蛋白質(zhì)交聯(lián)方法及其應(yīng)用

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔傾情為你奉上專心專注專業(yè)專心專注專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔傾情為你奉上專心專注專業(yè)蛋白質(zhì)交聯(lián)方法及其應(yīng)用蛋白質(zhì)交聯(lián)系指將小分子物質(zhì)（如藥物、半抗原等）或大分子物質(zhì)(如酶、蛋白毒素等)以共價鍵的方式連接于蛋白質(zhì)分子，以制備人工抗原、酶標(biāo)抗體、載體釋放藥物、抗體導(dǎo)向藥物和免疫毒素等。隨著放射免疫分析法、酶標(biāo)免疫技術(shù)、載體藥物學(xué)和導(dǎo)向物學(xué)的發(fā)展，蛋白質(zhì)交聯(lián)技術(shù)的方法和手段也不斷改進(jìn)和完善，并且在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到愈來愈廣泛的應(yīng)用。蛋白質(zhì)交聯(lián)方法首先發(fā)展于人工抗原的制備研究。自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以來，人們將許多沒有抗原性的小分子物質(zhì)(半抗原)如

2、化學(xué)藥物、神經(jīng)遞質(zhì)和激素等與蛋白質(zhì)或多糖等載體大分子共價結(jié)臺；使其具備抗原性，以誘發(fā)動物產(chǎn)生特異性抗體，用于放射免疫分析等。為了使放射免疫分析達(dá)到靈敏度高、特異性強的要求，前人對半抗原和蛋白質(zhì)連接的方法進(jìn)行了大量的研究，建立了重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二異氰酸酯法及鹵代硝基苯法等交聯(lián)技術(shù)。近10多年來發(fā)展起來的酶標(biāo)免疫檢測技術(shù)，要求制備保持酶的生物活性和抗體的免疫結(jié)合活性的酶抗體偶合物。常用的交聯(lián)方法如戊二醛法、碳二亞胺法和混合酸酐法不可避免地要產(chǎn)生酶或抗體的自身交聯(lián)產(chǎn)物或多聚物，致使交聯(lián)效率降低、結(jié)合物活性減弱。為了克服這一不足，人們發(fā)展了異型雙功能交聯(lián)試劑，如N羥基琥珀酰亞胺3(2吡

3、啶基二硫)丙酸酯，以實現(xiàn)控制交聯(lián)，提高交聯(lián)反應(yīng)的選擇性和交聯(lián)產(chǎn)物的均一性。將藥物與大分子載體連接，制備藥物一載體結(jié)合物，以改善和控制藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運和代謝，實現(xiàn)緩釋給藥和定向給藥，提高生物利用度和治療指數(shù)。這是現(xiàn)代藥物研究領(lǐng)域一個嶄新的分支。載體藥物必須能夠在體內(nèi)定量、定位釋放原型藥物，因此要求設(shè)計pH敏感或特定酶敏感的偶聯(lián)鍵。導(dǎo)向藥物的發(fā)展對蛋白質(zhì)交聯(lián)方法提出了更高的要求。早在1906年，Ehrlich就提出了靶向給藥的設(shè)想。隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，這一設(shè)想不斷得到具體的實現(xiàn)。單克隆抗體作為導(dǎo)向載體的出現(xiàn)，更使導(dǎo)向藥物的研究成為當(dāng)代藥物研究中最活躍和最引人注目的領(lǐng)域之一，而其中研究得最廣泛的是腫

4、瘤治療的抗體導(dǎo)向研究。其載體主要有針對腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)抗原的抗體及其片斷，腫瘤細(xì)胞表面受體的模擬配基。這些載體與藥物或毒素分子連接而成的偶合物，能夠選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，被譽為“生物導(dǎo)彈”。為了最大限度地保持導(dǎo)向載體和藥物彈頭的生物活性，同時實現(xiàn)最大的藥物載運量，人們不斷創(chuàng)新交聯(lián)劑，改進(jìn)交聯(lián)方法，發(fā)展了一批新的各具特性的異型雙功能交聯(lián)劑，提高了導(dǎo)向藥物的有效性和實用性。隨著新的交聯(lián)試劑和交聯(lián)方法的出現(xiàn)，使得放射免疫、酶標(biāo)免疫和導(dǎo)向藥物的研究不斷深入；而后者的發(fā)展又反過來促進(jìn)蛋白交聯(lián)技術(shù)趨于成熟。目前的交聯(lián)方法可以將任一個半抗原或細(xì)胞毒分子以一定方式與載體交聯(lián)，獲得所需的偶合物。下面分別介紹蛋白

