DNA的復(fù)制幻燈片

1、A gene participates in three major activities:1. Information Storing2. Replication3. Accumulating mutations第四章 DNA的復(fù)制Information StoringAccumulating mutationsReplicationDNA的復(fù)制（replication）是指以原來的DNA分子為模板合成出相同的DNA分子的過程。遺傳信息通過親代DNA分子的復(fù)制傳遞給子代。DNA復(fù)制在保持生物物種遺傳的穩(wěn)定性方面起著重要的作用。從Watson和Crick建立DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型開始，關(guān)于DN

2、A復(fù)制的輪廓就已經(jīng)誕生。“It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.”“Now our model for deoxyribonucleic acid is, in effect, a pair of templates, each of which is complementary to the other. We imagine tha

3、t prior to duplication the hydrogen bonds are broken, and the two chains unwind and separate. Each chain then acts as a template for the formation onto itself of a new companion chain, so that eventually we shall have two pairs of chains, where we only had one before. Moreover, the sequence of the p

4、airs of bases will have been duplicated exactly. DNA復(fù)制和細(xì)胞周期的關(guān)系：DNA復(fù)制是細(xì)胞周期的決定因素，DNA復(fù)制完成以前，細(xì)胞不會(huì)發(fā)生分裂。DNA復(fù)制的完成是細(xì)胞分裂的觸發(fā)點(diǎn)，復(fù)制后的基因組被平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去。細(xì)胞周期調(diào)控基因控制DNA的復(fù)制并觸發(fā)細(xì)胞分裂。第一節(jié) DNA的復(fù)制概況 一、DNA的復(fù)制機(jī)制 DNA分子的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則是DNA分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，這個(gè)原則在DNA的復(fù)制過程中也起著重要的指導(dǎo)作用。 理論上，DNA的復(fù)制可以采取半保留復(fù)制、全保留復(fù)制和混合復(fù)制（散布式）三種方式。半保留復(fù)制機(jī)制的證明Meselson-Stah

5、l實(shí)驗(yàn)1958年，Matthew Meselson和Franklin Stahl設(shè)計(jì)了一個(gè)很巧妙的實(shí)驗(yàn)，證明了DNA復(fù)制采取半保留復(fù)制機(jī)制。 兩個(gè)子代DNA分子通過細(xì)胞分裂平均分配到兩個(gè)子代細(xì)胞中。由于每個(gè)子代細(xì)胞中只有一半的遺傳物質(zhì)是來自親代細(xì)胞，而另一半是新合成的，這種復(fù)制方式被稱為半保留復(fù)制（semiconservative replication）。半保留復(fù)制是雙鏈DNA普遍采用的復(fù)制機(jī)制。即使是單鏈DNA分子，在其復(fù)制過程中也要先形成雙鏈的復(fù)制形式。半保留復(fù)制機(jī)制說明了DNA在代謝上的穩(wěn)定性。半保留復(fù)制作為一個(gè)復(fù)雜的過程，需要多種細(xì)胞組分的參與。同時(shí)為保持遺傳的穩(wěn)定性，要有高度的忠實(shí)

6、性。二、DNA復(fù)制的起點(diǎn)、方向和方式 DNA復(fù)制的起點(diǎn) 原核生物DNA的復(fù)制是在DNA分子的特定位點(diǎn)開始的，這一位點(diǎn)稱為復(fù)制起點(diǎn)，常用ori來表示。 原核生物的染色體只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制從起點(diǎn)開始，進(jìn)行到終點(diǎn)結(jié)束，完成整個(gè)染色體DNA分子的復(fù)制。將一段來自起點(diǎn)的DNA序列與缺失起點(diǎn)的DNA分子克隆到一起，如果來自起點(diǎn)的DNA片段包括一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)所必須具備的序列，它將支持與其連接的任何DNA序列的復(fù)制。由此可以鑒定起點(diǎn)的DNA序列。細(xì)菌、酵母以及葉綠體、線粒體的DNA復(fù)制起點(diǎn)現(xiàn)均已經(jīng)被克隆，其核酸序列也被確定了，它們的共同特點(diǎn)是富含A-T序列。 真核生物DNA的復(fù)制也是從特定的位點(diǎn)開始的，以雙

