雞傳染性喉氣管炎

1、雞傳染性喉氣管炎（IL T）是由喉氣管炎病毒（IL TV）引起的一種急性呼吸道傳染病。ILT病變主要發(fā)生在喉頭和氣管部分，其特征性病變是呼吸困難，氣喘，咳出血樣滲出物，喉部和氣 管粘膜腫脹，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致糜爛和出血。該病呈急性暴發(fā)和長(zhǎng)期潛伏特性，現(xiàn)已遍布世界各地， 其發(fā)病率接近100 %，死亡率10 %40 %。感染IL TV會(huì)使蛋雞的產(chǎn)蛋量下降和死亡率增加，給 養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失，是集約化養(yǎng)雞場(chǎng)易流行的重要疫病之一。傳染性喉氣管炎是第一個(gè)被有效疫苗控制的禽病毒性疾病。起初人們用強(qiáng)毒通過泄殖腔接 種來使敏感雞獲得免疫，但是免疫雞還能排毒，而成為傳染源。目前國(guó)內(nèi)外主要采用弱毒疫苗 來防制本病，盡管

2、該疫苗具有良好的免疫效力，也比強(qiáng)度安全，但尚存在以下幾方面不足： 現(xiàn)用的ILTV弱毒疫苗的毒力普遍偏強(qiáng)，接種后反應(yīng)大。因?yàn)樗拿庖咴耘c毒力成正相關(guān)，如 果毒力通過體外傳代進(jìn)一步降低，那么其免疫效力也隨之下降。與ILTV強(qiáng)毒株一樣ILTV弱毒 疫苗也能導(dǎo)致潛伏感染，并且ILTV弱毒疫苗株在雞群的傳播過程中可能引起毒力反強(qiáng)，當(dāng)它與 非免疫雞群接觸時(shí)成為潛在的傳染源，所以該弱毒疫苗僅限于本病流行地區(qū)使用，但非免疫雞 群一旦傳入本病將導(dǎo)致重大損失。ILTV強(qiáng)弱毒尚無鑒別診斷方法。由于ILTV現(xiàn)用弱毒疫苗存 在問題，使ILT的完全控制仍然是養(yǎng)殖業(yè)的一大難題。傳統(tǒng)的方法已經(jīng)不能解決現(xiàn)有雞傳染性喉 氣管炎

3、弱毒疫苗存在的問題，所以需要開發(fā)研制一種具有與ILT弱毒疫苗同等效力又能克服弱毒 疫苗上述不足的新型安全有效的ILT疫苗。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和日趨完善，利用基因工 程疫苗來預(yù)防ILT已經(jīng)成為人們的共識(shí)。ILTVgB基因與單純皰疹病毒【型（HSV-1）病毒gB基因是同源基因，與HSV-1糖蛋白gB 一樣， ILTV糖蛋白gB也是一種跨膜蛋白，是病毒感染所必需的，在病毒接觸和進(jìn)入宿主細(xì)胞是起關(guān)鍵 作用HSV糖蛋白gB已經(jīng)被證明能夠引起體液抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，使免疫小鼠能夠抵抗 HSV強(qiáng)毒的致死性攻擊。ILTV糖蛋白gB基因能編碼205Ku的糖蛋白復(fù)合物，由ILTV糖蛋白gB制備 的亞單

4、位疫苗能保護(hù)雞100%抵抗臨床發(fā)病和83%一直強(qiáng)度復(fù)制。所有這些都表明，ILTV gB糖蛋 白是主要保護(hù)性抗原，可作為研制亞單位疫苗、病毒活載體疫苗和DNA疫苗的候選抗原。目前使用疫苗最大的問題是疫苗的免疫期短，此外，當(dāng)有母源抗體存在時(shí)，許多疫苗的免疫 效果會(huì)受到干擾。DNA疫苗可以克服以上兩種缺陷，被稱為免疫學(xué)上的第三次革命22 。DNA 疫苗又稱基因疫苗，能激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng),使之產(chǎn)生特異性抗體，它不僅可誘導(dǎo)體液免疫應(yīng) 答，而且可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，并兼有亞單位苗的安全性和弱毒疫苗的高效性,已經(jīng)成為國(guó)際疫 苗研究領(lǐng)域最熱門的課題之一。孟松樹等23 將分別含有雞傳染性喉氣管炎病毒王崗株gB、g

5、C、 gD基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒分組肌肉注射雛雞，經(jīng)過攻毒實(shí)驗(yàn)證明該重組質(zhì)粒誘 導(dǎo)了免疫應(yīng)答,免疫保護(hù)率為79 %，因此該基因疫苗可以作為預(yù)防IL T的一個(gè)補(bǔ)充。核酸疫苗(又稱為基因疫苗)是近十年來新興的一種疫苗，即利用病原的保護(hù)性抗原基因 構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，再將質(zhì)粒DNA用肌肉注射或基因槍直接導(dǎo)入機(jī)體細(xì)胞，使外源基因通過 機(jī)體內(nèi)源性表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并提呈給宿主免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)。DNA疫苗 盡管能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，但是他們?cè)跈C(jī)體內(nèi)表達(dá)量低，單獨(dú)使用不足以產(chǎn)生有 效的免疫保護(hù)效果，極大的限制了 DNA疫苗所誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答程度。因此應(yīng)用佐劑來輔 助D

