內(nèi)容提要 - 病理檢驗(yàn)技術(shù)

1、病 理 檢 驗(yàn) 技 術(shù)江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室 2004年4月內(nèi) 容 提 要 本書介紹組織病理學(xué)常用的多種技術(shù)。包括常見的技術(shù)，即福爾馬林固定、石蠟包埋、HE染色技術(shù)，同時(shí)也介紹了常用的特殊染色技術(shù)，免疫組織化學(xué)技術(shù)，并簡明地介紹了分子生物學(xué)技術(shù)的基本理論以及在組織病理學(xué)中的應(yīng)用。 全書理論與實(shí)踐并重，經(jīng)典與改良結(jié)合，內(nèi)容豐富，通俗易懂，實(shí)用性強(qiáng)，為實(shí)驗(yàn)室工作的必備參考書。適合從事病理學(xué)、組織學(xué)、生物學(xué)、法醫(yī)學(xué)等的科研教學(xué)和臨床工作的技術(shù)人員、教師、醫(yī)師和研究生使用。同時(shí)也適合臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)中專、專科生使用以及臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)專升本學(xué)生和臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生選用。石蠟切片

2、技術(shù)組織標(biāo)本的處理第一節(jié) 取材5第二節(jié) 組織的固定6第三節(jié) 大體標(biāo)本的處理和固定14第四節(jié) 陳列標(biāo)本的固定15第五節(jié) 脫鈣16第六節(jié) 組織的沖洗18石蠟包埋技術(shù)第一節(jié) 脫水19第二節(jié) 透明21第三節(jié) 浸蠟22第四節(jié) 包埋22第三章 切片技術(shù)第一節(jié) 切片刀25第二節(jié) 切片機(jī)27第三節(jié) 石蠟切片的制作27第四節(jié) 特殊組織石蠟切片的制作29第五節(jié) 石蠟切片的異常及處理29第四章 染色與染色劑第一節(jié) 染色的基本原理31第二節(jié) 染色劑染色的化學(xué)基礎(chǔ)33第三節(jié) 染色劑的分類34第四節(jié) 常用染色劑及配制35第五節(jié) 蘇木素伊紅染色法39第六節(jié) 封固劑41第五章 特殊染色技術(shù)第一節(jié) 結(jié)締組織染色法43第二節(jié) 脂

3、類染色法47第三節(jié) 糖原及粘液染色法48第四節(jié) 色素染色法50第五節(jié) 神經(jīng)組織染色法52第六節(jié) 核酸及核蛋白染色法52第七節(jié) 肌肉組織染色法53第八節(jié) 病原微生物染色法54第九節(jié) 特殊染色技術(shù)的應(yīng)用57第二篇 免疫組織化學(xué)和親和免疫組織化學(xué)技術(shù)第一章 免疫組織化學(xué)技術(shù)第一節(jié) 基本原理62第二節(jié) 染色步驟67第三節(jié) 常用試劑的配制72第二章 親和免疫組織化學(xué)技術(shù)第一節(jié) 基本原理77第二節(jié) 染色步驟80第三篇 分子生物學(xué)技術(shù)第一章 核酸原位雜交技術(shù)第一節(jié) 核酸原位雜交的基本原理83第二節(jié) 核酸原位雜交的主要過程84第三節(jié) 核酸原位雜交的基本操作步驟86第四節(jié) 常用試劑的配制87第五節(jié) 核酸原位雜交

4、的應(yīng)用89第二章 原位PCR技術(shù)第一節(jié) 基本原理91第二節(jié) 基本類型91第三節(jié) 基本步驟92第四節(jié) 原位PCR技術(shù)的應(yīng)用93第一篇 石蠟切片技術(shù)切片技術(shù)的應(yīng)用到現(xiàn)在已有一百年多的歷史了。 最早應(yīng)用的只是冰凍切片，隨著冰凍切片的應(yīng)用和實(shí)踐又進(jìn)一步利用石蠟的硬度，將要檢查的組織塊浸漬并包埋于這種堅(jiān)實(shí)的介質(zhì)之中，制成了石蠟切片。后來又利用明膠，火棉膠等物質(zhì)的韌性來包埋組織，制成了明膠切片和火棉膠切片。 切片技術(shù)隨著生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展，經(jīng)過不斷地改進(jìn)而逐漸的完善起來，隨著光學(xué)儀器和切片機(jī)器的日益的精密和不斷向前發(fā)展?，F(xiàn)代切片技術(shù)巳成為生物形態(tài)學(xué)微觀結(jié)構(gòu)研究的一個(gè)重要方面，更是病理檢驗(yàn)技術(shù)中不可缺少的一