7、向延伸的方式進(jìn)行，直到終點(diǎn)為止。 真核生物DNA的復(fù)制是從多個(gè)位點(diǎn)開始 的，所以真核生物的DNA分子上有多個(gè)復(fù)制單位同時(shí)進(jìn)行DNA的復(fù)制。 復(fù)制子（replicon） 復(fù)制子是基因組中能夠獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位。每個(gè)復(fù)制子都有控制復(fù)制開始的復(fù)制起點(diǎn)（origin）以及終止復(fù)制的終點(diǎn)（terminus）。任何起點(diǎn)和終點(diǎn)之間的序列都作為復(fù)制子的一部分參與復(fù)制。 在一個(gè)細(xì)胞周期中，每個(gè)復(fù)制子只啟動(dòng)一次。 原核生物細(xì)胞的基因組只有一個(gè)復(fù)制子。細(xì)菌內(nèi)的質(zhì)粒是一個(gè)自主復(fù)制的環(huán)狀DNA基因組，構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的復(fù)制子。真核生物的DNA分子上有多個(gè)復(fù)制子。參與復(fù)制的DNA分子上有兩個(gè)區(qū)域，未復(fù)制的區(qū)域由親代DNA組成

8、，已復(fù)制的區(qū)域由兩條子代鏈組成。復(fù)制正在發(fā)生的位點(diǎn)叫做復(fù)制叉（replication fork）或生長(zhǎng)點(diǎn)（growing point）。DNA復(fù)制的方向復(fù)制可單向進(jìn)行，也可以雙向進(jìn)行，這取決于在起點(diǎn)有一個(gè)還是兩個(gè)復(fù)制叉。DNA復(fù)制的方式大多數(shù)生物體內(nèi)DNA的復(fù)制都以雙向等速方式進(jìn)行。但枯草桿菌兩個(gè)復(fù)制叉的移動(dòng)是不對(duì)稱的。質(zhì)粒ColEI的復(fù)制完全是單向進(jìn)行的。大多數(shù)生物體內(nèi)的DNA復(fù)制都以對(duì)稱方式進(jìn)行，即DNA分子的兩條鏈同時(shí)復(fù)制。但也有在一定時(shí)期內(nèi)DNA只復(fù)制一條鏈的情況。例如線粒體的D環(huán)復(fù)制和一些細(xì)菌噬菌體的滾環(huán)復(fù)制方式。 三、DNA聚合酶與DNA聚合反應(yīng) DNA的復(fù)制是由DNA聚合酶（DN

9、A polymerase）負(fù)責(zé)完成的，它具有按照模板的指令在模板鏈上催化新DNA鏈合成的活性。 DNA聚合酶是一種模板指導(dǎo)的聚合酶，產(chǎn)物DNA與模板的堿基組成相同。說明在DNA聚合酶的作用下，DNA的兩條鏈都能復(fù)制。 在適量DNA和鎂離子存在下，DNA聚合酶催化4種脫氧核糖核苷酸合成DNA，每次在DNA的3-OH末端加入一個(gè)核苷酸使DNA鏈由5向3方向延長(zhǎng)，同時(shí)釋放無(wú)機(jī)焦磷酸。四、復(fù)制的基本過程DNA的復(fù)制包括起始、延伸和終止三個(gè)步驟。復(fù)制調(diào)控主要發(fā)生在起始階段，復(fù)制子增殖依賴于起始過程起點(diǎn)處發(fā)生的相互作用。一般復(fù)制開始后，就會(huì)進(jìn)行到底，直到整個(gè)基因組都復(fù)制完畢。五、DNA復(fù)制的半不連續(xù)性當(dāng)復(fù)

