項(xiàng)目二十一 細(xì)胞因子檢測(cè)

1、項(xiàng)目二十一細(xì)胞因子檢測(cè)一、白細(xì)胞介素-2的測(cè)定(Determination of interleukin-2)檢測(cè)IL-2主要有兩類方法，一類是生物活性檢測(cè)，另一類是抗體檢測(cè)法(或稱為免疫分 析法)。生物活性檢測(cè)法是通過檢測(cè)IL-2反應(yīng)敏感細(xì)胞對(duì)待檢樣本中IL-2的增殖反應(yīng)程度對(duì) IL-2進(jìn)行分析，該方法比較敏感，但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，步驟多，影響因素多，因此結(jié)果容易波動(dòng)。 免疫分析法比較簡(jiǎn)單、迅速、可靠，通過免疫分析法檢測(cè)IL-2的方法也有很多，其中應(yīng)用 較多的是采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked Immunoabsobent Assay, ELISA)這里選取其 中較為實(shí)用、敏感性及

2、特異性較好的雙抗體夾心法加以介紹。【實(shí)驗(yàn)原理】將抗IL-2單抗結(jié)合到固相載體上形成固相抗體，然后通過加入待檢標(biāo)本，使標(biāo)本中的 相應(yīng)抗原IL-2與抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后加入生物素標(biāo)記兔抗人IL-2多克隆抗體， 使之與免疫復(fù)合物中的IL-2抗原反應(yīng)，再加入親和素標(biāo)記辣根過氧化物酶進(jìn)行反應(yīng)，最后 加底物顯色，通過分析酶促反應(yīng)強(qiáng)度檢測(cè)標(biāo)本中IL-2的含量?！驹噭┡c器材】抗體和標(biāo)記物 包被用抗人IL-2單克隆抗體，生物素標(biāo)記兔抗人IL-2多克隆抗體， 親和素標(biāo)記辣根過氧化物酶。包被緩沖液 0.1mol/L Na2HPO4，用 HCl 調(diào)整 pH 值至 9.0。 PBS 80.0g NaCl，11

3、.6g Na2HPO4，2.0g KH2PO4，2.0g KCl，溶解于 10L 蒸餾水中， 調(diào)整pH至7.0。洗滌液 含 0.05%(V/V)Tween-20 的 PBS，pH 值 7.0。封閉液 含10%(V/V)小牛血清或1 % BSA (W/V)的PBS液。樣品稀釋液 用封閉液加入0.05 %(V/V) Tween-20即可。底物 加150mg 2,2-連氮基-二(3-乙基-苯噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)于500ml 0.1mol/L枸櫞酸溶液中，充分溶解后用NaOH調(diào)節(jié)pH值至4.35,分裝后保存于-20C備用。 用前每11ml底物溶液中加入H2O2 10叫。終止液 20%S

4、DS-50%DMF(將 50ml DMF加入到50ml蒸餾水中，然后加入20.0g SDS)。溫箱、聚苯乙烯酶標(biāo)反應(yīng)板、微量移液器、酶標(biāo)檢測(cè)儀。【步驟與方法】包被 用包被液稀釋鼠抗人IL-2單抗至適當(dāng)濃度，加到聚苯乙烯酶標(biāo)反應(yīng)板中，每 孔100gl，最后一孔僅加包被液100gl作為對(duì)照，加蓋或用塑料粘紙封板，4C作用過夜。封閉 棄去包被液，用洗滌液洗滌反應(yīng)孔4次，甩干，每孔加封閉液200gl，室溫作 用1h。如不立即檢測(cè)樣品，可保留封閉液而置于4C備用。加樣 棄去封閉液，用洗滌液洗滌反應(yīng)孔4次，甩干，加用稀釋液稀釋的IL-2標(biāo)準(zhǔn) 品或標(biāo)本液，每孔100gl，室溫作用24h或4C過夜。加二抗 棄

5、去樣品液，用洗滌液洗滌反應(yīng)孔4次，甩干，加用樣品稀釋液適當(dāng)稀釋 的生物素標(biāo)記兔抗人IL-2多克隆抗體，每孔100gl，室溫作用1h。加親合素-HRP棄去多抗液，用洗滌液洗滌反應(yīng)孔4次，甩干，加用樣品稀釋液適 當(dāng)稀釋的親和素標(biāo)記辣根過氧化物酶，每孔100gl，室溫作用3060min。顯色 棄去親和素-HRP反應(yīng)液，用洗滌液洗滌反應(yīng)孔8次，甩干，加底物，每孔 100gl，室溫避光顯色560min,或據(jù)室溫適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，至陽(yáng)性孔出現(xiàn)明顯棕 黃色時(shí)加終止液，每孔50gl，終止反應(yīng)?！窘Y(jié)果判定】目測(cè)法 陽(yáng)性孔呈桔黃色至棕黃色，陰性孔為無色或極淺的黃色。如需定量測(cè)定， 應(yīng)采用比色法。比色法 以空