5、質(zhì)交聯(lián)中常用的試劑、方法及其應(yīng)用。一、交聯(lián)方法一般說來，蛋白分子中可以用于交聯(lián)的活性基團(tuán)有游離氨基(如賴氨酸的c氨基或末端氨基)、游離羧基(如天冬氨酸殘基，谷氨酸殘基及末端羧基)、苯基(苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)、酚基(酪氨酸)、巰基(半胱氨酸)、羥基(絲氨酸或蘇氨酸)、咪唑基(組氨酸)、吲哚基(色氨酸)或胍基(精氨酸)等。為了避免蛋白質(zhì)變性及其生物活性的損失，藥物或半抗原等與蛋白的交聯(lián)應(yīng)采用具有中等反應(yīng)活性的試劑，在溫和的條件(如接近中性的pH、室溫、水溶液中)進(jìn)行。(一)重氮化法含芳香胺的化合物，可以與亞硝酸反應(yīng)形成重氮鹽，然后直接連接于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸殘基上酚羥基的鄰位，即得以偶氮鍵相

6、聯(lián)的結(jié)合物。這種重氮鹽也能與組氨酸殘基上的咪唑環(huán)或色氨酸殘基的吲哚環(huán)反應(yīng)：本方法副反應(yīng)較多，故一般限于人工抗原的制備。(二)戊二醛法同型雙功能交聯(lián)劑戊二醛的兩個醛基可以分別與兩個相同或不同分子上的伯氨基形成Schiff氏堿，將兩分子以五碳鏈的橋連接起來。戊二醛連接反應(yīng)是最溫和的交聯(lián)反應(yīng)之一，可在440溫度范圍，pH6.08.0的緩沖水溶液中進(jìn)行，但是緩沖組份中不得含有氨基化合物。以硼氫化鈉或氰基硼氫化還原Schiff氏堿可以形成穩(wěn)定的單鍵；根據(jù)對偶聯(lián)鍵的不同要求，還原步驟也可省略。但是，本交聯(lián)方法易形成相同蛋白間的連接；產(chǎn)物的均二性較差。因此，多用于酶標(biāo)抗體的制備。(三)過碘酸鹽氧化法1糖類或

7、含糖基化合物分子中的鄰二醇結(jié)構(gòu)可被過碘酸鈉氧化為醛基，然后與蛋白分子中的氨基形成Schiff氏堿：與戊二醛的交聯(lián)反應(yīng)相似，過碘酸鈉氧化法比較溫和，可在常溫和中性pH的條件下進(jìn)行。這是一個兩步反應(yīng)，第一步生成醛基衍生物后，過量的過碘酸鹽必須除去或消耗后，方可進(jìn)行與蛋白交聯(lián)的第二步反應(yīng)。(四)混合酸酐法半抗原或藥物及其衍生物分子中的羧基可以在三級胺存在下與氯甲酸異丁酯反應(yīng)，生成活潑中間體混合酸酐，然后與蛋白載體上的伯氨基反應(yīng)，形成酰胺交聯(lián)鍵：本反應(yīng)過程簡單，毋需制備和分離中間產(chǎn)物。(五)碳二亞胺法碳二亞胺是一類很強的脫水劑，能使羧基和氨基脫水形成酰胺鍵。在反應(yīng)時，一種分子中的羧基先與碳二亞胺反應(yīng)生

8、成一個加成中間產(chǎn)物，再與另一分子上的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，實現(xiàn)兩者的交聯(lián)：除戊二醛外，碳二亞胺是常見的另一類交聯(lián)劑，最早用于藥物化學(xué)和有機化學(xué)領(lǐng)域；脂溶性的二環(huán)己基碳二亞胺至今仍被廣泛用于多肽合成領(lǐng)域，但其反應(yīng)必須在有機溶劑中進(jìn)行，不適用于蛋白質(zhì)交聯(lián)。水溶性的1乙基3(3二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)等的出現(xiàn)，使這一縮合反應(yīng)成功地用于蛋白質(zhì)交聯(lián)中。本交聯(lián)反應(yīng)條件溫和即使在冷卻條件下，也能于中性pH中進(jìn)行。但是，由于碳二亞胺的縮合反應(yīng)沒有選擇性；易形成蛋白分子間的自身聚合，產(chǎn)生非均一性產(chǎn)物；先將含羧基的藥物或半抗原分子與EDC反應(yīng)，活化羧基后，再加入蛋白反應(yīng)物，可以減少蛋白分子交聯(lián)。(六)活潑