10、制叉前進(jìn)時(shí)，在兩個(gè)暴露的親鏈上都要進(jìn)行子鏈的合成。但是DNA分子的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，而且所有已知的DNA聚合酶的合成方向都是53，即新生鏈的方向只能是53。 DNA在復(fù)制時(shí)如何同時(shí)作為模板合成其互補(bǔ)鏈?In 1968, Reiji Okazaki concluded that DNA replication in E. coli (and in other organism) is semidiscontinuous. One strand (leading strand)is replicated continuously in the direction of the movement

11、of the replicating fork; the other (lagging strand)is replicated discontinuously as 1-2 kb Okazaki Fragments in the opposite direction. This allows both strands to be replicated in the 5-3-direction.第二節(jié) DNA的復(fù)制體系一、復(fù)制體系的鑒定 人們一般通過突變體表型的變化來考察基因的功能，如果某個(gè)基因突變導(dǎo)致細(xì)胞DNA不能復(fù)制，就可以說這個(gè)基因與DNA復(fù)制有關(guān)。 利用大腸桿菌的溫度敏感突變體已經(jīng)鑒定

12、了一系列的dna基因座。對(duì)參與DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)進(jìn)行識(shí)別和鑒定的方法有三種：純化、突變、重建。體外互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)是鑒定復(fù)制體系組分的重要手段。二、DNA聚合酶 1 大腸桿菌的DNA聚合酶 大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了三種DNA聚合酶：DNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶。 DNA聚合酶參與損傷DNA的修復(fù)，并在半保留復(fù)制中起切除RNA引物的作用。 DNA聚合酶也參與修復(fù)。 DNA聚合酶是一個(gè)多亞基的蛋白質(zhì)，是合成DNA新鏈的主要復(fù)制酶。DNA聚合酶 大腸桿菌DNA聚合酶是第一個(gè)被鑒定的DNA聚合酶，它是由polA基因編碼的103 kDa的單鏈多肽。 當(dāng)?shù)孜锖湍０宕嬖跁r(shí)， DNA聚合酶可使脫氧核糖核苷酸依次加

13、到具有3OH末端的多核苷酸鏈上。它的催化需要引物鏈（DNA或RNA）的存在。DNA聚合酶是一個(gè)多功能酶，它可以催化以下的反應(yīng)：1、DNA鏈沿5 3方向的延長(zhǎng)（DNA聚合酶活性）。2、從3端水解DNA鏈（3 5外切核酸酶活性）。3、從5端水解DNA鏈（ 5 3 外切核酸酶活性）。 用蛋白水解酶將DNA聚合酶作有限水解，可得到分子量為68 kDa和36 Kda的兩個(gè)片段。 大片段（68KDa，也叫Klenow片段） 在體外它可以催化合成反應(yīng)。 Klenow片段C端的2/3片段具有聚合酶活性，而N端的1/3片段具有35外切核酸酶活性。 兩個(gè)活性位點(diǎn)的距離為3 nm，表明堿基的加入和去除功能在空間上是

14、分開的。 小片段（35 KDa） 有53外切核酸酶活性，可以切除少的核苷酸。 該酶片段在切除由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體中起重要作用。 DNA的半不連續(xù)合成中，崗崎片段5端RNA引物的切除可能也依賴于該外切酶活性。 小片段的外切酶活性和大片段的聚合校對(duì)功能協(xié)同作用，使DNA聚合酶具有從切口處起始復(fù)制的獨(dú)特功能。 在雙鏈DNA的磷酸二酯鍵斷裂（nick）處，DNA聚合酶可延伸3末端，合成新的DNA片段后，置換雙螺旋中已有的同源鏈（切口移位）。體外的切口移位（nick translation）是實(shí)現(xiàn)在DNA分子上引入放射性標(biāo)記核苷酸的重要技術(shù)。DNA聚合酶 DNA聚合酶是一條分子量為120,00

