研究生課程-分子生物學(xué)-專題篇

1、3.專題篇第十九章基因診斷基因診斷：以DNA或RNA為診斷材料，通過檢查基因的存在，結(jié)構(gòu)缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程。基本原理：檢測(cè)DNA或RNA的結(jié)構(gòu)變化與否、量的多少及表達(dá)功能是否正常， 確定受檢者是否存在基因水平的異常變化，以此作為疾病診斷的依據(jù)。意義：不僅能對(duì)疾病作出早期和確切診斷， 而且能確定個(gè)體對(duì)疾病的易感性及疾 病的分期、分型、療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷等。第一節(jié)基因診斷的技術(shù)方法常用的分子生物學(xué)技術(shù)（一）核酸分子雜交包括 Southern blot; Northern blot; dot blot; in situ hybridization 等（二）聚合酶鏈?zhǔn)?/p>

2、反應(yīng)（PCR）常與其他技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用（三）單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)（SSCP; single strand conformation polymorphism）是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別來檢測(cè)點(diǎn)突變的方法，常與 PCR聯(lián)用, 稱PCR-SSCP PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻倪w移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在。（四）限制酶酶譜分析限制性片段長度多態(tài)性（RFLP； restrict fraction length polymorphinsm） （五）DNA序列測(cè)定是進(jìn)行基因突變檢測(cè)最直接、最準(zhǔn)確的方法，不僅可確定突變的位置，而且可確定突變的性質(zhì)。（六）DNA芯片技

3、術(shù)實(shí)際上是一種快速、敏感、高效、自動(dòng)化的核酸雜交技術(shù)基因診斷的基本方法特點(diǎn)：1:特異性強(qiáng)檢測(cè)特異性高達(dá)100%.早期診斷.靈敏度高檢測(cè)靈敏度達(dá)毫微微克（fg）水平.取樣方便任一有核細(xì)胞均可作為檢測(cè)樣品（一）基因突變的診斷1、點(diǎn)突變的診斷（1）已知的點(diǎn)突變可采用PCR/ASO （等位基因特異性寡核甘酸；allele specific oligonucleotide）探針法檢測(cè)。（2） 未知的突變PCR-SSCRDNA序列測(cè)定；DNA芯片技術(shù)；等2、少數(shù)核甘酸缺少或插入探針法3、大片段丟失或插入PCR; 多重PCR （因?yàn)槌Ｒ?guī)PCR擴(kuò)增2kb以上的片段比較困難）4、基因重排（染色體易位）PCR;

4、原位雜交（包括FISH）;5、基因擴(kuò)增Southern blot （先用酶切，再作 blot）（二）多態(tài)性分析1、RFLP分析（1）限制酶酶譜直接分析法（2） RFLP間接分析法2、DNA重復(fù)序列多態(tài)性分析（三）基因表達(dá)異常的診斷1、mRNA相對(duì)定量分析(1)斑點(diǎn)或狹縫雜交(2) RT-PCR2、mRNA絕對(duì)定量分析RT-PCR魔爭(zhēng)性PCR3、mRNA長度分析Northern blot(四)外源DNA檢測(cè)血清學(xué)等方法不夠靈敏或特異，考慮用核酸分子雜交或PCR等技術(shù)，應(yīng)用基因特異性探針或合成特異的寡核甘酸引物來檢測(cè)。第二節(jié)月中瘤的基因診斷一、月中瘤基因診斷的策略1、檢測(cè)月中瘤相關(guān)基因2、檢測(cè)月中

5、瘤相關(guān)病毒的基因3、檢測(cè)月中瘤標(biāo)志物基因或mRNA第二十章基因治療基因治療一般是指將限定的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入患者特定的靶細(xì)胞，以最終達(dá)到預(yù)防或改 變特殊疾病狀態(tài)為目的的治療方法?；蛑委煹闹饕呗曰蛑脫Q (gene replacemen城稱基因矯正 (gene correction)： 特定的目的 基因?qū)胩囟ǖ募?xì)胞，通過定位重組，讓導(dǎo)入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原 有的缺陷基因，不涉及基因組的任何改變?；蛱砑踊蚍Q基因增補(bǔ)(gene angmentation ：通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞 表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。基因干預(yù)(gene interference：采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或 者通過

