三種熒光定量PCR檢測方式比較

1、三種熒光定量PCR檢測方式比較:以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)CR進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測，從而達(dá)到評估樣本中靶基因的拷貝 數(shù)，稱為定量PCR。定量PCR的可行性定量一樣是在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)行的。常見檢測方式可分為以下幾類：(1) SYBR Green I 檢測模式SYBR Green I是一種能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光的熒光染料。其與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。因 此，SYBR Green I的熒光信號強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，能夠依照熒光信號檢測出PCR體系存在的雙 鏈DNA數(shù)量。SYBR Green I的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。PCR擴(kuò)增程序一樣

2、為94C 55C 72C三步法，40個循環(huán)。SYBR Green I的缺點(diǎn)：由于SYBR Green I沒有特異性，不能識 別特定的雙鏈，只若是雙鏈就會結(jié)合發(fā)光，對PCR反映中的非特異性擴(kuò)增或也會產(chǎn)生熒光，通常本底較高，因 此在臨床上利用可能會有假陽性發(fā)生。SYBR Green I的優(yōu)勢：SYBR Green I的優(yōu)勢是因?yàn)槠淙秉c(diǎn)產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈相結(jié)合，因此對不 同模板不需專門定制不同的特異性探針，通用性較好，而且價錢相對較低。這對科研是很有利的，因此國內(nèi)外在 科研中利用比較普遍。.SYBR GREEN I工作原理(2)水解探針模式(man探針)TaqMan探針是一種探針，熒光基團(tuán)連接

3、在探針的5結(jié)尾，而淬滅劑那么在3 結(jié)尾。當(dāng)探針與靶序列配對時，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3端的淬滅劑接近而被淬滅。 在進(jìn)行延伸反映時，聚合酶的5外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離， 發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成績伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加， 釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積存。因此Taqman探針檢測的是積存熒光。PCR擴(kuò)增程序一 般是：94C60 C 40個循環(huán)。經(jīng)常使用的熒光基團(tuán)是FAM , TET, VIC, HEX。Taqmaii探針一作原理5 H D I |3 I L 4! rrs L9 I 1 I SUVA HID 如MLKtEVE*5E FflIMERC h

4、 v fl $i r b r a k i o o C o iti陡 Rr phh re pi- il UENCnEN探針模式(Beacon、FRET)分子信標(biāo)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩頭的核酸序列互補(bǔ)配對， 因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)牢牢靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的 光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。分子信標(biāo)的 莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一樣為15-30個核苷酸長，并與目標(biāo)序列互補(bǔ);莖一樣5-7個核苷酸長， 并彼此配對形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的一端，而淬滅劑那么標(biāo)記在另一端。在復(fù) 性溫度下，因?yàn)槟０宀淮嬖跁r形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)

5、加熱變性會互補(bǔ)配對的莖環(huán)雙鏈解開，若是 有模板存在環(huán)序列將與模板配對。與模板配對后，分子信標(biāo)將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光 基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時，因淬滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光子。由于是酶切 作用的存在，分子信標(biāo)也是積存熒光。經(jīng)常使用的熒光基團(tuán)：FAM ，Texas Red。PCR擴(kuò) 增程序一般是：945572 C三步法，40個循環(huán)。TargetMolecular BeaconHybridFluorophor-eQuenchar分子信標(biāo)工作原理FRET探針又稱雙雜父探針，F(xiàn)RET探針由兩條相鄰探針組成，在一條探針的5端標(biāo) 記FAM熒光基團(tuán)，另一探針的3端標(biāo)記Red 640熒光基團(tuán)。