9、酯法2含有羧基的半抗原或藥物在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的作用下，與N羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，生成活潑酯衍生物，后者與載體蛋白上的氨基反應(yīng)，形成以酰胺鍵連接的偶合物：本法是對碳二亞胺法的改進(jìn)：由于避免了碳二亞胺對蛋白的直接作用，從而避免了蛋白分子間的交聯(lián)。活潑酯法在導(dǎo)向藥物的研究中得到廣泛的應(yīng)用。(七)多元酸酐法3半抗原或藥物分子中的羥基或氨基與琥珀酸酐、順烏頭酸酐等在無水吡啶催化下反應(yīng)，形成單酯或單酰胺衍生物，引入游離羧基，然后以活潑酯法或碳二亞胺法與蛋白交聯(lián)：多元酸酐法可以十分方便地將小分子中的羥基或氨基轉(zhuǎn)變?yōu)楹嫌坞x羥基的衍生物，具有較廣的應(yīng)用范圍。但是，與羥基形成的酯健在血漿中不穩(wěn)定；而與氨

10、基形成的酰胺鍵又往往不能充分降解；釋放游離藥物，影響導(dǎo)向藥物的效價。有趣的是，藥物通過顧烏頭酸與蛋白形成的偶合物，在中性pH介質(zhì)(如血漿中)穩(wěn)定，而在酸性pH介質(zhì)中充分解離，釋放活性藥物。由此產(chǎn)生的溶酶體內(nèi)降解性復(fù)合物，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)化后，進(jìn)入溶酶體內(nèi)，在酸性條件下解離。(八)二異氰酸酯法二異氰酸酯類雙功能試劑中的兩個異氰酸基分別與兩個不同分子上的氨基反應(yīng)，介以不同碳鏈長度的橋?qū)烧吲悸?lián)：這類試劑除了能與氨基反應(yīng)形成取代脲外，(在pH7時為主要反應(yīng))，尚能與羥基反應(yīng)形成氨基甲酸酯衍生物；水溶液中的副反應(yīng)(如第二個異氰酸酯基水解產(chǎn)生的胺，能與另一異氰酸酯分子連接)，可能通過疏水作用導(dǎo)致蛋白的聚合。(九

11、)偶氮苯甲酸法對氨基苯甲酸重氮化后，與帶苯環(huán)的半抗原偶聯(lián)引入羧基，再利用羧基的反應(yīng)連接于蛋白上：(十)O羧甲基羥胺法半抗原上的酮基與O羧甲基羥胺反應(yīng)，制備羧甲基肟衍生物。引入的羧基再與載體蛋白的氨基反應(yīng)，形成半抗原蛋白偶合物：(十一)對-肼基苯甲酸法帶酮基的半抗原也可以與對肼基苯甲酸反應(yīng)，引入羧基，再按常法與載體蛋白交聯(lián)；(十二)疊氮化法4羧酸甲酯衍生物經(jīng)肼解、亞硝化，轉(zhuǎn)變?yōu)榀B氯化物，再與載體蛋白上的氨基反應(yīng)：(十三)氯乙酸鈉法半抗原的羥基與氯乙酸鈉反應(yīng)，形成羧甲基醚衍生物，再通過羧基與蛋白交聯(lián)：(十四)亞胺酸酯法雙功能試劑亞胺酸酯類如丙雙亞胺酸二乙酯雙鹽酸鹽可以與半抗原和載體蛋白的氨基交聯(lián)，

