薄層色譜、柱色譜及凝膠色譜法

1、薄層色譜、柱色譜及凝膠色譜法 金 敬 杰1 色譜法概述1 發(fā)展歷史 俄國生物學家茨維特(T s w e t t)首先提出來的。 1903年， T s w e t t柏林會議上宣讀了他的研究成果。 1906年，正式發(fā)表。 樣品：植物色素的石油醚提取液。 柱： CaCO3(固定相） 洗脫劑： 純石油醚（流動相）。 結果： 有色譜帶出現(xiàn)。 實驗方法：如圖 （1-1） 所示：2石油醚玻璃管CaCO3(粉末）.:. 圖1 色譜 31919 T s w e t t逝世，當時他的方法并未引起注意。 1931 R . k u h n（庫恩）用該法成功分離了胡蘿卜素和葉黃素。 1938 R . k u h n

2、Obtain Noble P rise. 1943 R . k u h n 發(fā)明了離子交換色譜。 1944 英國的M a r t i n . J . P和S y n g e .R . L發(fā)明了紙色譜。 1948 T i s e l I u s（瑞士）發(fā)明了電泳和 吸收分析 。 1952 英國的M a r t I n . J . P和S y n g e .R . L又發(fā)明了液相色譜。 41956 V a n . D e c e m t e r 提出了填充柱速率理論: H=A + B/u + Cu S t a h l 發(fā)明并完善了薄層色譜。 F l o d i n發(fā)明了凝膠色譜。 1958 G o

3、 l a y 發(fā)明了毛細管色譜； 氫火焰離子檢測器。1969 K i r k l a n d 提出了表面孔度擔體的新型填料。 H e r m u n 研制成第一條高效液相色譜儀。1975 H . S m a l l 離子交換柱 1979 D . T. G j e r d e and J .S .F r i t z非抑柱的單柱離子色譜. 總之：1956 Van. D e e m t e r ：柱速率理論。F l o d i n ：凝膠色譜理論。Stahl：薄層色譜。再加上1943年發(fā)明的離子交換色譜，使色譜學這門科學開始成為一門獨立的學科。5 2 基本原理： 色譜法是一種物理分離方法，即利用不同

4、物質在兩相(固定相和流動相)中具有不同的分配系數(或吸附 系數、滲透性等)，當兩相作相對運動時，這些物質在二相中反復多次分配，從而使各物質得 到完全的分離。 3 分類： 按固定相和流動相的物態(tài)可分為：氣相色譜法、液相色譜法; 固定相的操作 方式及形狀分類為：柱色譜、紙色譜、薄層色譜； 以分離機制分 類為：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、排阻色 譜（凝膠色譜）、親和色譜 6表1-1 色譜法的分類流動相 氣體 液體固定相 液體 固體 液 體 固體 吸附劑 健合固 離子交換 凝膠 定相 樹脂固定相 外型 柱 柱 柱 平面 平面 柱 柱 柱 柱 氣液 氣固 液液 薄層 色譜 液固 健 合 離子交 凝

5、膠名稱 色譜 色譜 色譜 紙 色譜 色譜 相色譜 換色譜 色譜 GSC LLC TCL LSC BPLC IC GPC PCGLC 7 1.3 幾種分析方法比較 色譜 光譜 電化學 化學法分離能力 強 弱 弱 一般定性 弱 強 一般 強定量 強 中 弱 中 一般分析速度 快 快 較快 慢分析范圍 常量、微量 微量 常量、微量 常量 發(fā)射光譜 原子吸收光譜 Me、無機物 無機分析對象 有機（無機） 吸收光譜、有機、 少部分有機物 （有機） 無機物大部分 特效性 一般 強 一般 弱Me無機物8結論： 色譜法的分離效能是紅外光譜、核磁和質譜所不及的,而且一般來說色譜法的靈敏度要比紅外光譜高。 色譜法