6、NA疫苗，以刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，使機(jī)體獲得免疫保護(hù)。然而，傳統(tǒng)佐劑的固 有缺點(diǎn)使DNA疫苗仍難達(dá)到理想的免疫效果。因此尋找既能增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性，又安 全、有效的新型佐劑成為當(dāng)今新一代疫苗研究的熱點(diǎn)。研究表明，細(xì)胞因子具有明顯的免疫佐 劑效應(yīng)，它們既可增強(qiáng)抗原的免疫原性，又可作用于體內(nèi)免疫細(xì)胞，促進(jìn)其分化、增殖，加強(qiáng) 其活性與功能，以達(dá)到影響細(xì)胞內(nèi)生物活性分子的表達(dá)與分泌，從而增強(qiáng)特異抗原的免疫原性 或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的反應(yīng)性。具有佐劑作用的細(xì)胞因子包括IL-1、IL-2、IFN-y、GM-CSF、IL-6、 IL-12、IL-16、IL-18 等。白細(xì)胞介素-18(Interle

7、ukin-18,IL-18)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種重要的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)因子。1995 年Okamura等首次報(bào)告從中毒性休克的小鼠肝臟中獲得了該因子，由于這種細(xì)胞因子能誘導(dǎo) Th1等細(xì)胞產(chǎn)生大量INF- Y，因而將其命名為干擾素誘生因子(interferon gamma inducing factor,IGIF)。隨后的研究表明該因子結(jié)構(gòu)類似于IL-1家族而功能類似于L-12家族。1996年Ushio 等從鼠cDNA庫中篩選到人IGIF基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，因其序列與所有已知的細(xì)胞因子 不同，且生物活性多樣，因此將其正式命名為白細(xì)胞介素-18。研究表明IL-18可誘導(dǎo)INF-y大 量分泌、促進(jìn)

8、T、B淋巴細(xì)胞的分化、增強(qiáng)FasL的表達(dá)、激活NK細(xì)胞以及誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-2、GM-CSF 等，是一種多效性細(xì)胞因子。IL-18是由活化的巨噬細(xì)胞和肝臟枯否氏細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，它能促進(jìn)外周單核細(xì)胞 產(chǎn)生IFN-y、IL-2、GM-CSF等細(xì)胞因子，促進(jìn)T細(xì)胞的分化與增殖，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化成熟， 在Th1細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫反應(yīng)中具有重要作用。有資料顯示，IL-18在DNA疫苗中具有明顯 的佐劑作用。如Kim等(2001)構(gòu)建了卵清蛋白(OVA)基因與IL-18基因共表達(dá)重組質(zhì)粒pOVA/ IL-18,將此質(zhì)粒免疫C57BL/6小鼠，檢測(cè)OVA特異性IgG2a和IFN-y的分泌，結(jié)果顯示pO

9、VA/ IL-18免疫組較pOVA組高，表明IL-18能夠增強(qiáng)Th1型免疫應(yīng)答，而且這種增強(qiáng)作用依賴于它 與抗原的功質(zhì)粒表達(dá)。為了開發(fā)更為安全、有效的傳染性喉氣管炎基因工程疫苗，同時(shí)也為研制控制其它畜禽傳 染病的基因工程疫苗探索一條新途徑，因此本研究進(jìn)行雞傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB與雞 IL-18基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)，并初步研究其免疫效力。二、研究?jī)?nèi)容具體研究?jī)?nèi)容gB基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/gB的構(gòu)建。cIL-18基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/ cIL-18的構(gòu)建。gB與cIL-18基因重組真核共表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/ gB-cIL-18的構(gòu)建。重組 p

10、cDNA3.1/gB、pcDNA3.1/ cIL-18、pcDNA3.1/ gB-cIL-18 的表達(dá)。免疫效力的研究。重點(diǎn)解決的問題重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/gB、pcDNA3.1/ cIL-18、pcDNA3.1/ gB-cIL-18 的構(gòu)建與表達(dá)。重組真核表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。pcDNA3.1/gB、pcDNA3.1/ cIL-18、pcDNA3.1/ gB-cIL-18 免疫效果觀察。預(yù)期的研究結(jié)果成功構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/gB、pcDNA3.1/ cIL-18及共表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1/ gB-cIL-18。pcDNA3.1/gB、pcDNA3.1/ cIL-18、pcDNA3.1/ gB-cIL-18 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后 gB 和 cIL-18 基因獲得 瞬時(shí)表達(dá)。細(xì)胞因子IL-18能夠提高家禽抗感染免疫功能，為開發(fā)新型免疫佐劑，特別是雞用基因工程 疫苗的分子免疫佐劑奠定科學(xué)的基礎(chǔ)。三、研究方案設(shè)計(jì)重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/gB、pcDNA3.1/cIL-18及共表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1/gB-cIL-18。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的表達(dá)與鑒定重組質(zhì)粒對(duì)雞的免疫試驗(yàn)血清抗體IgG的ELISA檢測(cè)T細(xì)胞