6、破壞某個(gè)基因而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。基因置換或基因添加的必要條件對(duì)導(dǎo)入的基因及其產(chǎn)物有詳盡的了解外來基因能有效地導(dǎo)入靶細(xì)胞導(dǎo)入基因能在靶細(xì)胞中長期穩(wěn)定駐留導(dǎo)入基因能有適度水平的表達(dá)基因?qū)氲姆椒八幂d體對(duì)宿主細(xì)胞安全無害導(dǎo)入自殺基因一一細(xì)胞自殺效應(yīng)將自殺基因轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞中，該基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化 為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞 自殺”，清除月中瘤細(xì)胞。基因修飾一一改變細(xì)胞功能基因修飾月中瘤細(xì)胞的 疫苗”療法基因修飾TIL的過繼免疫方法免疫增強(qiáng)基因療法原位修飾月中瘤免疫原性的基因療法基因標(biāo)記(gene labeling)：基因標(biāo)記實(shí)驗(yàn)是基因治療的前奏，并不在于直

7、接治療疾病而是期望能夠提供有關(guān)正常細(xì)胞生物學(xué)和疾病病理方面的信 息?；蛑委熁旧仙婕叭交?qū)?administration)：把基因或把含有基因的載體導(dǎo)入機(jī)體。基因傳遞(delivery):基因從導(dǎo)入部位進(jìn)入靶細(xì)胞核。基因表達(dá)(expression：細(xì)胞中治療性基因產(chǎn)物的形成。理想的基因治療載體具備的性質(zhì)易于進(jìn)入靶細(xì)胞。在特異細(xì)胞或組織達(dá)到有規(guī)律、充分及持續(xù)的外源基因表達(dá)。外源基因應(yīng)含或整合于基因組活化區(qū)內(nèi)或能自主復(fù)制的構(gòu)件。整個(gè)過程應(yīng)安全有效并具有選擇性。易于大量生產(chǎn)?；蛑委熭d體的選擇（考慮因素）靶細(xì)胞或靶組織疾病類型期望是否持續(xù)或短暫表達(dá)所要求的基因表達(dá)水平體內(nèi)或回體基因治療安全性

8、：風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)比。病毒載體具備的條件攜帶外源基因并能包裝成病毒顆粒介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá)對(duì)機(jī)體不致病病毒載體類型重組型病毒載體：以完整的病毒基因組為改造對(duì)象，選擇性刪除病毒的某 些必需基因（早期基因、控制表達(dá)的基因），缺失的功能由互補(bǔ)細(xì)胞反式 提供；利用同源重組方法將適當(dāng)長度的外源基因插入病毒基因組的非必需 區(qū)，不改變病毒復(fù)制和包裝所需的順式元件。無病毒基因的病毒載體：由載體質(zhì)粒和輔助系統(tǒng)組成。載體質(zhì)粒：由外源 基因表達(dá)盒、病毒復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件及質(zhì)粒骨架組成； 輔 助系統(tǒng)：由病毒復(fù)制和包裝所必需的反式作用元件組成逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)點(diǎn)：高效地感染分裂的宿主細(xì)胞（100%）;在感染后，逆

9、轉(zhuǎn)錄病毒能夠 將前病毒基因組穩(wěn)定地整合到宿主基因組的隨機(jī)位點(diǎn)上；利用重組逆轉(zhuǎn)錄 病毒能將目的DNA傳遞給整個(gè)細(xì)胞群體；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可感染多種人 和動(dòng)物的細(xì)胞，宿主范圍非常廣；不產(chǎn)生任何有免疫原性的病毒蛋白， 對(duì) 宿主細(xì)胞無毒性作用，可建立細(xì)胞系長期持續(xù)表達(dá)外源基因。缺點(diǎn)：只能整合至分裂相的細(xì)胞；容量?。ú怀?10kb）；病毒滴度不高； 由于其隨機(jī)整合，有激活癌基因的潛在危險(xiǎn)。腺病毒載體優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率高、安全；宿主范圍廣，與細(xì)胞分裂無關(guān)；容量大，制備 較易，病毒滴度較高。缺點(diǎn):不能整合到染色體，表達(dá)時(shí)間短暫（1-6周）;具有免疫原性；反復(fù)治療效 率降低;缺陷病毒可與宿主基因組或其它病毒發(fā)生重組