6、有一個非常大的弱點，就是在缺乏標準樣品的,情況下定性比較困難。而質譜法可以測定未知物的分子量,核磁可以測定分子結構，紅外光譜法可以測定分子中的官能團，這是色譜法所不及的。 以上看出，色譜定性困難（缺乏標樣下），而 質譜 （MS ) 測未知物分子量 核磁 （NMR) 測分子結構 紅外光譜（IR) 測分子中的官能團 色譜、質譜、光譜、聯(lián)用，取長補短，發(fā)展迅速、發(fā)揮更大 的作用。9 1 薄 層 色 譜 薄層色譜又叫薄板層析，是色譜法中的一種，是快速分離和定性分析少量物質的一種很重要的實驗技術，屬固-液吸附色譜，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點，一方面適用于少量樣品（幾到幾微克，甚至0.01微克）的分離；

7、另一方面在制作薄層板時，把吸附層加厚加大，因此，又可用來精制樣品，此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物質。此外，薄層色譜法還可用來跟蹤有機反應及進行柱色譜之前的一種“預試”。101.1層析原理： 利用吸附劑（硅膠、氧化鋁等）對不同組分吸附能力的差異從而達 到分離目的的方法。1.2 薄層層析的作用 （1）分離（0.5g以下） （5）確定組分數 （2）柱層析的先導 （6）定性鑒定 （3）其他分離手段的效果檢測 （7）粗略比較含量 （4）監(jiān)控反應111.3 薄層層析的器材選擇 1.3.1 基板：玻璃、塑料、金屬箔1.3.2吸附劑：（1）種類： 常用：氧化鋁（強極性）、

8、硅膠（中強極性） 不常用：硅藻土、纖維素、糖類、活性碳（2）符號：H無任何添加劑； G加有鍛石膏（Gypsum，CaSO41/2 H2O）粘合劑； F加有熒光素（Fluorescein） CMC加有羧甲基纖維素鈉（3）粒度：顆粒的大小，表示方法有兩種： 目：1cm2內的篩孔數，數目越大，顆粒越小。薄層所用吸附劑顆粒較細，氧化鋁 為200目， 硅膠為100150目。12（4）活性： 吸附劑按其含水量的多少各分為五個等級, I級含水量最少，活性最高；V級含水量最多，活性最低；但并不是活性越高分離效果越好，選用哪種活性級別的吸附劑，要用實驗的方法來確定。 氧化鋁的活化化IV五級，I級的吸附作用太強，

9、V級的吸附作用太弱。所以一般常采用II，III級。 表1 吸附劑活性和含水量的關系活性等級 I II III IV V 氧化鋁加水量/% 0 3 6 10 15 硅膠加水量/% 0 5 15 25 38 13（5）酸堿性： 市售氧化鋁有酸性、中性、堿性，其蒸餾水洗出液的pH值分別為4、7.5、910；其中以中性氧化鋁應用最廣，可用來分離各種化合物，特別是那些對酸、堿敏感的化合物。大體分類如下： 堿性氧化鋁適用于碳氫化合物、生物堿以及其它堿性化合物的分離。 中性氧化鋁應用最廣，適用于醛、酮、醌以及酯類化合物的分離。 酸性氧化鋁適用于有機酸類的分離。 硅膠沒有酸堿性之分141.3.3 展開劑 主要

10、考慮極性、溶解度、沸點等方面，極性大的樣品應選用極性較大的展開劑。溶解應適宜，沸點不宜太高。1.3.4 展開槽與展開 展開槽：臥式、立式、下行式15展開：臥式展開槽傾角15；展開劑用量：浸及下端硅膠，但不浸及樣點點樣端向下，每次只展開一 塊，放在正中，以免爬斜（進而展開傾斜）密閉展開，及時畫出前沿線。1.3.5 測量與計算：1.3.6 顯色： 普適性顯色劑：濃硫酸、碘蒸氣、熒光素 用顯色劑：茚三酮、三氯化鐵溶液等 161.4 操作要點和說明薄層色譜法的整個過程包括以下步驟：1.4.1 薄層板的制備 制薄層板的主要原料是吸附劑和粘結劑吸附劑：最常用于 TLC的吸附劑為硅膠 GF254； 硅膠HF

