細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)血液檢驗(yàn)的課件

1、第二節(jié) 細(xì)胞化學(xué)染色檢驗(yàn)本節(jié)主要內(nèi)容：一、鐵染色二、中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色三、過氧化物酶染色掌握細(xì)胞化學(xué)染色臨床應(yīng)用掌握各種細(xì)胞化學(xué)染色的原理及臨床意義熟悉各種細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果判斷及正常血細(xì)胞染色反應(yīng)了解細(xì)胞化學(xué)染色的基本步驟要求：一、概念 細(xì)胞化學(xué)染色是細(xì)胞學(xué)和化學(xué)相結(jié)合而形成的一門科學(xué)。它以細(xì)胞形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合運(yùn)用化學(xué)反應(yīng)的原理對(duì)血細(xì)胞內(nèi)的各種化學(xué)物質(zhì)(酶類/脂類/糖類/鐵/蛋白質(zhì)/核酸等)作定性、定位、半定量分析的方法。第一部分 概 述二、必要性從形態(tài)學(xué)觀察，存在較多的主觀性；有些原始細(xì)胞形態(tài)較相似，難以鑒別；結(jié)合細(xì)胞化學(xué)染色，提高疾病的診斷率。三、臨床應(yīng)用 1. 輔助判斷急性白血病

2、的細(xì)胞類型 2. 輔助血液系統(tǒng)疾病的診斷和鑒別 診斷 3. 觀察疾病的療效和預(yù)后 4. 疾病發(fā)病機(jī)制的探討 白血病的診斷：MICM分型 M：morphology I：immunology C：cytogenitics M：molecular biology形態(tài)學(xué)分型：進(jìn)行初步的診斷免疫學(xué)分型：明確細(xì)胞種類細(xì)胞遺傳學(xué)分型：與疾病預(yù)后有關(guān)分子生物學(xué)分型：提高到分子水平四、基本步驟（1）物理法：干燥、火焰（2）化學(xué)法： A、蒸氣固定： B、液體固定：甲醛、乙醇、甲醇。 1. 固定（1）偶氮偶聯(lián)法：酯酶染色（2）聯(lián)苯胺法：POX（3）普魯士藍(lán)反應(yīng)：Fe（4）雪夫反應(yīng)：PAS（5）金屬沉淀法：NAP（6

3、）物理顯色法：SBB2. 顯示：有色沉淀反應(yīng)鐵染色-中性紅、伊紅PAS-甲基綠3. 復(fù)染：使各種細(xì)胞能顯示出來核：中性紅、甲基綠、沙黃等。漿：伊紅、剛果紅、光綠等。 第二部分 具體細(xì)胞化學(xué)染色方法 鐵染色(Ferric stain) 骨髓中的貯存鐵主要存在于骨髓小粒(外鐵)和幼紅細(xì)胞(內(nèi)鐵)中；檢測(cè)采用普魯氏藍(lán)反應(yīng)。一、原 理 4Fe3+ + 3K4Fe(CN)6 Fe4Fe(CN)63 + 12K+ 含鐵物質(zhì) 亞鐵氰化鉀 亞鐵氰化鐵酸性二、結(jié)果判斷1. 細(xì)胞外鐵(骨髓小粒含鐵血黃素)鐵顆粒、鐵小珠、鐵團(tuán)塊細(xì)胞外鐵(低倍鏡觀察)（）：無顆粒（）：有少量鐵顆粒或偶見鐵小珠（）：有較多的鐵顆?；蜩F

4、小珠（）：有很多的鐵顆粒、鐵小珠 和少數(shù)鐵小塊（）：有極多鐵顆粒、小珠和 很多鐵小塊，密集成堆。+（1）分級(jí)(按鐵顆粒數(shù)量的多少及大小) 細(xì)小顆粒：細(xì)沙樣鐵小粒，不易看清。 粗大顆粒：很容易看清的顆粒。（2）陽性率 觀察100個(gè)中晚幼紅細(xì)胞，計(jì)算出鐵 粒幼紅細(xì)胞的百分比。2. 細(xì)胞內(nèi)鐵(中晚幼紅細(xì)胞，油鏡觀察) 細(xì)胞內(nèi)鐵(油鏡觀察幼紅細(xì)胞)型：12個(gè)小鐵顆粒；型： 35個(gè)小鐵顆粒； 型： 610個(gè)小鐵顆?；?4個(gè)大顆粒； 型： 10個(gè)以上小鐵顆?；?個(gè)以上大顆粒。 環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞(ringed sideroblast) 幼紅細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)鐵顆粒6個(gè)，圍繞 核周1/2以上者。 鐵粒幼紅細(xì)胞(sid