10、，產(chǎn)生危險(xiǎn)系數(shù)高的 新病毒腺相關(guān)病毒優(yōu)點(diǎn):是非病原微生物，未發(fā)現(xiàn)野生型AAV與人類疾病有關(guān)；它既能感染分 裂細(xì)胞，又能感染非分裂細(xì)胞；宿主范圍廣，能感染多種宿主細(xì)胞；插入突變 的危險(xiǎn)性相當(dāng)?shù)?。缺點(diǎn)：只能包裝小于5kb的目的基因片段，相對(duì)轉(zhuǎn)基因能力受限；整合時(shí) 需要輔助病毒感染才能進(jìn)行復(fù)制，增加包裝的難度；很難大量生產(chǎn)。單純皰疹病毒載體優(yōu)點(diǎn)：HSV載體能攜帶30-50kb的外源基因，可在多種細(xì)胞中復(fù)制；能感 染分裂和非分裂細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞易感。缺點(diǎn)：病毒不能整合入宿主細(xì)胞染色體，只能短暫表達(dá)；對(duì)感染的細(xì)胞產(chǎn) 生毒性作用。基因治療的非病毒載體非病毒方法是依賴細(xì)胞機(jī)制將 DNA導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)而轉(zhuǎn)移至細(xì)胞

11、核。與病毒載體相比非病毒載體的優(yōu)點(diǎn)：對(duì)受轉(zhuǎn)移的DNA大小沒有限制；DNA 容易進(jìn)行操作，對(duì)于包裝與復(fù)制需要的病毒序列沒有特殊要求；比構(gòu)建的病毒載體安全，不可能誘發(fā)任何感染；免疫源性問題少。理想的非病毒DNA傳遞系統(tǒng)應(yīng)具備的性質(zhì)：已知結(jié)構(gòu)及成分在生物液體中，傳遞系統(tǒng)的穩(wěn)定性受到復(fù)合物成分的控制細(xì)胞攝取受細(xì)胞特異性漿膜受體的控制能迅速從內(nèi)容泡中釋放(依賴于 pH值)能有效地脫包膜并經(jīng)細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸 DNADNA的核攝取充分能達(dá)到所期望的持續(xù)表達(dá)核酶(ribozyme )RNA組成的酶可催化RNA切割和RNA剪接反應(yīng)。結(jié)構(gòu)：錘頭狀和發(fā)夾狀。具有催化RNA切割的核酶可作為基因表達(dá)和病毒復(fù)制的抑制劑，目前已

12、被開發(fā)用于基因治療。三鏈 DNA (triple-strand DNA )當(dāng)某一 DNA或RNA寡核甘酸與DNA高喋吟區(qū)結(jié)合時(shí)可形成三鏈。三鏈形成寡核甘酸(triple-forming oligonucleotide , TFO)能特異地結(jié)合在DNA大溝中，并與富含喋吟鏈上的堿基形成 Hoogsteen氫鍵。TFO與靶DNA的結(jié)合具有高度序列特異性，這是三鏈DNA的應(yīng)用基礎(chǔ)。TFO的作用機(jī)制：基因調(diào)控區(qū)形成三鏈 DNA后抑制基因轉(zhuǎn)錄基因治療的疾病遺傳病的基因治療在DNA水平明確其發(fā)病原因及機(jī)制必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳該基因的表達(dá)不需要精確調(diào)控該基因能在一種便于臨床操作的組織細(xì)胞中表達(dá)