11、254。粘結劑：一般用所羧甲基纖維素鈉（CMC），也有用淀粉的。CMC為粉狀固 體，用時先加水，水浴上熬成糊狀，配成1水溶液。制板：小板的制備：將硅膠加 1 CMC，調成漿狀（在平鋪玻璃上能晃動但 不能流動），將其涂在載玻片上（ 75 X 25）， 為使其平，可將載玻片 用手端平晃動，致坦平為止，放在干凈平坦的臺面上晾干之后放入110 烘箱活化1小時即可使用（一次可做很多 塊）。17 圖2 薄層板制備181.4.2 點樣 點樣用的毛細管為內徑 lmm的管口平整的毛細管，將樣品溶于低沸點的溶劑（乙醚、丙酮、乙醇、四氫呋喃等）配成1溶液。 點樣前，可先用鉛筆在小板上距一端5mm處輕輕劃一橫線，作為

12、起始線，然后用毛細管吸取樣品在起始線上小心點樣，如需重復點樣，則應待前次點樣的溶劑揮發(fā)后方可重點。若在同一塊板上點幾個樣，樣品點間距離為5mm以上。 圖3 點樣191.4.3展開 展開劑的選擇主要根據樣品的極性、溶解度和吸附劑 的活性等因 素來考慮。 薄層的展開在密閉的容器中進行。先將選擇的展開劑放入色譜器中（小板可用廣口瓶代替），使色譜器內空氣飽和510min，再將點好試樣的薄層板放入色譜器中進行展開，點樣的位置必須在展開劑液面之上，當展開劑上升到薄層的前沿（離前端 510mm）或多組分已明顯分開時，取出薄層板放平晾干，用鉛筆劃溶劑前沿的位置后，即可顯色。20圖4 點樣211.4.4顯色 如

13、果化合物本身有顏色，就可直接觀察它的斑點。如果本身無色，可先在紫外燈光下觀察有無熒光斑點（有苯環(huán)的物質都有），用鉛筆在薄層板上劃出斑點的位置；對于在紫外燈光下不顯色的，可放在含少量碘蒸氣的容器中顯色來檢查色點（因為許多化合物都能和碘成黃棕色斑點），顯色后，立即用鉛筆標出斑點的位置。 圖5顯色221.4.5用 TLC跟蹤有機反應 在同一塊板上點上原料樣和反應混合物樣（均需配成稀溶液），按上述方法進行展開和顯色，記下原料樣的斑點位置和反應混合物樣中相應斑點的位置和大小。過一定時間后，再取反應混合物樣液點樣、展開、顯色，如發(fā)現(xiàn)反應混合液樣中相應于原料斑點的位置處，無斑點或斑點變小，則說明反應已經完成

14、或接近完成，所以依此可跟蹤有機化學反應。這在有機合成上很有意義。23 2 柱 色 譜 柱色譜也叫柱層析分離,就是常說的過柱子。柱色譜按分配原理不同分為吸附色譜和分配色譜兩種。吸附色譜常用氧化鋁和硅膠為吸附劑;分配色譜以硅膠、硅藻土和纖維素為支持劑，以吸收較大量的液體作為固定相.我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。 2.1 吸附柱層析的原理： 混合樣品在淋洗劑攜帶下流經吸附劑反復多次的吸附-解吸溶解 過程極性較大溶解度較小的組分在柱中走過較長的距離,出來的較晚.242.2 柱色譜裝置 柱色譜裝置包括色譜柱、滴液漏斗、接受瓶。 色譜柱有玻璃制的和有機玻璃制的，后者只用于水做展開劑的場合。

15、色譜柱下端配有旋塞，色譜柱的長徑比應不小于7-8:1。 圖5 柱色譜252.3 吸附柱層析的材料選擇2.3.1層析柱 材料：玻璃，塑料薄膜，不銹鋼 尺寸：經長比1:81:50；最常用的約為1:15 細長：分離效果好，但時間長，分離量小，用于分離較難分離的樣品 短粗：分離效果差，但可在較短時間內分離較多樣品，用于較易分離或分離程度要求不高的樣品2.3.2 吸附劑 選擇原則：大體同薄層層析，只是粒度略粗，一般氧化鋁約150 目，硅膠約60100目，不用粘合劑 用量：一般為樣品重量的3050倍，難分離的樣品可達100倍26 常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣和活性炭等。一般多用氧化鋁，商品有

