核醫(yī)學體外分析8年制

1、體外分析技術(shù) 上海交通大學醫(yī)學院 附屬瑞金醫(yī)院 核醫(yī)學科 張一帆 主任醫(yī)師體外分析技術(shù) 利用放射分析或非放射分析技術(shù)測定生物樣品中微量生物活性物質(zhì)含量的一類分析法。體外放射分析技術(shù) 放射性競爭結(jié)合分析:放射免疫分析（RIA) 放射性非競爭結(jié)合分析:免疫放射分析（IRMA) 受體放射配基結(jié)合分析(RBA)體外非放射分析技術(shù) 化學發(fā)光分析 時間分辨熒光分析 酶免疫分析 放射免疫分析（Radioimmunoassay,RIA） 概念是利用特異抗體與標記抗原和非標記抗原的競爭結(jié)合反應(yīng)，通過測定復合物放射性來計算非標記抗原的量的一種超微量分析技術(shù)。1959年Berson和Yalow 首先報導人體血漿內(nèi)源

2、性胰島素的免疫分析。1977年榮獲諾貝爾獎。 原 理基本原理是競爭結(jié)合反應(yīng) *Ag+Ab *AgAb+*Ag (free) + Ag AgAb + Ag (free)*Ag和Ag與Ab具有相同的結(jié)合能力，當Ab的量有限時，相互競爭，相互抑制。Ag和*Ag與Ab結(jié)合的量取決于兩者的濃度比。遵循質(zhì)量作用定律。*Ag與Ab的結(jié)合率隨著Ag的量的增加而減少，呈負相關(guān)。反之亦然。原理將結(jié)合型B (AgAb和*AgAb)與游離型F (Ag和*Ag)分離開，分別測定其放射性，則B/F與Ka和待測Ag呈函數(shù)關(guān)系。用已知的不同濃度的標準Ag與一定量的*Ag和Ab作用，即可測得在各種標準濃度下的B/F比值，以此繪

3、成標準曲線。根據(jù)被測Ag的B/F比值，就可在標準曲線上求出相應(yīng)的該抗原的含量。原理 Ag+Ab AgAb 反應(yīng)達到平衡時 Ka= = K1為Ag與Ab結(jié)合速率常數(shù) K2為Ag與Ab解離速率常數(shù) Ka為平衡常數(shù)或親和力常數(shù)K1K2K1K2AgAbAgAb數(shù)學模式 數(shù)學模式若Ag0及Ab0分別代表抗原及抗體的初始濃度，則平衡時： Ag=Ag0-AgAb Ab=Ab0-AgAbB/F= AgAb/Ag(B/F)2+(1+KaAg0-KaAb0)B/F-KaAg0=0Ka為常數(shù)， Ab0為固定值，Ag0=*Ag+Ag， *Ag為設(shè)定的量。B/F與未標記Ag之間呈函數(shù)關(guān)系?；痉椒?主要試劑特異抗體 高

4、親和力(affinity): Ag與Ab結(jié)合的能力。 高特異性(specificity): 不易發(fā)生交叉反應(yīng)。 高滴度(titer):所需抗體量少,雜質(zhì)干擾少。標記抗原 1)與待測物同一物質(zhì); 2)生物活性不變; 3)核素半衰期長; 4)高比活度、放化純度。標準品（非標記抗原）常用液相分離技術(shù): 收集抗原抗體復合物（B）雙抗體沉淀法: 分離完全，非特異結(jié)合小，環(huán)境影響小，效價高，但 成本高.聚乙二醇(PEG)沉淀法: 快速，價廉，來源方便，受環(huán)境影響大葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法常用液相分離技術(shù)： 收集游離抗原(F)活性炭吸附法: 吸附游離部分，適用于分離小分子游離抗原。 快速、簡便、準確性

5、差.葡聚糖包被活性炭(DCC) 增強吸附和減少解離，常使用?；钚蕴柯?lián)結(jié)氧化鐵制備DCC.微孔濾膜過濾法鹽析法、層析法、電泳法常用液相分離技術(shù): 固相法固相分離法 按材料（塑料、纖維素、凝膠顆粒）不同，有試管法、微粒法等。 固相分離法是RIA近年來發(fā)展較快的領(lǐng)域 試管固相法：抗體吸附在塑料試管上 吸附量小，重現(xiàn)性差等 微粒法和微球法：吸附量大等?；静襟E加樣：系列反應(yīng)管中加入相同劑量的* Ag、Ab，不同劑量標準Ag或一定量樣品。孵育：反應(yīng)達到平衡所需孵育時間溫度不同。分離結(jié)合及游離部分：測放射性：125I、3H數(shù)據(jù)處理：以B/F為縱坐標，標準Ag濃度為橫坐標，制作標準曲線。通過標準曲線求出待測

6、樣品的濃度。放免分析的優(yōu)點靈敏度高特異性強精確度高缺點同位素的半衰期短，試劑盒不宜較長時間儲存。125I標記抗原,輻射自分解影響標記物的穩(wěn)定性，時間過長標記物可脫碘和變性。放射性漲落引起樣本的計數(shù)誤差。反應(yīng)時間長，難以做到快速和自動化檢測。廢物處理帶來許多不便。質(zhì)量控制（quality control，QC)對分析工作的誤差進行經(jīng)常性的檢查，遇有質(zhì)量異常及時采取對策，以保證分析誤差控制在可接受的范圍內(nèi)。實驗室內(nèi)部質(zhì)控 系統(tǒng)誤差：某一系統(tǒng)變化，整批樣品受影響。 隨機誤差：隨機現(xiàn)象，只對某一管或某一樣品影響。實驗室間質(zhì)控：地區(qū)性或全國性對各實驗室結(jié)果比較免疫放射分析 (Immunoradiomet