13、并發(fā)揮其生理作用該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴(yán)重后果月中瘤基因治療基因干預(yù)技術(shù)：反義RNA; RNA干擾；反義基因自殺基因治療：免疫基因治療：細(xì)胞因子基因治療；MHC基因治療提高化療效果的輔助基因治療：藥物增敏；耐藥基因的相關(guān)治療聯(lián)合基因治療：自殺基因；免疫因子基因；抑癌基因；自殺基因與細(xì)胞因子基因；抑癌基因與免疫因子基因；病毒性疾病的基因治療誘導(dǎo)對(duì)病毒RNA的降解：抑制病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合：干擾病毒基因組的轉(zhuǎn)錄起始和調(diào)控：抑制病毒基因組的復(fù)制和蛋白質(zhì)合成：RNA干擾技術(shù)：基因治療的前景與問題基因治療中所用的各種啟動(dòng)子，在不同種類的體細(xì)胞中表達(dá)效率是不同的。基因治療研究中，體外基因轉(zhuǎn)移是一個(gè)重要的研究

14、領(lǐng)域， 人體細(xì)胞在體外進(jìn)行長期培養(yǎng)和繁殖，細(xì)胞的生物學(xué)改變是值得研究的問題。要有效和簡(jiǎn)便地將基因治療應(yīng)用于臨床，需要發(fā)展體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移方法。導(dǎo)入外源基因?qū)◇w的不利影響也是一個(gè)不容忽視的問題。第二十一章藥物相關(guān)的分子生物學(xué)研究 一、創(chuàng)新藥物在臨床治療中此前尚未應(yīng)用的藥物（包括新品種、新劑型、新用途、新作用機(jī)制等）。二、基于靶點(diǎn)和機(jī)制的藥物設(shè)計(jì)現(xiàn)代研究和開發(fā)創(chuàng)新藥物的基礎(chǔ)是尋找有效可行的干預(yù)靶點(diǎn)研發(fā)策略：在闡明疾病發(fā)生機(jī)制和獲得干預(yù)靶點(diǎn)的基礎(chǔ)上，再行合理的藥物設(shè)計(jì)（根據(jù)藥理學(xué)作用機(jī)制和構(gòu)效關(guān)系等篩選并確定先導(dǎo)化合物）。三、分子生物學(xué)研究促進(jìn)新藥的研究分子生物學(xué)技術(shù)促進(jìn)藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證。藥物作用

15、靶點(diǎn)：具有重要生理或病理功能，能夠與藥物相結(jié)合并產(chǎn)生藥理作 用的生物大分子及其特定的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)。一種疾病可有多個(gè)藥物作用的靶點(diǎn)某一靶點(diǎn)也可以是多種疾病共同的治療靶點(diǎn)（一）微陣列技術(shù)在大規(guī)模篩選和發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)中的應(yīng)用1、核酸微陣列2、蛋白質(zhì)微陣列3、組織和細(xì)胞微陣列組織芯片技術(shù)：在原位針對(duì)不同樣本中的同一實(shí)驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。（二）蛋白質(zhì)組學(xué)研究可提供藥物干預(yù)新靶點(diǎn)1、疾病相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)研究2、耐藥病原體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究3、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和途徑的蛋白質(zhì)組學(xué)研究（三）生物信息學(xué)在挖掘和預(yù)測(cè)藥物干預(yù)新靶點(diǎn)中的作用生物信息學(xué)：以大量的生物信息，尤其是人類基因組的大量原始數(shù)據(jù)為對(duì)象， 應(yīng)用計(jì)算機(jī)技術(shù)、結(jié)合其它學(xué)科知識(shí)，對(duì)原始信息進(jìn)行整理、計(jì)算和開發(fā)利用。（四）RNNF涉技術(shù)用于發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證新靶點(diǎn)1、反義寡核甘酸2、RNAF擾四、組合化學(xué)和高通量篩選發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物1、先導(dǎo)化合物或模型化合物的發(fā)掘2、先導(dǎo)化合物優(yōu)化3、候選藥物的藥理學(xué)和安全性評(píng)價(jià)4、高通量篩選技術(shù)應(yīng)用是藥物大規(guī)模篩選的趨勢(shì)第三節(jié)基因藥物將具有治療意義的DNA重組入真核表達(dá)載體，直接轉(zhuǎn)移到人體細(xì)胞，在體內(nèi)表達(dá) 出具有治療作用的多肽和蛋白質(zhì)；或應(yīng)用直接作用于細(xì)胞內(nèi)的DNM RNA抑制基 因復(fù)制和表達(dá)的核酸片段或基人工合成的類似物，以及對(duì)