16、專供色譜用氧化鋁.氧化鋁的活化有IV五級，I級的吸附作用太強，V級的吸附作用太弱。所以一般常采用II，III級。 2.3.3 溶質的結構和吸附能力 化合物的吸附性和它們的極性成正比，化合物分子中含有極性較大的基團其吸附性較強。氧化鋁對各種化合物的吸附性按下列順序遞減。 酸、堿醇、胺、硫醇酯、醛、酮芳香族化合物鹵代物、醚烯飽和烴。272.3.4 溶解試樣的溶劑 試樣溶劑的選擇是重要的一環(huán)，通常根據被分離化合物中各種成 分的極性、溶解度和吸附劑活性等來考慮： （1）溶劑要求較純，如氯仿中含有乙醇、水分及不揮發(fā)物質，都會影響試樣的吸附和洗脫。 （2）溶劑和氧化鋁不能起化學反應。 （3）溶劑的極性應比

17、試樣極性小一些，否則試樣不易被氧化鋁吸附。 （4）溶劑對試樣的溶解度不能太大，否則影響吸附；也不能太小，如太小，溶液的體積增加，易使色譜分散。 （5）有時可使用混合溶劑，如有的組分含有較多的極性基團，在極性小的溶劑中溶解度太小，也可先選用極性較大的溶劑溶解。而后加入一定量的非極性溶劑，這樣既降低了溶液的極性，又減少了溶液的體積。282.3.5 淋洗劑 也叫洗脫劑，即流動相。 試樣吸附在氧化鋁柱上后，用合適的溶劑進行洗脫，這種溶劑稱為洗脫劑。如果原來用于溶解試樣的溶劑沖洗柱子不能達到分離的目的，可改用其他溶劑。一般極性較大的溶劑影響試樣和氧化鋁之間的吸附，容易將試樣洗脫下來，達不到將試樣逐一分離

18、的目的。因此常使用一系列極性漸次增大的溶劑。為了逐漸提高溶劑的洗脫能力和分離效果，也可用混合溶劑作為過渡。先用薄層選擇好適宜溶劑。常用洗脫溶劑的極性按以下次序遞增。 己烷、石油醚環(huán)已烷四氯化碳三氯乙烯二硫化碳甲苯苯二氯甲烷三氯甲烷乙醚乙酸乙酯丙酮丙醇乙醇甲醇水吡啶乙酸292.4 吸附柱層析的操作要點2.4.1 裝柱（濕法） （1）稱取適量的吸附劑（中性氧化鋁），在小燒杯中用淋洗劑調成糊狀 （2）豎直安裝層析柱，注入約1/4容積的淋洗劑 （3）取少量脫脂棉，用溶劑潤濕，擠出氣泡，推至柱底（不要塞得太死） （4）旋開活塞，控制1滴/ 秒流速，在攪拌下加入糊狀物，同時輕敲柱身（用洗耳球） （5）加蓋

19、濾紙片（或白沙），關活塞，上扣小燒杯 （6）注意：不許流干，裝成的柱子應無氣泡、無斷層，裝載面平整。 干法裝柱：是在管的上端放一干燥漏斗，使氧化鋁均勻地經干燥漏斗成一細流慢慢裝入管中，中間不應間斷，時時輕輕敲打柱身，使裝填均勻，全部加入后，再加入溶劑，使氧化鋁全部潤濕。另外也可先將溶劑加入管內，約為柱高的四分之三處，而后將氧化鋁通過一粗頸玻璃漏斗慢慢倒入并輕輕敲擊柱身。此法較簡便。 302.3.2 加樣：（1）開活塞，1d / Sec.（2）液面隆至濾紙片，貼壁加入混合樣液0.51ml（要求均勻加樣）（3）液面再降至濾紙片，沿加樣處沖洗柱壁每次約0.5m1，每次都要使 液面隆至濾紙片（4）至柱