12、中間介以一個三碳橋：亞氨酸酯類水溶性良好，反應(yīng)條件溫和，與氨基的反應(yīng)選擇性高，這類試劑的最大特點是，可與蛋白分子上的賴氨酸殘基廣泛反應(yīng)，而不影響蛋白分子的凈電荷改變。具有不同碳鏈長度的亞氨酸酯可將半抗原間以一定距離與蛋白連接。(十五)鹵代硝基苯法雙功能試劑二硝基二氟苯或二氟二硝基苯砜分子中的氟原于，由于鄰近硝基的活化作用，易和半抗原或載體蛋白上的親核基團(tuán)如氨基、羥基、巰基等反應(yīng)：(十六)Mannich反應(yīng)法酮、酚類半抗原，可以用Mannich反應(yīng)引入羧基，然后與常法與蛋白交聯(lián)；(十七)苯醌法交聯(lián)過程分兩步進(jìn)行，第步反應(yīng)完成后，分離除去過量試劑，再進(jìn)行第二步反應(yīng)。(十八)E11man試劑法5E1

13、1man試劑即55二硫2，2雙硝基苯甲酸(DTNB)，該試劑可以與巰基作用，交聯(lián)反應(yīng)分兩步進(jìn)行：本法用于游離巰基的保護(hù)和活化，以便與游離巰基的另一蛋白分子進(jìn)行巰基交換反應(yīng)。(十九)馬來酰亞胺基類活潑酯法馬來酰亞胺基結(jié)構(gòu)中的雙鍵比較活潑，可與游離巰基進(jìn)行選擇性加成反應(yīng)。馬來酰亞胺基取代羧酸衍生物的N-羥基琥珀酰亞胺酯試劑與含氨基的藥物或蛋白反應(yīng)，引入馬來酰亞胺基，與另含有游離巰基的分子通過巰基對雙鍵的加成反應(yīng)連接起來。這是一組異型雙功能交聯(lián)劑，常用的有N羥基琥珀酰亞胺基間(N馬來酰亞胺基)-苯甲酸酯（SMB），N羥基琥珀酰亞胺4(N馬來酰亞胺基) -苯丁酸酯（SMPB）等。(二十)SPDP試劑法

14、6異型雙功能交聯(lián)劑N-羥基琥珀亞胺基-3(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)可以通過其分子中的活潑酯組份與氨基反應(yīng)，也可以通過2吡啶二硫基團(tuán)與脂肪硫醇反應(yīng).SPDP能夠于蛋白分子中引入巰基，然后利用巰基交換反應(yīng)或巰基加成反應(yīng)與另一分子交聯(lián)：這是目前較為常用的一種交聯(lián)劑，交聯(lián)反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)較少，能夠定量地于蛋白分子中引入保護(hù)的巰基，且能夠方便地測定其含量。同類的交聯(lián)劑尚有N羥基琥珀酰亞胺(4a甲基a(2吡啶基二硫代甲基)苯甲酸酯(SMPT)7和N羥基琥珀酰亞胺3(2毗啶二硫)丁酸酯(SPDBt8)。通過在二硫鍵的a位引入位阻性基團(tuán)如甲基，可以增加交聯(lián)物中二硫鍵的穩(wěn)定性。(二十一)苯丁酸氮芥

15、衍生物法9苯丁酸氮芥的N羥基琥珀酰亞胺基酯或混合酸酐衍生物分子中的活性羧基和氮芥基可以分別與兩個蛋白分子中的氨基反應(yīng)，將兩者連接起來：在中性及微堿性pH條件下,氮芥基傾向于與巰基反應(yīng)，而在較高pH時傾向于與氨基反應(yīng)。(二十二)鹵代乙酰衍生物法鹵代乙酸的活潑酯衍生物如N羥基琥珀酰亞胺基碘代乙酸酯分子中的活潑酯成分和位活潑鹵素可以分別與蛋白分子中的巰基及氨基反應(yīng)，實現(xiàn)兩種分子的交聯(lián)：本交聯(lián)反應(yīng)迅速，具有較高選擇性，形成的硫醚鍵在血漿中十分穩(wěn)定。(二十三)雙馬來酰亞胺試劑法10這類試劑的代表為N,N鄰苯基雙馬來酰亞胺，可以連接兩個含巰基的分子。這是一類比較溫和的交聯(lián)劑，具有較高的反應(yīng)選擇性，但是易形

