南京大學(xué)分子生物學(xué)第22講

1、三、基因表達(dá)的不同水平：豐富mRNA和稀少mRNA（一） mRNA復(fù)雜度的測(cè)定：RNA驅(qū)動(dòng)的動(dòng)力學(xué)雜交試驗(yàn)分析1，基本步驟（圖922， mRNA復(fù)雜長(zhǎng)度的計(jì)算13，例子：雞輸卵管mRNA驅(qū)動(dòng)的動(dòng)力學(xué)雜交試驗(yàn)（1）對(duì)照：雞卵清蛋白mRNA（2）雞輸卵管中各mRNA組分的復(fù)雜長(zhǎng)度2（二）mRNA豐富度的計(jì)算1，計(jì)算公式2，豐富mRNA和稀少mRNA3四、持家基因和奢侈基因（一）確定組織特異活躍基因數(shù)目的方法1，加性飽和雜交試驗(yàn) 4（1）通過飽和雜交試驗(yàn)分別確定2種不同組織中各自活躍基因表達(dá)的數(shù)目（2）通過飽和雜交試驗(yàn)確定2種組織中活躍基因表達(dá)的總數(shù)（3）確定2種組織各自特異表達(dá)及共同表達(dá)的基因 5

2、2，另一種測(cè)定不同組織中活性基因重疊情況的方法（1）過量的第一種組織mRNA與非重復(fù)DNA的雜交試驗(yàn)（2）過量的第二種組織mRNA與mDNA的雜交（3）過量的第二種組織mRNA與無效DNA的雜交6（二）持家基因和奢侈基因 1，持家基因（house keeping genes)2，奢侈基因 (luxury genes)3，持家基因和奢侈基因的表達(dá)調(diào)控7第二節(jié)DNA水平的調(diào)控8 DNA水平的調(diào)控：通過基因丟失、擴(kuò)增、重排和移位等方式，從根本上改變細(xì)胞的基因組，消除或變換某些基因并改變其活性。9一、基因丟失（一）染色體缺失與基因活性去除 （二）馬蛔蟲的染色體丟失現(xiàn)象 101，染色體特點(diǎn) 2，不同發(fā)育

3、階段的細(xì)胞分裂特點(diǎn)（1）發(fā)育早期細(xì)胞分裂（2）發(fā)育到一定階段11二、基因擴(kuò)增基因擴(kuò)增：是指某些基因的拷貝數(shù)專一性大量增加的現(xiàn)象，它使得細(xì)胞在短期內(nèi)產(chǎn)生大量的基因產(chǎn)物以滿足生長(zhǎng)發(fā)育的需要。121，非洲爪蟾卵母細(xì)胞rRNA基因的擴(kuò)增（1）體細(xì)胞的rRNA基因 （rDNA）（2）卵母細(xì)胞的rDNA （3）rDNA擴(kuò)增的可能機(jī)制132，果蠅卵巢顆粒細(xì)胞卵殼蛋白基因的擴(kuò)增（1）卵母細(xì)胞和營養(yǎng)細(xì)胞（2）營養(yǎng)細(xì)胞卵殼蛋白的擴(kuò)增143，二氨葉氫葉酸還原酶基因擴(kuò)增的誘導(dǎo) （1） 氨甲喋呤的作用（2）穩(wěn)定的抗氨甲喋呤細(xì)胞株（3）不穩(wěn)定的抗氨甲喋呤細(xì)胞株（4）雙小染色體形成的機(jī)制（圖95） 15三、基因重排一個(gè)基因

4、可以通過從遠(yuǎn)離其啟動(dòng)子的地方移到距它很近的位點(diǎn)而被啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，這種方式稱基因重排16（一）基因重排與啤酒酵母的接合型互變1，啤酒酵母的接合型（1）型 （2）a型172，啤酒酵母的接合型互變（1）接合型互變現(xiàn)象（2）接合型互變的匣子模型（圖96） A，MAT活躍匣子決定接合型類型B，沉寂匣子C，接合型互變183，酵母接合型相關(guān)匣子（1）序列組成（表9-1）HML 、MAT 、MATa均由W、X、Y、Z1、Z2五部分組成HMRa由X、Y、Z1組成Y區(qū)域19（2）沉寂匣子的阻遏蛋白及其結(jié)合位點(diǎn)阻遏蛋白基因：sir1，sir2，sir3，sir4阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn)：位于啟動(dòng)子上游1500bp以外的E區(qū)2