6、當(dāng)復(fù)性時，探針結(jié)合在模 板上，F(xiàn)AM 基團(tuán)和Red640基團(tuán)相鄰，激發(fā)FAM產(chǎn)生的熒光，作為Red640基團(tuán)的激 發(fā)光被吸收，使Red640發(fā)出波長為640的熒光。當(dāng)變性時，探針游離，兩基團(tuán)距離遠(yuǎn)， 不能產(chǎn)生640波長的熒光。由于FRET探針是靠近發(fā)光，因此檢測信號是實(shí)時信號，非 積存信號。經(jīng)常使用的熒光基團(tuán)是：LC-Red640，LC-Red705。DonaivralicwiRolymeris-ationI Pricier pF&he annhng 3HCULFRET工作原理puuimMi能用于實(shí)時熒光PCR定量的方式很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)依如實(shí)驗(yàn)的需要和當(dāng)前的實(shí) 驗(yàn)條件選擇適合自己的方式。下

7、面為各類方式的比較：STM GBEEN?K1T探針Tswle 曲分于僖蹤性廟郁地我光桐弱建光旃點(diǎn)分析貌不祀特異件弓:物f非特異性甘增嫉引物二S伴有夠矚）5引物1援針別探針探U不蓿驥霜耍專用專用專用實(shí)驗(yàn)中的一些好適應(yīng):加入試劑之前，把它混勻一下，以避免放置時刻長了濃度不均;移液槍用完以后要?dú)w到 最大計量的位置，避免久而久之彈簧失去彈性。必然要記著關(guān)水浴箱，切記切記;多和大伙兒討論，同時多關(guān)注他人討論的體會，這幾 乎是最快提高的捷徑了 ;所有的試劑都自己配，出了問題才好找緣故。避免污染的方法：所有的玻璃器皿均應(yīng)在利用前于180 C的高溫下干烤6h或更長時刻。塑料器皿可用 DEPC水浸泡或用氯仿沖洗

8、性意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿侵蝕， 故不能利用)。有機(jī)玻璃的等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2室 溫10min，然后用 DEPC 水沖洗，晾干。配制的溶液應(yīng)盡可能的用 DEPC ，在37 C處置12h以上。然后用高壓滅菌除去 殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處置過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)以m 濾膜。操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中手套要勤換。設(shè)置RNA操作專用，所有器械等應(yīng)為專用。經(jīng)常使用的RNA酶：焦磷酸二乙酯(DEPC):是一種強(qiáng)烈但不完全的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶 的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使，從而抑制酶的活性。異硫

9、氰酸胍：目前被以為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA 酶失活。它既可破壞使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。氧帆核糖核苷復(fù)合物：由氧化帆離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成 過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin)：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。 RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，能夠和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有必然抑制作用。因?yàn)镈EPC不加選擇的修飾蛋白質(zhì)和RNA，因此在分離和純化RNA進(jìn)程中不能利用， 而且它與一些緩沖液(例如丁口不能相容在

10、所有RNA實(shí)驗(yàn)中，最關(guān)鍵的因素是分離取得全長的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的要緊緣故 是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。RNA酶可耐受多種處置而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。研究人員造成的污染RNA酶最要緊的潛在污染源是研究人員的手。因此進(jìn)行RNA實(shí) 驗(yàn)時應(yīng)勤換手套。但DEPC能與胺和巰基反映,因此含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處置動植物總RNA 提取-Triz。法：Trizol去適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培育細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾 克。用Trizo去提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點(diǎn)分 析，斑點(diǎn)雜交，Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase

11、封阻分析和分子克隆。將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizo液研磨，注意樣 品整體積不能超過所用Trizo體積的10%。研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizo液加入的比例加入氯仿，蓋緊離心管， 用手猛烈搖蕩離心管15秒。取上層水相于一新的離心管，按每ml Trizo液加異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放 置10分鐘，12000g離心10分鐘。棄去上清液，按每ml Trizo液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4C 下7500g離心5分鐘。警惕棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過度，不然會降 低RNA的溶解度。然后將RNA溶于