16、成同類分子的交聯(lián)產(chǎn)物。(二十四)三氯三嗪試劑法三氯三嗪分子可以與含羥基的分子反應(yīng),剩余的第二個氧原子活性稍低，可為蛋白分子上的氨基取代，實現(xiàn)兩分子的交聯(lián)：必須注意，第一個分子中不能含有氨基及巰基等親核性較強的基團(tuán)，否則，易形成自身聚合。二、交聯(lián)方法的選擇及偶合物的設(shè)計 如上所述，蛋白質(zhì)交聯(lián)方法的類型繁多，雖然能夠滿足各方面的需要，但也增加了使用者選擇的困難。評價某一交聯(lián)方法時，應(yīng)該考慮以下有關(guān)因素：交聯(lián)反應(yīng)的效果，如交聯(lián)產(chǎn)物組成的均一性;交聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)率;交聯(lián)過程對生物活性的影響；交聯(lián)操作的簡便性；交聯(lián)產(chǎn)物純化的難易；交聯(lián)反應(yīng)結(jié)果的可重復(fù)性；偶合物的使用目的。理想的交聯(lián)方法應(yīng)該保證結(jié)合物得率較高

17、，結(jié)合物的組成均一，結(jié)合比合適，最大限度地保持生物活性，操作方便，純化容易；在同樣條件下，重復(fù)性好。然而，目前還沒有一種交聯(lián)方法能夠同時滿足上述要求。由此，必須根據(jù)結(jié)合物的使用目的，權(quán)衡不同方法的優(yōu)缺點來選擇合適的交聯(lián)方法；最好同時使用幾種交聯(lián)方法進(jìn)行比較，擇其優(yōu)者而用之。在人工抗原的制備中，主要要求制備的人工抗原保持半抗原的結(jié)構(gòu)特異性；所用交聯(lián)方法不要明顯改變半抗原結(jié)構(gòu)，要保留抗原決定簇。必要時可在半抗原與載體之間引入一定碳鏈長度的橋結(jié)構(gòu)，暴露抗原決定簇，以利于產(chǎn)生針對半抗原的抗體。影響人工抗原的免疫效果的另一重要因素是每分子載體上結(jié)合的藥物分子數(shù)。一般認(rèn)為藥物結(jié)合量越大越好，但最佳結(jié)合比也

18、取決于半抗原的本質(zhì)及載體的性質(zhì)。由于抗體的特異性主要針對半抗原分子中遠(yuǎn)離偶聯(lián)鍵的結(jié)構(gòu)，因此，在設(shè)計人工抗原結(jié)合物時，應(yīng)選擇遠(yuǎn)離半抗原特征結(jié)構(gòu)的基團(tuán)進(jìn)行交聯(lián)。例如，與抗睪酮17牛血清白蛋白相比，抗睪酮3牛血清白蛋白能夠更好地識別類似結(jié)構(gòu)的甾體化合物。通過橋結(jié)構(gòu)將載體蛋白連接于抗原分子中非生物特異性的位置如雌激素的C6位，黃體酮的C6或C11位，制備的人工抗原結(jié)合物具有更好的特異性。由這些結(jié)合物產(chǎn)生的抗體能夠識別半抗原的所有結(jié)構(gòu)特征。相應(yīng)地，抗半抗原的抗體對結(jié)合部位或鄰近結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)變化是不敏感的，如3-羧甲基嗎啡蛋白結(jié)合物誘生的抗體不能區(qū)分嗎啡和可待因11。還原青蒿素蛋白結(jié)合物所誘生的抗體可以

19、用于測定青蒿素、蒿甲醚及青蒿酯12。而通過不同方法制備的安定的兩種蛋白偶合物所產(chǎn)生的抗體，都能特異性地識別安定。這些性質(zhì)給人工抗原的制備帶來極為有利的條件，人們可以適當(dāng)改變半抗原結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)或引入交聯(lián)活性基團(tuán)，使制備人工抗原的方法更加多樣化。對于酶標(biāo)抗體的制備，最重要的是同時保持酶和抗體的生物學(xué)活性，制備化學(xué)組份均一的結(jié)合物。異型雙功能交聯(lián)試劑的應(yīng)用，基本實現(xiàn)了交聯(lián)反應(yīng)的控制進(jìn)行，減少或避免了自身聚合和交叉聚合，保證了交聯(lián)產(chǎn)物的有效性。對于載體藥物，首先要求其能夠在體內(nèi)定量或定位地釋放出具有生物活性的游離藥物。為此，連接藥物與載體的偶合鍵必須能夠在一定條件下以一定速度解離，而且解離速度能夠通

