血紅蛋白分離和提取

1、關(guān)于血紅蛋白的分離和提取第一張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月思考：“課題1-DNA的粗提取與鑒定” 實(shí)驗(yàn)理想的材料是什么？ “課題3-血紅蛋白的提取和分離”這實(shí)驗(yàn)理想的材料又是什么？原因是？ 答：雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取，哺乳類動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。第二張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、基礎(chǔ)知識(shí)：（一）蛋白質(zhì)分離原理 （二）蛋白質(zhì)分離的方法 1）凝膠色譜法：又稱分配色譜法 2）電泳法（三）緩沖液的作用第三張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)步驟 血液組成成分 （1）洗 滌

2、紅 細(xì) 胞 （2）釋放血紅蛋白 （3）分離血紅蛋白 （4）透析血紅蛋白1、樣品 處理3、純化4、純度鑒定2、粗分離SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度凝膠色譜法進(jìn)行純化注意事項(xiàng)第四張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù) 蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)差異： 1.分子的形狀、大小 2.電荷性質(zhì)和多少 3.溶解度 4.吸附性質(zhì) 5.對(duì)其他分子親和力 第五張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.凝膠色譜法 一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，具多孔的凝膠就叫分子篩）根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的方法（2）概念：（1）凝膠第六張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月

3、3、原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，（ ）的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程（ ），移動(dòng)速度（ ），而（ ）的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（ ）移動(dòng)，路程（ ），移動(dòng)速度（ ），相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。相對(duì)分子質(zhì)量較小較長(zhǎng)較慢相對(duì)分子質(zhì)量較大凝膠外部較短較快總結(jié)：大分子經(jīng)過(guò)路程短，流動(dòng)快； 小分子經(jīng)過(guò)路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。第七張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。混合物上 柱洗脫大分子流動(dòng)快小分子流動(dòng)慢收 集大分子收 集小分子 4、具體過(guò)程第八張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2凝膠電泳法：1）原理：不同

4、蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)（正電荷或負(fù)電荷）、電量、分子形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。2）影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素電泳：帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程第九張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3）常用電泳方法 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙酰胺凝膠電泳 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)通常用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用時(shí)可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳做對(duì)照，根據(jù)兩者的電泳區(qū)帶位置，利用相關(guān)計(jì)算公式算出相對(duì)分子量 SDS 帶負(fù)電荷多的 ，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷的差別，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取

5、決于分子大小。 第十張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素決定運(yùn)動(dòng)方向決定運(yùn)動(dòng)速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小第十一張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿鹽溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等緩沖溶液洗脫劑 （1）作用： （2）配制：抵制外界酸堿對(duì)溶液pH的干擾而保持 pH穩(wěn)定。 （3）在血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)中用的緩沖液的原因？ 目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能。第十二張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月血液組成成分閱讀思考：血液由_和_兩部分組成。血細(xì)胞中_

6、細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞的含量最高的化合物是_。該化合物是由 _和_構(gòu)成的，其中每個(gè)亞基中都含有一個(gè)能與O2和CO2結(jié)合的_基團(tuán)。血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條-肽鏈2條-肽鏈 亞鐵血紅素第十三張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.洗 滌 紅 細(xì) 胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？ 洗滌的方法是什么？ 洗滌干凈的標(biāo)志是什么？血液100mL3g檸檬酸鈉低速短時(shí)間離心紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒(méi)有黃色第十四張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.釋放血紅蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過(guò)程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)，有什么用？目的分析：蒸餾水

7、的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂第十五張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月濾紙過(guò)濾脂類物質(zhì)3.分離血紅蛋白分離過(guò)程紅細(xì)胞混合液高速離心10min 離心管燒杯有機(jī)溶劑血紅蛋白第十六張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月20mmol/L磷酸緩沖液4.透析血紅蛋白透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血紅蛋白中的小分子雜質(zhì)第十七張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月純化凝膠色譜法1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：教材圖5193.樣品的加入和洗脫第十八張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月注意：（1

8、）凝膠顆粒蒸餾水充分溶脹；凝膠裝填時(shí)盡量緊密；裝填時(shí)不能有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。 （2）裝完后，立即用緩沖液洗滌，使凝膠裝填緊密第十九張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3.樣品的加入和洗脫 1.調(diào)液面 2.加樣 4.洗脫 5.收集緩沖液凝膠注意：洗脫過(guò)程不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象， 否則重新填裝。3.再調(diào)液面 1.調(diào)液面 2.加樣3.再調(diào)液面 4.洗脫 、 5.收集第二十張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月注意事項(xiàng)1. 紅細(xì)胞的洗滌： 洗滌次數(shù)不能過(guò)少；低速、短時(shí)離心。2. 凝膠的預(yù)處理： 沸水浴法，還能除去微生物和氣泡3.色

9、譜柱的裝填： 裝填盡量緊密；無(wú)氣泡；洗脫液不能斷流。4. 色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。Why？第二十一張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月知識(shí)總結(jié)血紅蛋白的提取和分離蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法原 理分離過(guò)程凝膠電泳法緩沖溶液組 成作 用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗 分 離 純 化純度鑒定第二十二張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過(guò)程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是A、 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對(duì) 分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B、 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對(duì) 分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C、 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對(duì) 分子質(zhì)量較

10、大的蛋白質(zhì)D、 二者根本無(wú)法比較練習(xí)鞏固第二十三張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的進(jìn)行過(guò)程可表示為圖中哪一個(gè)B第二十四張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，凝膠的種類較多，但其作用的共同點(diǎn)是( ) A.改變蛋白質(zhì)分子通過(guò)凝膠時(shí)的路徑 B.吸附一部分蛋白質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)分子的移動(dòng)速度 C.將酶或細(xì)胞固定在凝膠中 D.與蛋白質(zhì)分子進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，從而影響其移動(dòng)速度4.在利用凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)時(shí)，一定要加入緩沖液，其作用主要是( ) A.使酶的活性最高 B.使蛋白質(zhì)的活性最高 C.維持蛋白質(zhì)所帶的電荷 D.使蛋白質(zhì)帶上電荷AC第二十五張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過(guò)程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A 電荷的多少 B 分子的大小C 肽鏈的多少 D 分子形狀的差異第二十六張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月6.下列是有關(guān)血紅蛋白提取和分離的相關(guān)操作，其中正確的是（ ）A可采集豬血作為實(shí)驗(yàn)材料 B用蒸餾水重復(fù)洗滌紅細(xì)胞C血紅蛋白釋放后應(yīng)低速短時(shí)間離心 D洗脫液接近色譜柱底端時(shí)開(kāi)始收集流出液 A第二十七張