12、水中，必要時可55 C-60C水溶10分鐘。RNA可進(jìn) 行mRNA 分離，或貯存于70%乙醇并保留于-70C。注意整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。另外，提取上清這步必然要警惕，靠近沉淀的部份必然要舍得不要，要不然會有蛋白 質(zhì)污染，阻礙比值加氯仿前的勻漿液可在-70C保留一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4C保 留一周，-20C保留一年?？俶RNA 的提取體會：一、關(guān)于Trizol Reagent需要的試劑Chloroform氯仿分析純)Isoproplyl alcohol 丙醇分析純）75% Ethanol(in DEPC-treated water)75%乙醇。要求

13、用分析純無水乙醇并用的 DEPC處置過的無Rnase的水稀釋。RNase-free water 無 Rnase 的水。方式是：將 DEPC 按%(V/V)加在 d H2O 中 500ml(50ul),在37 C留宿，并高壓滅菌即得(150C 3小時)一次性塑料手套注意：DEPC有致癌之嫌二、關(guān)于 Trizol Reagent 的利用進(jìn)程：1. Homogenization 勻 漿)Tissues 組織每100mg組織勻漿加1mlTrizoE式劑，樣品體積不能超過Trizol式劑的10%。Cells Grown in monolaye!單層細(xì)胞接毒后顯現(xiàn)病變的)針對JEV細(xì)胞總RNA的抽提法：B

14、HK21細(xì)胞長成單層后，接毒采納大瓶)，37 C吸附1h,倒掉，加維持液含2%的血 清和HEPE8的MEM)約5ml，維持天。出現(xiàn)75%-100%的病變時，以PBS(預(yù)冷)沖洗細(xì) 胞兩次，直接在細(xì)胞瓶中加入TrizoM劑1ml/10cm2，吹吸幾回，以裂解細(xì)胞(細(xì)胞瓶有兩 種 經(jīng)常使用規(guī)格：大的約45cm2，小的約30cm2，故所用Trizol式劑別離約為和3ml。Trizol 試劑的加入是依細(xì)胞瓶而定，以蓋滿瓶底為度，而不是依據(jù)細(xì)胞的數(shù)量，不然可致使DNA 的污染)具體方式如下：樣品必然要新鮮)組織接入預(yù)冷的EP管中，加入Trizo試劑1ml/10cm2(量必然要加足，不然易污 染)，混勻，

15、吹吸幾回，以破裂細(xì)胞，置室溫5min，以使核蛋白復(fù)合物完全分離。加氯仿(每1ml Trizo試劑加入氯仿，蓋好，猛烈震蕩15s，置室溫2-3分鐘。43離心，10000gX15min，離心后，混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-氯 仿相、上層為無色的水相。RNA包括在水相中，水相的體積約相當(dāng)于所加的Trizo試劑量 的 60%。認(rèn)真吸取上層水相，移至另一EP管中。加異丙醇，以沉淀RNA(每1ml Trizo試劑加入異丙醇)，置室溫10min。42離心，10000gX10min。RNA沉淀為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁。棄上清液，加入預(yù)冷的75%乙醇1 ml (每1ml Triz。試劑加

16、入75%乙醇至少1ml)， 震蕩，充分洗滌沉淀，4C離心，5500gx5min。棄上清液，空氣干燥或真空干燥)后，沉淀重懸于無Rnase dH2O 中，吹吸幾回，55 C-60C作用10分鐘以溶解RNA , -70C保留備用。抽提出的細(xì)胞總RNA干燥后加水50ul，取10ul加無Rnase水990ul,稀釋100 倍成1ml。于厚的石英比色杯中，以無Rnase水為對照，在721型紫外分光光度計下檢測， 結(jié)果應(yīng)為：A260/280 ratio分離組織10mg(純組織)加800ul Trizo試劑。擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定。DEPC處置方式如下：DEPC 處置：DEPC水：100ml超純水加入DEPC，充分