20、過pH的改變或體內(nèi)不同組織小環(huán)境的差異(如酶的種類或活性)得到調(diào)控,以達(dá)到定向給藥的目的；在制備載體藥物結(jié)合物時，對藥物分子的結(jié)構(gòu)不宜作永久性的改變，以免引起生物活性的改變；其次還要求每一載體能結(jié)合足夠量的藥物分子，以保證給藥的效率。在抗體導(dǎo)向藥物的設(shè)計和制備中應(yīng)該考慮以下幾點：細(xì)胞毒分子抗體偶合物在到達(dá)作用部位以前保持穩(wěn)定，在血漿中不被降解；結(jié)合物的特異性能夠反映載體的特異性，即具有原載體的專一性識別和結(jié)合作用；結(jié)合物到達(dá)作用部位以后，能以某種方式進(jìn)入細(xì)胞，發(fā)揮藥理作用，即結(jié)合物本身具有細(xì)胞毒活性或結(jié)合物進(jìn)入細(xì)胞后能夠釋放活性形式的藥物。因此，對細(xì)胞毒分子中藥物活性所必需的部位不宜作不可逆化

21、學(xué)修飾，而且偶聯(lián)鍵要遠(yuǎn)離活性部位，以避免立體位阻對生物活性的影響。如甲氨蝶呤分子中的蝶呤部分對二氫葉酸還原酶有高度的親和性，是抗代謝活性的必需結(jié)構(gòu)，對其進(jìn)行任何改變，均可導(dǎo)致藥物活性的喪失；但是，遠(yuǎn)離蝶呤的谷氨酸殘基，對酶抑制活性影響不大，可以用作交聯(lián)基團(tuán)。又如將細(xì)胞毒分子連接于抗體分子中遠(yuǎn)離抗原結(jié)合位點的Fc區(qū)，可以最大限度地保持抗體活性13。利用血漿與溶酶體pH的差別，設(shè)計pH敏感的偶聯(lián)鍵，制備藥物載體偶合物，可以實現(xiàn)藥物的控制釋放14,15。如柔紅霉素通過順烏頭酸與蛋白形成的結(jié)合物，在生理pH時穩(wěn)定；而進(jìn)入細(xì)胞后，可以在溶酶體的酸性條件(pH45)下解離，釋放柔紅霉素原型藥物分子，發(fā)揮細(xì)

22、胞毒作用14。不論使用哪種蛋白載體，其所能提供的交聯(lián)基團(tuán)是相似的。因此，交聯(lián)方法的選擇以及交聯(lián)物的設(shè)計主要取決于半抗原或藥物分子上的功能團(tuán)結(jié)構(gòu)，下面就根據(jù)這些功能團(tuán)的分類，分別討論不同交聯(lián)方法的應(yīng)用。()羧基藥物或其衍生物分子上的羧基可以通過碳二亞胺法、混合酸酐法等與蛋白上的氨基形成酰胺鍵，其中碳二亞胺法在這類化合物的偶聯(lián)反應(yīng)中的應(yīng)用最為廣泛。血管緊張素和緩激肽、促胃液素、嗎啡、前列腺素、托普霉素、1BE阿糖呋喃胞嘧啶、強的松21琥珀酸半酯等均可在水溶性碳二亞胺EDC的作用下，與蛋白或多聚氨基酸等載體結(jié)合，制備人工抗原。許多含羧基的抗腫瘤藥物如甲氨蝶呤2、苯丁酸氮芥、柔紅霉素3的二元酸單酯衍生

23、物、絲裂霉素C戊二酸單酯16、新制癌菌素17和磷酸酯酶C等均可在EDC作用下與抗體偶聯(lián)，制備抗體導(dǎo)向偶合物。同時含有氨基和羧基的小分子，可以先將氨基保護(hù)后，再用羧基與載體交聯(lián)，以避免自身縮合，交聯(lián)反應(yīng)完成后再脫保護(hù)，游離氨基。不溶于水的藥物可先以二甲基甲酰胺溶解，然后再加于蛋白水溶液中，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。為了減少蛋白分子間的自身聚合，可以先將藥物分子上的羧基轉(zhuǎn)化為N羥基琥珀酰亞胺的活潑酯，然后再與抗體交聯(lián)。例如，將絲裂霉素C戊二酸單酯轉(zhuǎn)化為活潑酯后，再與抗體交聯(lián)，可以提高蛋白回收率和產(chǎn)品的均一性，更好地保持抗體活性18。類似地，可以制備D，L10，11環(huán)氧麝子油酸及蛻皮激素的人工抗原結(jié)合物?；旌纤?/p>