5、eroblast)： 胞質(zhì)中出現(xiàn)藍(lán)色鐵顆粒的幼紅細(xì)胞。 鐵粒紅細(xì)胞(siderocyte)： 胞質(zhì)中出現(xiàn)藍(lán)色鐵顆粒的成熟紅細(xì)胞。綠色箭頭示：環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞；藍(lán)色箭頭示：鐵粒紅細(xì)胞1. 細(xì)胞外鐵： （ + ） （ + ）2. 細(xì)胞內(nèi)鐵：鐵粒幼紅細(xì)胞陽性率大約 1944%， III型（ I型為主），無 型、型、環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞及鐵粒 紅細(xì)胞。三、參考范圍四、臨床意義1. 缺鐵性貧血： 外鐵（），內(nèi)鐵15%。4. 非缺鐵性貧血：溶貧、巨幼貧、再障、 白血病等，內(nèi)外鐵常增多。5. 感染、肝硬化、慢性腎炎、血色病等： 外鐵增多。五、應(yīng)用評(píng)價(jià) 鐵染色是臨床常用的一種細(xì)胞化學(xué)染色，雖不如血漿鐵蛋白敏感，但

6、是反映機(jī)體儲(chǔ)存鐵的金標(biāo)準(zhǔn)。 外鐵：反映骨髓中鐵的儲(chǔ)存量；內(nèi)鐵：反映骨髓中可利用的鐵量。 中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色neutrophilic alkaline phosphatase （NAP）-磷酸萘酚鈉-萘酚+磷酸鈉NAPPH9.6-萘酚+重氮鹽不溶性沉淀定位于胞質(zhì) Kaplow偶氮偶聯(lián)法：一、原 理二、正常血細(xì)胞染色反應(yīng)NAP主要存在于成熟的中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中。嚴(yán)重的化膿性感染時(shí)，晚幼階段粒細(xì)胞也可見有陽性反應(yīng)。其他細(xì)胞基本呈陰性反應(yīng)。三、結(jié)果判斷及參考范圍 1. 結(jié)果判斷：出現(xiàn)深褐色顆粒的量及密度 NAP染色反應(yīng)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)：（）：胞質(zhì)中無顆粒；（）：胞質(zhì)含少量顆粒，約占1/4；（）：胞質(zhì)含中等

7、量顆粒，約占1/2； （）：胞質(zhì)含較多顆粒，約占3/4； （）：胞質(zhì)充滿顆粒，無空隙。+EOS 鈣 鈷 法 NAP染色結(jié)果報(bào)告包括陽性率和積分值。 陽性率：指計(jì)數(shù)100個(gè)中性成熟粒細(xì)胞，其陽性細(xì)胞的數(shù)量即為陽性率；積分值：指計(jì)數(shù)100個(gè)中性成熟粒細(xì)胞，不同陽性程度細(xì)胞數(shù)量乘以其陽性程度之和即為積分值，其計(jì)算公式為：積分值=()數(shù)量1 +()數(shù)量2 +()數(shù)量3 +()數(shù)量4。 2. NAP染色結(jié)果報(bào)告： 3. 參考范圍： 中性粒細(xì)胞NAP陽性率：40% NAP積分為： 30130分NAP染色結(jié)果既報(bào)陽性率又報(bào)積分值。四、臨床意義1.生理性變化：應(yīng)激狀態(tài)、妊娠、新生兒等。 2.病理性變化： (1

8、)NAP：細(xì)菌性感染、慢粒(加、急)、急 淋、慢淋、惡性淋巴瘤、轉(zhuǎn)移癌、 骨纖、真紅、再障、原發(fā)性血小 板增多癥、使用糖皮質(zhì)激素等。3. 疾病的鑒別： (1) 類白與慢粒: 前者 后者 (2) 慢粒慢性期與慢性中性粒細(xì)胞白血病： 前者 后者 (3) 細(xì)菌性感染與病毒性感染/寄生蟲感染： 前者 后兩者正?；?2)NAP：慢粒(慢)、PNH、MDS、惡組等。(6) 惡組與反應(yīng)性組織細(xì)胞增多癥： 前者 后者常(7) 急性白血病類型： 急性髓細(xì)胞 急淋(4) 慢粒病情觀察： (5) 再障與陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿： 前者 后者CML類白五、應(yīng)用評(píng)價(jià) NAP染色有多種檢測(cè)方法，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦 Kap