15、0的多肽鏈。這個(gè)酶的活性很低，只有DNA聚合酶的5。 DNA聚合酶也以4種脫氧核糖核苷酸為底物，從5-3方向合成DNA。 DNA聚合酶具有3-5外切核酸酶活性，但無(wú)5-3外切酶活性。 DNA聚合酶在DNA的修復(fù)中起一定作用。DNA聚合酶 DNA聚合酶是真正負(fù)責(zé)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)合成DNA的復(fù)制酶。 DNA聚合酶是多亞基組成的蛋白質(zhì)。 DNA聚合酶全酶由、和10種不同的 亞基組成。 DNA聚合酶至少含有3種重要的酶活性。 即53DNA聚合酶活性、35外切核酸酶活性和依賴DNA的ATP酶活性。 DNA聚合酶不具有53外切核酸酶活性。 DNA聚合酶全酶在細(xì)胞中的含量很少，在每個(gè)細(xì)胞中只有1020個(gè)拷貝的

16、全酶（holoenzyme）。DNA聚合酶含有以下4個(gè)不同的功能組分：1）核心聚合酶（core polymerase）核心聚合酶由、三種亞基組成。亞基具有5-3方向合成DNA的催化活性。亞基具有3 -5外切核酸酶的校對(duì)功能，控制復(fù)制的忠實(shí)性。 亞基與亞基形成一個(gè)緊密的1：1復(fù)合物，協(xié)同發(fā)揮作用。亞基促進(jìn)亞基的作用。2）二聚體 亞基是以二聚體的形式存在的。 二聚體是環(huán)狀的，環(huán)繞著DNA并在DNA自由滑動(dòng)，構(gòu)成一個(gè)滑動(dòng)鉗。 滑動(dòng)鉗可以把全酶束縛在模板DNA上，從而保證高度的進(jìn)行性。鉗的存在對(duì)于大腸桿菌的高效復(fù)制是十分必要的。3）復(fù)合物復(fù)合物含有5種不同的亞基，形成一種化學(xué)計(jì)量為21111的結(jié)構(gòu)。復(fù)

17、合物是滑動(dòng)鉗的載體，它可以幫助滑動(dòng)鉗結(jié)合到DNA上。復(fù)合物有依賴DNA的ATP酶活性。二聚體自己并不能組裝到DNA上，它是通過復(fù)合物與ATP協(xié)同作用催化ATP的水解而組裝到DNA上的。復(fù)合物是一個(gè)不對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，它們相對(duì)兩個(gè)核心聚合酶不對(duì)稱分布使全酶具有不對(duì)稱結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致在全酶上兩個(gè)核心聚合酶功能上的不對(duì)稱性。兩個(gè)聚合酶功能上的不對(duì)稱性將使DNA兩條鏈合成表現(xiàn)出不同的性質(zhì)。4）二聚體 連接蛋白（2）可結(jié)合兩個(gè)核心酶分子和一個(gè)復(fù)合物。 亞基是一個(gè)依賴于DNA的ATP酶， 二聚體可結(jié)合兩個(gè)核心酶，每個(gè)亞基結(jié)合一個(gè)核心酶。 在一個(gè)分子結(jié)構(gòu)中存在兩個(gè)聚合酶表明復(fù)制性的聚合酶成對(duì)起作用，協(xié)同復(fù)制雙螺旋DNA