17、混勻，高壓滅菌。Tip頭槍頭)、EP管等在提RNA進(jìn)程中及做RT時接觸RNA的器材包括1ml、200pl、 20】l Tip頭;EP管和PCR反映管等)：用%的DEPC 水(1000 ml超純水加入1ml DEPC)37 C 浸泡留宿，高壓滅菌。提取RNA，用DEPC水溶解。RT：我是用PCR儀來操縱溫度和時刻的，因此RT是在PCR反映管中作的。操作進(jìn)程中要戴一次性手套，并常常換手套。最好把要直接接觸樣品的東西都用DEPC水處置一下，槍頭盒插好槍頭后，加入1-2ml 的%DEPC 水，在滅菌就好了;此刻有入口的RNASE FREE 的槍頭買，直接用不用途理的。如何排除污染：機(jī)械運(yùn)行完后，掏出P

18、CR產(chǎn)物時不能隨意拋棄，應(yīng)該用塑料手套或其他打結(jié)包好后丟 入垃圾桶。試劑：mixer盡可能分裝，不要原瓶多次取用。加樣：原那么是DNA最后加，其他試劑依照體積大小從大往小的加。若是是同種 引物和探針有多管的話只是DNA不同，那么采取的方式是算出整體積后加在一個管子里面， 混合均勻以后再分裝到各個管子里去，如此能夠有效地幸免誤差及污染。另外，一般實(shí)驗(yàn)室容易污染，且污染程度很高，與跑電泳還有質(zhì)粒制備提取都在同一 個房間里有比較大的關(guān)系，最容易造成高濃度污染的確實(shí)是產(chǎn)物的開蓋和質(zhì)粒的稀釋。目前，國內(nèi)外各個公司提供的診斷試劑盒大多采納了 UNG來防污染。Uracil-DNA N-glycosylase

19、(UNG)尿嘧啶DNA糖基酶，來源于大腸桿菌重組克隆表達(dá)。RNA定量：RNA也最好至少要用電泳，一方面定量，另一方面能夠看看完整性。至于用分光光度 計比較不同標(biāo)本之間就更不準(zhǔn)了。RNA的貯藏，最要緊的是溫度，-20不夠，最好-80，液氮最保險。mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因?yàn)檫€有翻譯效率和RNA降解速度的阻礙。RT-PCR有兩種做法：條件具有的話可用ki謎行一步法進(jìn)行;假設(shè)條件不太好的話可分兩步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄再 PCR。兩步法的結(jié)果加倍理想，條帶特異性強(qiáng)且無拖尾現(xiàn)象，由此推測是體系加倍單一比 較利于PCR的進(jìn)行。必然要做內(nèi)參的，不作內(nèi)參的結(jié)果是不可信的。電泳能夠不一路跑，沒有關(guān)系，計算的是

20、相對表達(dá)程度，半定量和定量RT-PCR做的 都是基因相對表達(dá)量，不是絕對表達(dá)量mRNA 的分離與純化中。步驟(4)中將RNA溶液置65 C中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破 壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級結(jié)構(gòu)，使Poly(A+)尾充分暴露， 從而提高Poly(A+)RNA的回收率另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合，不然會致 使rRNA的污染。因此此步驟不能省略。下面，咱們介紹一個能夠確認(rèn)RNA溶液中有無殘留的RNA酶的方式。保溫實(shí)驗(yàn)：方式很簡單的，依照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至ml 的離心管中，而且用的Tr

21、is緩沖液補(bǔ)充到10 ul的整體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入 70 C的恒溫水浴中，保溫1 h。另一份放置在-20C冰箱中保留1 h。時刻到了以后，掏出兩份樣本進(jìn)行電泳。電泳完成后，比較二者的電泳條帶。若是二 者的條帶一致或無明顯不同固然，它們的條帶也要符合方式2中的條件)，那么說明RNA 溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質(zhì)量專門好。相反的，若是70 C保溫的樣本有明 顯的降解，那么說明RNA溶液中有RNA酶污染。PCR污染與計謀：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染.這是PCR反映中最要緊最多見的污染問題，因此，擴(kuò)增區(qū)的儀器 什么如槍頭等要注意。還有一種容易輕忽，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染在空氣與液體面 摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較猛烈地?fù)u動反映管，