9、low萘酚AS-BI磷酸鈉法和Tomonaga萘酚AS-MX 磷酸鈉法。鈣-鈷法試劑成本低廉，操作繁瑣，反應(yīng) 時(shí)間長(zhǎng)，臨床上逐步被偶氮偶聯(lián)法取代，陽性產(chǎn)物色 澤鮮明、定位精確，尤其以萘酚AS-BI磷酸鈉法最為 廣泛使用，利于評(píng)定NAP活性強(qiáng)度的分級(jí)。常用重氮 鹽有堅(jiān)牢藍(lán)RR、堅(jiān)牢藍(lán)BB、堅(jiān)牢紫醬等，不同偶聯(lián) 有不同的靈敏度。 過氧化物酶染色 (peroxidase，POX)一、原 理 粒細(xì)胞和部分單核細(xì)胞的溶酶體顆粒中含有過氧化物酶(POX)，它可分解H2O2釋放出新生態(tài)的氧，后者氧化二氨基聯(lián)苯胺，形成金黃色不溶性沉淀，定位于胞質(zhì)內(nèi)酶活性部位。 二氨基聯(lián)苯胺法二鹽酸聯(lián)苯胺法二、結(jié)果判斷 在細(xì)胞

10、質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)金黃色顆粒為陽性反應(yīng)。二氨基聯(lián)苯胺法二鹽酸聯(lián)苯胺法 復(fù)方聯(lián)苯胺法三、正常血細(xì)胞的染色反應(yīng) 1. 粒細(xì)胞系統(tǒng)： 原始粒細(xì)胞（）或（+） 早幼粒以下細(xì)胞均（+），陽性逐漸增強(qiáng)。 中性分葉核粒細(xì)胞：強(qiáng)陽性 嗜酸粒細(xì)胞：陽性最強(qiáng) 嗜堿粒細(xì)胞：（）2. 單核細(xì)胞系統(tǒng)：（）或弱（+），陽性顆粒少而細(xì)小。3. 其它系統(tǒng)細(xì)胞： 淋巴細(xì)胞系統(tǒng)、紅細(xì)胞系統(tǒng)、巨核細(xì)胞系統(tǒng)、漿細(xì)胞、組織細(xì)胞（）。 四、臨床意義主要用于鑒別急性白血病的類型（1）急淋和急性髓細(xì)胞系的鑒別：急淋：（），陽性率3%；急單：弱陽性；急粒：陽性（ + + + + ）。 ALLALL原粒陰性原粒弱陽性原粒陽性 早幼粒 強(qiáng)陽性 （2）鑒別診

11、斷： a. 小原粒（+）與原淋（） b. 急性早幼粒白血病(+)與急單（+） c. 急單（+）與組織細(xì)胞白血病、 惡性組織細(xì)胞?。ǎ┮弧⒃?蘇丹黑B是一種脂溶性重氮染料，可溶解細(xì)胞內(nèi)含脂結(jié)構(gòu)(中性脂肪、磷脂、糖脂和類固醇)，而使脂類物質(zhì)顯示出來，呈棕黑色或深黑色(粒細(xì)胞：豐富；單核細(xì)胞：少量)。 蘇丹黑染色（Sudan black B，SBB）二、SBB與POX區(qū)別： POX特異性高于SBB，而敏感性 低于SBB；2. SBB步驟較繁瑣。過碘酸-雪夫反應(yīng)(糖原染色) periodic acid-Schiff reaction(PAS) 過碘酸是氧化劑，使含有乙二醇基的多糖類物質(zhì)(糖原、糖蛋白

