實驗四同工酶分析

1、實驗四 過氧化物同工酶分析掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術(shù)的原理和操作方法。掌握PAGE法分離過氧化物同工酶的原理和方法?！緦嶒災康摹?【實驗原理】聚丙烯酰胺凝膠電泳1.電泳概念 帶電粒子在電場中向與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。如：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管電泳等。+-+-2【實驗原理】聚丙烯酰胺凝膠電泳2.聚丙烯酰胺凝膠電泳由單體丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在加速劑 N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）和催化劑過硫酸銨（AP）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamid

2、e gel electrophoresis，簡稱PAGE)3【實驗原理】聚丙烯酰胺凝膠電泳4【實驗原理】聚丙烯酰胺凝膠電泳3.凝膠性能與總濃度及交聯(lián)度的有關(guān)系 T%（ACR和BIS的濃度）=（a + b ）/m 100 C%（交聯(lián)劑百分比）=b/ （a + b ）100 其中：a為ACR克數(shù)，b為BIS克數(shù)，M為緩沖液體積4.凝膠濃度與孔徑的關(guān)系 T值濃度大，孔徑小，移動顆粒穿過網(wǎng)孔阻力大。5【實驗原理】聚丙烯酰胺凝膠電泳6【實驗原理】過氧化物同工酶分析1.同工酶 凡能催化同一種化學反應(yīng)，但其分子結(jié)構(gòu)和帶電性質(zhì)不同的一組酶稱同工酶。 植物組織中的同工酶是基因表達的產(chǎn)物。在研究植物基因調(diào)控與生長

3、發(fā)育、與環(huán)境條件的關(guān)系，以及許多生理生化和遺傳問題時，常常需要分析同工酶譜的差異。7【實驗原理】過氧化物同工酶分析2.過氧化物同工酶 植物體內(nèi)常見的氧化酶。植物體內(nèi)許多生理代謝過程常與它的活性及其同工酶的種類有關(guān)。 利用過氧化物酶能催化雙氧水把聯(lián)苯胺氧化成藍色或棕褐色產(chǎn)物的原理，將經(jīng)過電泳后的凝膠置于有雙氧水及聯(lián)苯胺的溶液染色，出現(xiàn)藍色或棕褐色產(chǎn)物的部位即為過氧化物同工酶在凝膠中存在的位置。8【儀器和試劑】實驗儀器1.電子天平、垂直電泳槽、電泳儀等。實驗材料和試劑A液：30%Acr-0.8%BisB液：Tris + EDTAC液：TEMEDD液：10%AP9【實驗方法與步驟】1.聚丙烯酰胺凝膠

4、配方 成分 含量 作用A液（30%Acr-0.8%Bis） 4mL 交聯(lián)劑B液（Tris + EDTA） 7mL 緩沖液C液（TEMED） 30L 加速劑D液（10% AP） 50L 催化劑10【實驗方法與步驟】2.樣品制備 稱取小麥幼苗葉片0.5 克，放入研缽內(nèi)，加 pH8.0 樣品提取液1mL，于冰浴中研成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，在高速離心機上以 8000rpm 離心 10 分鐘，取上清液，加入等量的上樣緩沖液，混勻，即為樣品液。11【實驗方法與步驟】3.上樣30-50L12【實驗方法與步驟】4.電泳 接好電源線(上槽接負極，下槽接正極)。打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓，以10V/cm穩(wěn)定電壓電泳，待前沿指示染料溴酚藍下行至距膠板末端1-2 厘米處，即可停止電泳。13【實驗方法與步驟】5.剝膠、染色 電泳結(jié)束之后，將垂直板從電泳槽上取下，小心地將兩