18、的兩條鏈。DNA聚合酶全酶的功能是復(fù)制大腸桿菌的染色體。DNA聚合酶與DNA聚合酶的不同之處： DNA聚合酶具有多亞基的結(jié)構(gòu)。 聚合反應(yīng)需要ATP的存在。 反應(yīng)有很高的速度和高度的進(jìn)行性。 2 DNA復(fù)制的忠實(shí)性復(fù)制過程的忠實(shí)性是保證生物體遺傳信息準(zhǔn)確傳遞的一個(gè)必要條件，它取決于堿基配對(duì)的專一性。DNA聚合酶可以通過兩種方式提高互補(bǔ)堿基選擇的專一性。第一，通過專一性識(shí)別使即將加入的堿基與模板的堿基嚴(yán)格互補(bǔ)，這種方式用來控制合成前的錯(cuò)誤。第二，當(dāng)發(fā)現(xiàn)存在著錯(cuò)配堿基時(shí)，可切除新加入的堿基，這種方式叫校對(duì)控制。兩種方式既可單獨(dú)起作用，也可共同起作用?？梢?，復(fù)制過程中堿基配對(duì)受雙重核對(duì)作用控制：聚合酶

19、的選擇作用和35外切核酸酶的校正（proofreading）作用。不同的聚合酶以不同的方式處理聚合與校對(duì)的關(guān)系。DNA聚合酶在復(fù)制過程中造成的錯(cuò)誤除了不正確配對(duì)造成的核苷酸取代外，還包括由于插入或缺失額外的核苷酸造成的框架移位。 3 其他生物的聚合酶 噬菌體也編碼DNA聚合酶，它們是T4、T5、T7、SPIO1。這些酶都有5-3合成酶活性和3-5外切校正活性。 真核生物中發(fā)現(xiàn)了5種不同的DNA聚合酶，分別為、。 、位于細(xì)胞核中，而是線粒體酶。 4 DNA聚合酶的引物DNA聚合酶的一個(gè)共同特征是它們只能催化脫氧核糖核苷酸加到已有核酸鏈的游離3OH上，而不能從游離核苷酸起始DNA鏈的合成。DNA聚

20、合酶需要引物來提供3OH末端，然后在其上加入核苷酸來延伸DNA鏈。通常細(xì)胞先在模板上合成一段RNA序列，然后通過DNA聚合酶延伸RNA鏈的3OH。The first line of evidence supporting RNA priming was the finding that replication of M13 phage DNA by an E. coli extract is inhibited by the antibiotic rifampicin. This is a surprise because rifampicin inhibits E. coli RNA pol

21、ymerase, not DNA polymerase. The explanation is that M13 uses the E. coli RNA polymerase for its DNA synthesis.Perhaps the best evidence for RNA priming was the discovery that DNase cannot completely destroy Okazaki fragments. It leaves little pieces of RNA 10-12 bases long.In 1985, Okazakis group f

22、ound that the intact primers are really about 10-12 bases long. These workers used mutant bacteria that lacked ribonuclease H or the nuclease activity of DNA polymerase I or both. 5 DNA聚合酶催化的分子機(jī)制 來源于病毒、原核生物和真核生物的聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶甚至RNA聚合酶的聚合酶區(qū)域都有一個(gè)類似手指、手掌和拇指的基本結(jié)構(gòu)，存在相似的折疊結(jié)構(gòu)。通過晶體結(jié)構(gòu)和模型研究發(fā)現(xiàn)， 手指區(qū)域可與未復(fù)制的單鏈模板相互作用，同時(shí)手指區(qū)域的一部分也參與結(jié)合進(jìn)入底物dNTP。 拇指亞區(qū)可與模板引物DNA雙螺旋相互作用。 聚合酶通過保守的氨基酸殘基與引物模板復(fù)合物相互作用使引物的3末端定位在手掌和手指的會(huì)合點(diǎn)，并與dNTP相對(duì)。研究還發(fā)現(xiàn)，dNTP的進(jìn)入伴隨著兩個(gè)Mg2離子的作用，由此提出了核苷酸加入（聚合）反應(yīng)的雙金屬離子機(jī)制（two metal-ion mechanism)。核苷酸的摻入是受模板指導(dǎo)的，所以DNA聚合酶在每個(gè)催化循環(huán)中都要改變它的核苷酸