5、0（3）沉寂匣子不活躍轉(zhuǎn)錄的原因兩種沉寂匣子沉寂匣子具有相同的阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)，活躍匣子沒有沉寂匣子和活躍匣子的DNA酶I超敏感位點(diǎn)分布不同21（二）哺乳動(dòng)物免疫球蛋白的表達(dá)與基因重排 1，輕鏈（1）種類輕鏈有兩種：， （2）結(jié)構(gòu) 可變區(qū)（V區(qū)），連接區(qū) （J區(qū)），恒定區(qū)（C區(qū)）22（3）基因及基因重排A，輕鏈的V，C，J（如V，C，J）基因在不產(chǎn)生抗體的細(xì)胞中相距很遠(yuǎn)，在產(chǎn)生抗體的細(xì)胞中被排列組合重排在一起，V和C之間是較短的J片段。輕鏈V區(qū)是由V基因片段和J基因片段共同編碼的23B， 鏈的形成輕鏈基因片段的數(shù)目與其他免疫球蛋白相比較少。鼠類中已發(fā)現(xiàn)有3個(gè)V和4個(gè) J-C 片斷，其中J4是假

6、基因2425B細(xì)胞分化過程中，V 基因之一和相連的一個(gè)J基因片段重組，形成一個(gè)V -J重組體重排的基因被轉(zhuǎn)錄成mRNA初級(jí)產(chǎn)物，經(jīng)剪接形成成熟的mRNA，最后翻譯成蛋白2627C， 鏈的形成鏈基因片段有較多的V基因（350個(gè)），V在染色體上與C有一定距離。J有5個(gè)基因，在V和C之間，靠近C，其中一個(gè)是假基因2829淋巴細(xì)胞分化時(shí)，DNA重排，任意一個(gè)V基因與一個(gè)J基因相連，可以產(chǎn)生約1400種鏈可變區(qū)30312，重鏈（1）種類 ，任意一種重鏈能與任意一種輕鏈相結(jié)合32（2）結(jié)構(gòu) 可變區(qū)（V區(qū)），歧化區(qū)（D區(qū)），連接區(qū)（J區(qū)） ，恒定區(qū) （C區(qū)）33（3）基因及基因重排重鏈的V區(qū)也是由V和J基因

7、片段編碼，附加的多樣性由D基因片段提供。D基因片段的密碼子的數(shù)目和堿基對(duì)的序列是高度可變的34已經(jīng)被鑒定了100200個(gè)VH片段（可能有1000種），30個(gè)D片段，6個(gè)功能性的J基因片段和3個(gè)假J基因片段。3536所有的恒定區(qū)基因都位于J基因片段下游，鼠的IgM、IgE、IgD和IgA各有一個(gè)恒定區(qū)基因（、和），4種IgG的基因?yàn)?、 2a、 2b和 33738C基因的每個(gè)機(jī)構(gòu)域（如C的C1、C2等）的外元被內(nèi)元隔開。 基因還有一個(gè)編碼聯(lián)合區(qū)的外元H（hinge）基因。所有基因都有一個(gè)或多個(gè)參與編碼膜結(jié)合免疫球蛋白M的外元3940每個(gè)恒定區(qū)基因（C 除外）的上游均有一個(gè)轉(zhuǎn)換序列S（swithc

8、h sequence, S）， C 與C 共享一個(gè)轉(zhuǎn)換序列。這樣任何一個(gè)C基因片段都能與V-D-J基因發(fā)生重組41423，免疫球蛋白類型的轉(zhuǎn)換（1）抗體類型的轉(zhuǎn)換現(xiàn)象免疫反應(yīng)的成熟過程中，初次免疫反應(yīng)主要產(chǎn)生IgM，再次反應(yīng)主要產(chǎn)生IgG4344（2）抗體類型的轉(zhuǎn)換的機(jī)制所有種類的免疫球蛋白都用同一系列的可變區(qū)基因。當(dāng)一個(gè)成熟的抗體形成細(xì)胞轉(zhuǎn)變抗體類型時(shí)，只是重鏈恒定區(qū)發(fā)生變化45有時(shí)一段較長(zhǎng)的DNA被轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生一個(gè)初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，通過剪接產(chǎn)生不同的mRNA，最終翻譯產(chǎn)生VH區(qū)相同，恒定區(qū)不同的抗體4647更常見的情況是，轉(zhuǎn)換序列S介導(dǎo)同源重組，通過去除環(huán)化的DNA，導(dǎo)致另一個(gè)C區(qū)靠近VD