6、白對(duì)照調(diào)零，用酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)A405值，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 確定樣品中IL-2的含量?！咀⒁馐马?xiàng)】應(yīng)首先通過方陣滴定確定各抗體的最佳濃度，再進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。其中包被抗體濃度 一般以1卻g/ml為宜，而生物素標(biāo)記二抗?jié)舛纫?.252.0pg/ml為宜。檢測(cè)標(biāo)本應(yīng)力求新鮮，污染細(xì)菌的標(biāo)本容易產(chǎn)生非特異顯色，因菌體內(nèi)可能含有內(nèi) 源性HRP。如需檢測(cè)血標(biāo)本，應(yīng)避免溶血，因紅細(xì)胞溶解后會(huì)釋放出具有過氧化物酶活性 的產(chǎn)物。為確保結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)常規(guī)設(shè)重復(fù)孔，如一次用多塊板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)考慮板間差異。 在每塊板上均應(yīng)設(shè)立對(duì)照孔，尤其是每板都應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照。切忌加底物前將反應(yīng)板暴露于空氣中時(shí)間過長(zhǎng)，不可將許多板一

7、次甩干后再依此加 入底物。【方法評(píng)價(jià)】本法一般用于定量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液標(biāo)本中IL-2的含量，其敏感性和特異性均較高， 缺點(diǎn)是操作步驟較多，容易受到抗體濃度、抗體對(duì)包被固相的吸附能力及酶標(biāo)抗體質(zhì)量的影 響，因此應(yīng)在充分預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定各抗體的最佳稀釋度，以達(dá)到最佳檢測(cè)效果。本方 法亦可用于標(biāo)本中其它多種細(xì)胞因子測(cè)定，故目前應(yīng)用十分廣泛。也可以在步驟3之后先加 普通兔抗人IL-2多抗反應(yīng)，再加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，這樣反應(yīng)用試劑更 易制備，方法也更易使用。【臨床意義】IL-2是由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，它在免疫應(yīng)答和免 疫調(diào)節(jié)過程中具有重要作用。本方法

8、可以直接檢測(cè)標(biāo)本中IL-2的含量?！舅伎碱}】檢測(cè)IL-2的方法有哪些，各自具有何優(yōu)缺點(diǎn)？二、腫瘤壞死因子活性的測(cè)定(Tumor necrois factor bioarray)【實(shí)驗(yàn)原理】L929細(xì)胞株是對(duì)腫瘤壞死因子(TNF)很敏感的小鼠纖維瘤細(xì)胞株，當(dāng)體外用TNF刺激 時(shí)，其死亡率與TNF活性成正比。結(jié)晶紫染料能使存活的細(xì)胞著色，再用脫色液將染料溶 解后測(cè)定其吸光度，測(cè)定值與殘留的存活瘤細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，而與TNF的活性呈負(fù)相關(guān)。 放線菌素D能抑制DNA的合成，降低瘤細(xì)胞對(duì)損傷的修復(fù)，加入之可使靶細(xì)胞對(duì)TNF的 敏感性提高10100倍?！驹噭┖推鞑摹縇929細(xì)胞選擇生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，

9、用終濃度0.01%胰蛋白酶消化收集， 用RPMI 1640培養(yǎng)基配成2x105/ml的細(xì)胞懸液待用。 胰蛋白酶 取胰蛋白酶2.5g、EDTA 0.2g、無Ca2+和Mg2+的Hanks液1000ml，過濾 除菌，分裝后置-20C保存。RPMI 1640培養(yǎng)液 含20%小牛血清、100U/ml青霉素、100gg/ml鏈霉素。放線菌素D 用RPMI 1640培養(yǎng)液配成100|ig/ml的濃度。脫色液 由9g/L檸檬酸鈉、0.02mol/LHCl和47.5%甲醇組成。重組TNF標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣品。2.5 g/L結(jié)晶紫染液 溶于20%甲醇。酶標(biāo)測(cè)定儀、CO2培養(yǎng)箱、微量加樣器、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板?！?/p>

10、步驟和方法】取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100gl L929細(xì)胞懸液，置37C5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h。吸去培養(yǎng)細(xì)胞的上清液，加入倍比稀釋待檢樣品和TNF標(biāo)準(zhǔn)品(1000.1U/ml),每 孔100皿，各設(shè)雙復(fù)孔；陰性對(duì)照孔加入100gl RPMI 1640培養(yǎng)液，并設(shè)空白對(duì)照組。同時(shí) 向各孔加入10gl放線菌素D(0.51.0pg/ml)，置37C5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1214h。離心棄上清液，用PBS洗細(xì)胞一次。每孔加2.5g/L結(jié)晶紫100gl，置室溫染色10min。離心棄上清液，用PBS洗一次。6置室溫晾干，每孔加入脫色液100gl，充分混勻后測(cè)A570或A630值?！窘Y(jié)果判定】毒性百分率按下式計(jì)算：細(xì)胞毒性=(1一叫實(shí)驗(yàn)組A值店)100% 陰性對(duì)照組A值TNF活性單位定量 以標(biāo)準(zhǔn)品A值為縱坐標(biāo)，活性單位(U/ml)為橫座標(biāo)作圖，各檢 測(cè)標(biāo)本通過A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出相應(yīng)的活性單位數(shù)。【注意事項(xiàng)】L929細(xì)胞不宜生長(zhǎng)過密，只要孔內(nèi)長(zhǎng)成單細(xì)胞層即可使用。L929細(xì)胞隨著傳代或受其它因素影響，對(duì)放線菌素D的敏感性會(huì)有差異， 故最好先做預(yù)試來確定其使用濃度。TNF活性單位標(biāo)準(zhǔn)曲線如不理想，可用對(duì)數(shù)處理，將曲線直線化?！痉椒ㄔu(píng)價(jià)】本方法的優(yōu)