7、ric assay,IRMA)原理 Ag+Ab*=Ag*Ab+*Ab (free)過量的*Ab與Ag結(jié)合形成Ag*Ab復合物，通過免疫吸附劑除去游離*Ab。Ag*Ab復合物的放射性與Ag的量成正相關(guān)。非競爭結(jié)合反應(yīng)。應(yīng)用過量*Ab，能測定低濃度Ag，靈敏度提高。基本方法夾心法：被測配體中加入固相抗體，再加標記抗體，形成Ab1-Ag-Ab2復合物，用洗滌去除未結(jié)合的游離*Ab。測定復合物的放射性活度能代表被測配體的量 。標記第三抗體法:標記第一抗體的抗體，如羊抗兔或兔抗鼠IgG，通過與一抗相結(jié)合而測定其結(jié)合放射性活度，如夾心法為Ab1-Ag-Ab2-*Ab3四復和物，稱此*Ab3為通用試劑 方法

8、學上的進一步改進:生物素-親和素系統(tǒng)(bio-avidin system,BSA)的引入，對提高靈敏度及縮短分析時間有較明顯的效果。特點易于標記：標記物為抗體，結(jié)構(gòu)相同，125I 標記方便反應(yīng)速度快:非競爭結(jié)合反應(yīng)，標記抗體過量，易達平衡靈敏度高：無不確定因素，靈敏度提高10100倍。工作范圍寬：特異性高：單克隆抗體精密度好：加樣誤差主要來自抗原一個環(huán)節(jié)缺點至少兩株抗體：主要限于肽類和蛋白質(zhì)，很多小分子半抗原不能應(yīng)用。緩沖液PH及離子強度要求嚴格。應(yīng)用CEA、AFP、鐵蛋白、HbsAg、ACTH、PHA、胰島素、FSH，TSH、降鈣素、血管緊張素I& II 、抗血友病因子、凝血VIII因子等

9、。IRA與IRMA的區(qū)別 反應(yīng)類型 結(jié)合類型 標記物 待測物RIA 免疫反應(yīng) 競爭結(jié)合 抗原 抗原IRMA 免疫反應(yīng) 非競爭 抗體 抗原受體放射配基結(jié)合分析（ Radioligand binding assay,RBA） 受體特性受體(receptor, R)是蛋白質(zhì)，是細胞蛋白組分。配體(ligand, L)是與受體特異結(jié)合的物質(zhì)。R與L具有極高的識別能力和高度親和力。R與L結(jié)合可觸發(fā)相應(yīng)的生理反應(yīng)或藥理效應(yīng)。具有飽和性、可逆性及符合質(zhì)量作用定律。 R + *L R*L受體與配基的結(jié)合反應(yīng)非競爭性的結(jié)合反應(yīng)核素標記配基分析受體的數(shù)量和性質(zhì)原理根據(jù)R*L的放射性和*L的比活度推算受體數(shù)量利用S

10、catchard作圖法求出受體的親和力常數(shù)，反映受體的性質(zhì)。通過測定類似物或阻斷劑競爭受體的能力可測定其特性。飽和曲線Scatchard作圖RTRT KD 1 KD離體RBA基本方法制備標本(亞細胞組分、細胞懸液、冰凍切片）加樣（放射配基、緩沖液、標本、非標記配基）孵育（反應(yīng)達平衡）分離結(jié)合和游離的放射配基測量結(jié)合部分的放射性數(shù)據(jù)處理或觀察切片上的受體分布放射配基的要求高比活度：受體數(shù)量低高親和力：易達飽和、易分離高特異性：減少交叉反應(yīng)高放射化學純度：參數(shù)計算依據(jù)配基用量和 比活度，大于95%結(jié)合與游離部分分離低溫和快速分離。過濾、離心、透析、電泳等 常用過濾法:玻璃纖維濾膜總結(jié) 反應(yīng)類型 結(jié)

11、合類型 標記物 待測物RIA 免疫反應(yīng) 競爭結(jié)合 抗原 抗原IRMA 免疫反應(yīng) 非競爭 抗體 抗原RBA 受體配體 非競爭 配基 受體 數(shù)量和性質(zhì)非放射性標記免疫分析提高靈敏度減少放射性廢物原理相同探測信號不同探測儀器不同 一、酶標記免疫分析 (enzyme immunoassay, EIA)EIA和 IEMA（酶免疫分析法）的測定原理與RIA和IRMA相同，競爭結(jié)合和非競爭結(jié)合。 IEMA應(yīng)用最多-酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)。 只是用酶替代標記抗原或抗體的放射性核素常用的酶辣根過氧化酶(HRP),底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)分光光度計檢測二、化學發(fā)光免疫分析 化學發(fā)光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay CLIA） 標記物為能產(chǎn)生化學發(fā)光的化合物，如異魯米娜、甲基氮蒽。堿性條件下遇過氧化物有單光子發(fā)射。缺點:發(fā)光時間短?；瘜W發(fā)光酶免疫分析(ECLEA) 標記物堿性磷酸酶，底物金剛烷?？煽啃愿?。電化學發(fā)光免疫分析(ECLIA) 電解反應(yīng)與化學發(fā)光結(jié)合。標記物三丙胺，底物三價釕化合物?？裳h(huán)利用、發(fā)光時間長、強度高易測定等。二、熒光標記免疫分析以熒光物質(zhì)標記抗