12、、糖脂、粘多糖等)氧化，形成雙醛基。醛基與Schiff s液中的無色品紅結(jié)合，使無色品紅變成紫紅色化合物，定位于含多糖類的細(xì)胞內(nèi)。一、原理 1. 粒細(xì)胞系統(tǒng)：（陽性逐漸增強(qiáng)） 原始粒C（）或（+） 早幼粒C成熟中性粒C（+）： 細(xì)顆粒均勻紅色 嗜酸粒C：顆粒不著色，胞質(zhì)呈紅色。 嗜堿粒C：顆粒陽性，胞質(zhì)不著色。 二、正常血細(xì)胞的染色反應(yīng)2.單核細(xì)胞系統(tǒng)：分化差（）其他（+）， 細(xì)顆粒狀。3.淋巴細(xì)胞系統(tǒng)：多數(shù)（）少數(shù)（+）， 粗顆?；驂K狀。4.紅細(xì)胞系統(tǒng)：（），病理情況可（+）。5.巨核細(xì)胞系統(tǒng)：（+），顆粒狀或塊狀。6.其它細(xì)胞：漿細(xì)胞（），巨噬細(xì)胞（+）a 粒細(xì)胞、b 巨核細(xì)胞、c 單核細(xì)

13、胞、d 幼紅細(xì)胞三、結(jié)果判斷1. 粒細(xì)胞系統(tǒng)： 紅色、彌散狀。各種細(xì)胞陽性反應(yīng)強(qiáng)弱不同 2. 淋巴細(xì)胞系統(tǒng)： 粗顆粒狀、小塊狀、大塊狀紅色。1、+ 2、+ 3、+ 4、+ 5、3. 紅細(xì)胞系統(tǒng)： 均勻紅色或塊狀 4. 單核細(xì)胞系統(tǒng)： 細(xì)顆粒狀 5. 巨核細(xì)胞和血小板： 顆粒狀、塊狀。1.巨核細(xì)胞和血小板陽性 1. 幫助鑒別巨幼細(xì)胞性貧血和骨 髓增生異常綜合征、紅白血病: 前者（），后兩者（+）。四、臨床意義 A 紅白血病(+) B 巨幼細(xì)胞性貧血() 2. 幫助鑒別急性白血病的細(xì)胞類型： 急淋：（+）呈粗顆粒狀或塊狀。 急粒：（+）細(xì)顆粒狀或均勻紅色。 急單：（+）細(xì)顆粒狀，均勻分布， 有時(shí)胞

14、質(zhì)邊緣顆粒較粗大。 3. 其他細(xì)胞： 急慢性淋巴細(xì)胞白血病和 淋巴瘤細(xì)胞多呈強(qiáng)陽性 戈謝細(xì)胞呈強(qiáng)陽性 尼曼-皮克細(xì)胞多呈陰性CLLALL 1. 特異性酯酶（specific esterase） 主要存在于粒細(xì)胞，又稱“粒細(xì)胞酯酶” 氯乙酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DCE）。 一、分類酯 酶 染 色 2.非特異性酯酶(nonspecific esterase) 單核、組織細(xì)胞中含量較多，粒細(xì) 胞、淋巴細(xì)胞中含量少，且氟化鈉抑 制單核細(xì)胞中的非特異性酯酶，而不 抑制粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及其他細(xì)胞。醋酸AS-D奈酚酯酶： NAS-DAE-醋酸奈酚酯酶： - NAE-丁酸奈酚酯酶： - NBE酸性-醋酸奈

15、酚酯酶：ANAE(- NBE 敏感性不如NAS-DAE但特異性較之強(qiáng)) （一）氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色 Naphthol AS-D chloroacetate esterase 1. 原理 氯乙酸AS-D萘酚 AS-D萘酚 不溶性的有色(紅)沉淀。 NAS-DCE幾乎僅出現(xiàn)在粒細(xì)胞，其特異性高， 因此又稱為“粒細(xì)胞酯酶” NAS-DCE 重氮鹽(堅(jiān)牢藍(lán)紫醬) 氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色 2. 正常血細(xì)胞的染色反應(yīng) 粒系(酶活性隨細(xì)胞成熟而逐漸減弱) 原粒（）或（+） 早幼粒成熟中性粒細(xì)胞（+ ） 嗜酸性粒細(xì)胞（）或弱（+） 嗜堿性粒細(xì)胞（+）單核細(xì)胞系統(tǒng)： （）肥大細(xì)胞：（+）淋巴細(xì)胞、漿細(xì)