9、J基因。該過程可能和染色體間的交換有關(guān)4849二、染色體水平上的基因活化調(diào)節(jié)（一）染色質(zhì)的狀態(tài)1，非活性染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)以30nm的間期核染色質(zhì)纖維為基礎(chǔ)，壓縮4050倍包裝成螺線管狀態(tài)502，活性染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)30nm的染色質(zhì)纖維開啟為可轉(zhuǎn)錄的伸展染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，成為11nm直徑的單核小體伸展?fàn)顟B(tài)。細(xì)胞中染色質(zhì)的非活性和活性狀態(tài)是可以互變的，并且存在兩者間的過渡狀態(tài)51（二）開放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成核小體結(jié)構(gòu)的伸展甚至缺失可以由下列因素造成：521，DNA結(jié)構(gòu)的影響富含GC達(dá)到15次重復(fù)的Z-DNA的存在時(shí)可導(dǎo)致核心組蛋白與DNA的親和力下降DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶可以持續(xù)地調(diào)整DNA的超螺旋狀態(tài)，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄

10、532，組蛋白的修飾（1）H1組蛋白的磷酸化有絲分裂的染色體中，HI組蛋白高度磷酸化，可達(dá)到每個(gè)分子有56個(gè)絲氨酸磷酸化H1組蛋白磷酸化導(dǎo)致其對(duì)DNA的親和力下降54（2）核心組蛋白的修飾A，核心組蛋白的乙酰基化 核心組蛋白最主要的修飾方式是其Lys殘基上的 -氨基乙?；?。轉(zhuǎn)乙?；笍囊阴］o酶A將乙?；D(zhuǎn)移到Lys殘基上，并中和了一個(gè)正電荷，減弱了蛋白與DNA的靜電吸引力，并降低相鄰核小體之間的聚集55H3、H4組蛋白乙酰基化使核小體間的DNA產(chǎn)生較多的負(fù)超螺旋而容易從核小體上分離，對(duì)核酸酶的敏感性增高，并有利于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合56B，H2A組蛋白的泛素化泛素：76個(gè)Aa的酸性蛋白質(zhì)，含許

11、多Glu和Asp殘基泛素和u-H2A形成異肽鍵，兩者酸堿中和 u-H2A所占比例：510%，主要位于活躍基因序列的核小體中573，其他DNA結(jié)合蛋白的作用（1）啟動(dòng)子上游調(diào)控因子蛋白質(zhì)調(diào)控因子和組蛋白及DNA形成三維復(fù)合物，可以改變核小體的結(jié)構(gòu)，甚至使特定區(qū)域內(nèi)無核小體存在。58例如：蛋白質(zhì)因子糖皮質(zhì)激素受體（GR）、核因子1（NF1）可與啟動(dòng)子區(qū)的核糖體結(jié)合促進(jìn)轉(zhuǎn)錄SP1可阻止H1組蛋白的阻遏作用TATA盒結(jié)合蛋白（TBP）可防止核小體阻遏啟動(dòng)子的功能轉(zhuǎn)錄因子GAGA的結(jié)合導(dǎo)致核小體解聚59（2）HMG結(jié)構(gòu)域蛋白HMG（high-mobility group）：高遷移率組蛋白質(zhì)，因在聚丙烯酰

12、胺電泳中遷移率很高而被命名HMG 14、HMG17在核小體上有兩個(gè)高親和力的結(jié)合位點(diǎn)。HMG蛋白質(zhì)與核小體的結(jié)合是產(chǎn)生活性染色質(zhì)的重要過程60（三）活性染色質(zhì)的特征1，DNA酶I敏感位點(diǎn)（1）活躍基因的DNA酶I優(yōu)先敏感性用DNA酶I處理脊椎動(dòng)物的基因組，活躍表達(dá)的基因優(yōu)先降解61（2）活躍基因DNA酶I優(yōu)先敏感性區(qū)域的分布 轉(zhuǎn)錄區(qū)的DNA酶I優(yōu)先敏感性較高基因的兩側(cè)DNA區(qū)段也有DNA酶I優(yōu)先敏感性 62（3）造成DNA酶I優(yōu)先敏感性的原因 HMG蛋白的存在可以使含有核小體的染色質(zhì)對(duì)DNA酶IHMG蛋白不是造成染色質(zhì)對(duì)DNA酶I的唯一原因 HMG蛋白作用的最小單位是核小體核心顆粒63（4）DNA酶I優(yōu)先敏感性與基因轉(zhuǎn)錄的時(shí)間關(guān)系 DNA酶I優(yōu)先敏感性是與轉(zhuǎn)錄過程是相對(duì)獨(dú)立的，在活性基因轉(zhuǎn)錄前后 均存在DNA酶I優(yōu)先敏感性是轉(zhuǎn)錄的必要但非充分條件