24、酐法也能用于形成酰胺鍵。通過混合酸酐法與蛋白載體交聯(lián)的半抗原有考的松21琥珀酸半酯、尿核苷5磷酸、睪酮17琥珀酸半酯、3O琥珀酰毛地黃毒甙配基、膽酸、甲狀腺素及利血平等。藥物及半抗原的羧酸酯、活潑酯或酸酐衍生物可以與肼反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為相對穩(wěn)定的酰肼物。后者在水性介質(zhì)中，很容易和蛋白分子上的醛基或酮基(由高碘酸鈉氧化IgG分子上的糖殘基產(chǎn)生)反應(yīng)，形成腙結(jié)構(gòu)的結(jié)合物。此外，藥物分子中的羧基還可以轉(zhuǎn)變?yōu)轷；B氮衍生物，然后再與蛋白分子上的氨基反應(yīng)，形成以酰胺鍵連接的結(jié)合物，?；B氮衍生物可以由酰肼與冷的亞硝酸反應(yīng)制備，也可以通過酰氯與疊氮鈉反應(yīng)產(chǎn)生。通過這種方法與蛋白交聯(lián)的有阿斯匹林、去乙酰長春花堿、

25、甲狀腺素等。(二)氨基含氨基的半抗原及藥物可以分為兩類，即芳香胺類和脂肪胺類。這兩類胺的交聯(lián)方法有所不同，下面分別討論。許多芳香胺類的化合物可以在低溫條件下與亞硝酸反應(yīng)形成重氮鹽，然后與載體蛋白分子上的酪氨酸或組氨酸殘基反應(yīng)，形成以偶氮鍵交聯(lián)的結(jié)合物。芳香環(huán)上含硝基的化合物如氯霉素，可將硝基還原為氨基后，再制備重氮鹽，與蛋白載體結(jié)合。但是，重氮鹽交聯(lián)法存在難以克服的副反應(yīng)，可導(dǎo)致蛋白大量沉淀；而且，與重氮鹽反應(yīng)的酪氨酸和組氨酸殘基多存在于IgG分子中抗原結(jié)合區(qū)及其附近，因此交聯(lián)反應(yīng)易導(dǎo)致抗體活性的損失。所以這一方法一船不用于抗體導(dǎo)向藥物的制備中。脂肪胺類化合物可以在水溶性碳二亞胺作用下，與載體

26、蛋白上的羧基結(jié)合。用此方法連接的半抗原有緩激肽、血管緊張素、托普霉素、慶大霉素、阿霉素、5-羥色胺及精脒等。脂肪胺還可以與一硝基苯甲酰氯反應(yīng)，形成對-硝基苯甲酰衍生物，再將硝基還原為氨基后，通過重氮化與載體蛋白結(jié)合，以此法交聯(lián)的半抗原有煙草花葉病病毒蛋白及血管緊張素等。通過雙功能交聯(lián)劑苯甲基二異氰酸酯將胺類化合物與蛋白上的氨基連接，可以制備緩激肽的人工抗原結(jié)合物。藥物分子上的胺基還可以通過戊二醛試劑與蛋白分子上的氨基結(jié)合，由此可以制備促腎上腺皮質(zhì)激素、高血糖素及支甲腎上腺素等到的人工抗原結(jié)合物和阿霉素-抗菌素體導(dǎo)向偶合物44。以上交聯(lián)方法均是利用同型雙功能交聯(lián)劑連接兩分子上的氨基。在交聯(lián)過程中

27、，不可避免地會形成部分相同分子間的聚合產(chǎn)物。為了達(dá)到控制交聯(lián)的目的，可以利用多元酸酐法，于含氨基的半抗原分子上引入游離羧基,然后再以活潑酯法或碳二亞胺法與蛋白交聯(lián)。如先將柔紅霉素與琥珀酸酐或順烏頭酸酐反應(yīng)，再利用引進(jìn)的羧基與抗體上的氨基反應(yīng)，形成抗體導(dǎo)向偶合物8。也可以通過與SPDP反應(yīng)，于半抗原分子上引入巰基，利用巰基反應(yīng)與抗體交聯(lián)。(三)羥基含有羥基的半抗原分子包括醇類、酚類、糖類及核苷酸類。在這類化合物的交聯(lián)中，通常先要制備其衍生物，以引進(jìn)能夠與蛋白反應(yīng)的功能團(tuán)。例如，甾體化合物可以通過與琥珀酸酐反應(yīng)，形成琥珀酸單酯衍生物，然后按羧基交聯(lián)方法與蛋白偶聯(lián)。按照類似方法可以制備環(huán)腺苷酸、雌酮

