，合適濃度的NaCl（與DNA變性混合后，終濃度為最適固定濃度）用膠布封好，浸于37水浴2h用PBS-0.05%Tween20 漂洗3次立即用于雜交，或封閉于塑料袋內(nèi)保存49雜交與顯色雜交可采用標(biāo)準(zhǔn)的雜交系統(tǒng)雜交夾心雜交時，是將變性的PCR產(chǎn)物與檢測探針一并加入雜交與漂洗時間均較一般膜雜交短顯色根據(jù)不同酶標(biāo)，檢測分子的不同來選擇不同的底物、終止劑和測定波長50顏色互補(bǔ)分析法（A）利用

16、三原色原理，當(dāng)不同DNA片段（A和B）同時擴(kuò)增時，用引物5端修飾技術(shù)將不同引物用不同顏色熒光素標(biāo)記（A片段引物標(biāo)記綠色的熒光素，B標(biāo)記紅色的羅丹明）如果僅有一條片段被擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物激發(fā)后，只有一種顏色（紅色或綠色）如果兩條不同大小的片段均被擴(kuò)增，可通過電泳分離，紫外激發(fā)后可觀察到不同顏色的兩條帶如果兩條被擴(kuò)增片段大小相同，電泳后可見一條紅綠互補(bǔ)色-黃色帶如果不用電泳法分離擴(kuò)增片段，通過一定手段除未摻入引物，亦可觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色。此時，擴(kuò)增產(chǎn)物無論大小，只要均被擴(kuò)增，就可見一條紅綠互補(bǔ)的黃色條帶51顏色互補(bǔ)分析法 方法學(xué)評價該法簡便、易于自動化可用于檢測基因（缺失、染色體轉(zhuǎn)位）和病原微生物只

17、判斷產(chǎn)物的有無在檢測多種基因?qū)嵶儭⒍喾N病原菌和HLA分型時，可用復(fù)合PCR。此時，不同引物可用不同熒光素標(biāo)記（如綠色的ROX；藍(lán)色的COUM等）52PCR-ELISA法：本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測5端修飾后仍可進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增特異靶序列，因此，可以通過修飾其中一個引物的5端使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定的功能基團(tuán)，而通過另一引物5端的修飾使產(chǎn)物便于檢測操作過程531 鏈親和素包被：聚丙乙烯微孔板，包被效果差異并不顯著親和層析純化的鏈霉親和素（13U/mg，Sigma公司）用PBS-Tween液140mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/L K2HPO4，0.05%(w/v)Tween20，pH7.2配成1g/ml向微孔板的每孔內(nèi)加入100l，封好，室溫過夜用PBS液漂洗542 擴(kuò)增產(chǎn)物與包被板的結(jié)合PCR產(chǎn)物1l用501 PBS-Tween液稀釋后加入包被孔內(nèi)室溫下作用30mi