16、胞、幼紅細(xì)胞、 巨核細(xì)胞、血小板： （） 3. 臨床意義主要用于輔助鑒別急性白血病細(xì)胞類型：急性粒細(xì)胞白血?。?（+）急性早幼粒細(xì)胞白血?。簭?qiáng)（+）急性單核細(xì)胞白血病：（） 急粒單：粒細(xì)胞（+）和單核細(xì)胞（）急性巨核細(xì)胞性白血?。海ǎ┘毙粤馨图?xì)胞白血?。海ǎ?1. 原 理 非特異性脂酶在相應(yīng)的pH環(huán)境中， 將基質(zhì)液中相應(yīng)底物水解，產(chǎn)生含萘酚 的物質(zhì)，后者與重氮鹽發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)， 形成不溶性的有色沉淀，定位于細(xì)胞質(zhì) 內(nèi)酶所在的部位。（二）非特異性脂酶染色根據(jù)pH值的不同分為：酸性：酸性- 醋酸萘酚酯酶染色(ANAE)中性：- 醋酸萘酚酯酶染色(- NAE) 醋酸AS-D萘酚酯酶染色(NAS-DAE

17、)堿性：-丁酸萘酚酯酶染色(- NBE) 名稱pH底物生成物重氮鹽(產(chǎn)物顏色)-醋酸萘酚酯酶(-NAE)中-醋酸萘酚-萘酚堅(jiān)牢藍(lán)B棕黑,灰黑醋酸AS-D萘酚酯酶 (AS-D NAE)中醋酸AS-D萘酚AS-D萘酚堅(jiān)牢藍(lán)BB藍(lán)-丁酸萘酚酯酶(-NBE)堿-丁酸萘酚-萘酚堅(jiān)牢紫醬GBC紅酸性-醋酸萘酚酯酶(ANAE)酸-醋酸萘酚-萘酚六偶氮付品紅紅-醋酸萘酚酯酶染色(灰黑色、棕黑色)-醋酸萘酚酯酶染色a:單核 b:BPC c:巨核 d:LC(+) e:幼紅(-)2. 臨床意義 輔助鑒別急性白血病細(xì)胞類型 A . 急單：?jiǎn)魏思?xì)胞陽性，能被NaF抑制。 B . 急粒：粒細(xì)胞弱陽性，不被NaF抑制。C.

18、 M3：強(qiáng)陽性，不能被NaF抑制。D. M4：部分陽性細(xì)胞能被NaF抑制， 部分陽性細(xì)胞不能被NaF抑制。E. ALL：原幼淋陰性或陽性，不能被NaF 抑制。氟化鈉抑制：氟化鈉試驗(yàn)的抑制率大于50%。公式：NaF抑制率= 抑制前陽性率 抑制后陽性率 抑制前陽性率(或陽性積分)100%-醋酸萘酚酯酶染色M5NaFM1NaF酸性-醋酸萘酚酯酶染色（彌漫性棕紅色）-M5 3. 酯酶雙染色 在同一張涂片上進(jìn)行兩種酯酶染色特異性酯酶 + 非特異性酯酶對(duì)診斷急性粒-單細(xì)胞白血病有獨(dú)特價(jià)值-NAE 與NAS-DCE 紅色(單)-NBE 與 NAS-DCE 蘭色(粒) NAS-DCE： M1弱(+)/M2 (

19、+) /M3強(qiáng)(+)，M5/ALL()； -NBE： M5(+) NaF抑制，M1/M2/M3/ALL()； -NAE / NAS-DAE： M5強(qiáng)(+) NaF抑制 M3強(qiáng)(+) /M1M2a/ALL(+) NaF不抑制。 酸性磷酸酶染色(acid phosphatase，ACP)一、原理1.Gomori 硫化鉛法棕黑色pH5.02. 偶氮偶聯(lián)法(常用) 六偶氮付品紅棕紅色沉淀 磷酸萘酚AS-BI 萘酚AS-BI 棕紅色沉淀 ACPPh5.0重氮鹽3. 抗酒石酸酸性磷酸酶染色（一組同工酶）兩張相同標(biāo)本涂片+兩份基質(zhì)液(加L-酒石酸，不加 L-酒石酸) ACP染色耐L-酒石酸兩份（+）不耐L-酒石酸不加 L-酒石酸（+）加L-酒石