20、壁無色時方可加入大量淋洗劑淋洗 2.3.3淋洗和接收：（1）保持流速1d / See（2）換接收瓶 無色溶劑第一色帶空白帶第二色帶無色溶劑（3）接收色帶最濃處12滴供薄層鑒定用31 在洗脫和分離的過程中，應當注意： 連續(xù)不斷地加入洗脫劑，并保持一定高度的液面，在整個操作中勿使氧化鋁表面的溶液流干，一旦流干，再加溶劑，易使氧化鋁柱產生氣泡和裂縫，影響分離效果。收集洗脫液，如試樣各組分有顏色，在氧化鋁柱上可直接觀察。洗脫后分別收集各個組分。在多數情況下，化合物沒有顏色，收集洗脫液時，多采用等份收集，每份洗脫劑的體積隨所用氧化鋁的量及試樣的分離情況而定。一般若用50g氧化鋁，每份洗脫液的體積常為50

21、mL。如洗脫液極性較大或試樣的各組分結構相近似時，每份收集量要小。 要控制洗脫液的流出速度，一般不宜太快，太快了柱中交換來不及達到平衡，因而影響分離效果。由于氧化鋁表面活性較大，有時可能促使某些成分破壞，所以應盡量在一定時間內完成一個柱色譜的分離，以免試樣在柱上停留的時間過長，發(fā)生變化。 322.3.4 后處理： 氧化鋁（用洗耳球）擠入廢物桶，不可倒入水槽中 層析柱（不洗）豎直夾在鐵架臺上 有色溶劑、無色溶劑分別回收2.4操作評定標準： 裝柱情況（裝載面，氣泡，斷層等） 柱中分離情況（色帶前沿清晰，水平，空白帶寬，過渡帶狹窄，無傾斜或 局部前伸）33 3 凝 膠 色 譜凝膠層析又稱分子篩過濾、

22、排阻層析等。它的突出優(yōu)點是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，不需要有機溶劑，并且對分離成分理化性質的保持有獨到之處。對于高分子物質有很好的分離效果。但它也有自己的缺點,其中最主要的是它的峰容量較小以及不能分離具有相同或非常相似大小的分子3.1分離的基本原理： 主要根據溶液中分子體積（流體力學體積）的大小形象的來看，猶如對溶液中所有的組分按分子體積大小進行過篩，在很多情況下有獨特的分離效果343.2 實驗器材的選擇：3.2.1凝膠的選擇: 根據實驗目的不同選擇不同型號的凝膠:（1）如果實驗目的是將樣品中的大分子物質和小分子物質分開，由于

23、它們在分配系數上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用Sephadex G-25和G-50; （2）對于小肽和低分子量的物質（1000-5000）的脫鹽可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4;（3）如果實驗目的是將樣品中一些分子量比較近似的物質進行分離，這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質的凝膠，層析過程中這些物質都能不同程度地深入到凝膠內部，由于Kd不同，最后得到分離。353.2.2凝膠柱尺寸的選擇: 柱的直徑與長度根據經驗，組別分離時，大多采用2-30cm長的層析柱;分級分離時，一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在1-

24、5cm范圍內，小于1cm產生管壁效應，大于5cm則稀釋現(xiàn)象嚴重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對移動慢的物質宜在30-40之間。3.3 操作說明:3.3.1凝膠柱的制備:（1）凝膠溶脹: 凝膠型號選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節(jié)省時間又可消毒。36（2）凝膠的填裝:將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器，柱內充滿洗脫液，將凝膠調成較稀薄的漿頭

25、液盛于柱頂的容器中，然后在微微地攪拌下使凝膠下沉于柱內，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時間，再開始流動平衡，流速應低于層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無“紋路”或氣泡，或加一些有色物質來觀察色帶的移動，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現(xiàn)歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。373.3.2加樣和洗脫:凝膠床經過平衡后，在床頂部留下數亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大于凝膠總床體積的5-10。樣品濃度與分配系數無關，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運動受限，故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2。樣品加入后打開流出口，使樣品滲入凝膠床內，當樣品液面恰與凝膠床表面相平時，再加入數毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預先設計好流速，然后分部收集洗脫