28、、Bdl美沙醇、3羥基氯硝安定、蛻皮甾酮、心得安、A9四氫大麻酚及1BD阿糖呋喃胞苷的蛋白結(jié)合物。也可以將醇羥基與光氣反應(yīng)，制備高度反應(yīng)活性的氯甲酸酯，然后在碳酸氫鹽存在下與蛋白分子上的氨基交聯(lián)。三氯三嗪或羧甲基取代的二氯三嗪試劑可以連接藥物分子上的羥基與蛋白分子上的氨基，交聯(lián)分兩步進(jìn)行，羥基化合物先與三嗪試劑反應(yīng)，形成醚衍生物；剩余的取代氯反應(yīng)活性較差，不能再羥基取代，但可與親核性較強的蛋白氨基反應(yīng)，由此形成通過三嗪核偶聯(lián)的結(jié)合物。雙功能交聯(lián)劑鹵代硝基苯也可以用于連接藥物分子上的羥基和蛋白分子上的氨基。酚類化合物可以通過與重氮化的-氨基苯甲酸反應(yīng)，引入羧基，然后利用羧基反應(yīng)與蛋白交聯(lián)。這一類

29、型的反應(yīng)被成功地用于制備17，B雌二醇及()7- 四氫大麻酚的人工抗 原結(jié)合物。具有鄰二醇結(jié)構(gòu)的核苷或核苷酸類化合物，可用高碘酸鹽氧化出醛基，后者可以與蛋白分子上的氨基反應(yīng)形成Schiff氏堿，以硼氫化鈉還原后即可得到穩(wěn)定的以碳氮單應(yīng)過程中，毋需分離中向產(chǎn)物，本法成功地用于制備地高辛及G-毒毛旋花子甙的蛋白結(jié)合物。改進(jìn)法被用于制備堿敏感性的核苷及核苷酸結(jié)合物。用高碘酸鹽氧化法制備的抗體導(dǎo)向偶合物有柔紅霉素右旋糖苷抗體結(jié)合物及柔紅霉素抗體 偶合物。后者是通過氧化右旋糖苷上的鄰二醇為醛基，利用醛基分別連接藥物和抗體分子上的氨基制備而成。但本法也可以產(chǎn)生副產(chǎn)物，而且硼氫化還原可能破壞藥物結(jié)構(gòu)，影響藥

30、物活性19.用高碘酸鈉氧化抗體IgG分子Fc端的糖基，利用生成的醛基與氨基化合物交聯(lián)。這樣，將細(xì)胞毒組份區(qū)域選擇性地連接于遠(yuǎn)離抗原結(jié)合位點的Fc端，可以更好地保持抗體活性。(四)羰基醛基化合物如吡哆醛及毗哆醛磷酸酯可以通過與蛋白分子上的氨基形成Schiff氏堿，實現(xiàn)與蛋白的交聯(lián)。醛或酮均可以通過與O羧甲基羥胺反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為O羧甲基肟衍生物,引入一個羧基，通過形成酰胺鍵與蛋白交聯(lián)。以這種方法交聯(lián)的半抗原分子有睪酮、孕酮、雌酮及18乙基炔諾酮。醛固酮及考的松等與對肼基苯甲酸反應(yīng)，再利用引入的羧基與牛血清白蛋白交聯(lián)。在羰基的。位引入一個鹵素原子，再與蛋白分子中的氨基反應(yīng)，可形成碳氮單鍵交聯(lián)的產(chǎn)物。如14溴代柔紅霉素在微堿性條件可與蛋白IgG結(jié)合，形成抗體導(dǎo)向偶合物20。(五)巰基青霉烯酸分子上的巰基，可以與蛋白分子中引入的巰基反應(yīng)，形成以二硫鍵交聯(lián)的結(jié)合物。6，溴孕酮及14溴代柔紅霉素3可以與蛋白