5、個(gè)組成部分。 將各種組織制成非薄的切片標(biāo)本，需要經(jīng)過一系列比較繁雜的過程，每一步都要求病理技術(shù)工作者要認(rèn)真，耐心，細(xì)致地使整個(gè)過程一環(huán)扣住一環(huán)，才能獲得優(yōu)良結(jié)果。制作切片的主要過程有：（1）取材，（2）固定，（3）脫水，（4）包埋，（5）切片，（6）染色，（7）封固。在這七個(gè)主要過程中，又包括著若干步驟，（詳見切片制作程序表）。 冰凍切片 石蠟切片 火棉膠切片 取 材固 定 冰 凍 沖 水 脫 水 透 明 乙醚酒精 浸 蠟 膠液滲透 石蠟包埋 火棉膠包埋 冰凍切片 切 片 切 片 染 色 染 色 染 色 封 固 封 固 封 固 凡欲制作切片的組織，首先必須固定，以防止組織自溶而產(chǎn)生死后變化。組

6、織經(jīng)過固定之后，再以流水沖洗。如為冰凍切片，即可直接將組織冰凍進(jìn)行切片。如欲制石蠟切片或火棉膠切片，為了使石蠟或火棉膠滲透到組織中去，以能包埋組織，在固定水洗之后，還須經(jīng)過脫水，媒劑（透明），石蠟火棉膠的滲透，才能包埋切片。在切片以后，為了便于觀察，還要對(duì)其進(jìn)行不同的染色，最后將切片封固，制成長久保存的組織切片標(biāo)本。第一章 組織標(biāo)本的處理第一節(jié) 取 材取材是制作切片程序中的首要步驟，取材不當(dāng)，將直接影響病理診斷和科研工作的效果。組織標(biāo)本的選用非常重要，不能隨意的切取組織來制作組織切片，否則病理檢驗(yàn)的結(jié)果是不會(huì)令人滿意的。 一、取材工具：取材刀具必須鋒利。切取標(biāo)本不應(yīng)該擠壓和揉擦，不應(yīng)使用有鉤鑷

7、子或血管鉗等手術(shù)器械鑷取標(biāo)本，以免損害組織造成人為組織變化，給診斷帶來困難或?qū)е洛e(cuò)診，漏診。二、標(biāo)本的選取：應(yīng)選擇病變或可疑病變的組織。必要時(shí)選取病變與正常組織交界處。切取標(biāo)本的原則是求準(zhǔn)而不是求量多，所以切取組織宜小不宜大，以不超過24x24mm2為佳，厚度以35mm為度，過大過厚會(huì)影響對(duì)標(biāo)本的固定，另方面也影響切片的制作。特殊目的者應(yīng)屬例外。了使組織切片的結(jié)構(gòu)清楚，取材要及時(shí)，組織塊必須爭取時(shí)間及時(shí)固定。組織的固定以愈新鮮愈好。取材時(shí)對(duì)大體標(biāo)本（肉眼標(biāo)本）繪制圖象，進(jìn)行仔細(xì)描述。包括形狀、大小，硬度，顏色，病灶（或可疑病變）部位等。對(duì)所取的組織應(yīng)定位編號(hào)。切取各組織塊時(shí)，切勿擠壓損傷，對(duì)典

8、型或具有教學(xué)和科研價(jià)值的肉眼標(biāo)本，不能因取材而對(duì)標(biāo)本造成人為的“病變”。腸粘膜組織上沾有少量糞便，也不應(yīng)以手拭去或以水洗去。 下的組織塊應(yīng)盡量防止其彎曲扭轉(zhuǎn)，如胃腸等組織，應(yīng)先平展于草紙上粘著以后，慢慢地放入固定液中（故應(yīng)在動(dòng)手剖驗(yàn)之前做好準(zhǔn)備工作）。固定液的量要充足，應(yīng)為固定組織的10倍。組織采取應(yīng)在正常與病灶交界之處。組織形狀最好為方形或長方形狀，這樣有利于制片。切不可以形狀定位，組織厚薄要均勻。因?yàn)榻M織塊的厚度決定固定的速度，要充分滿足它在一定時(shí)間內(nèi)全部達(dá)到適宜的固定。如組織厚薄不均，在脫水時(shí)將會(huì)引起標(biāo)本變形或 曲，而影響制片。在典型病變部位不妨多切數(shù)塊，以備日后添制教學(xué)切片或研究的需要

9、。 微量標(biāo)本和易碎標(biāo)本，為避免破損或丟失應(yīng)以紗布包裹，但包裹前紗布必須浸濕，以免標(biāo)本粘附紗布上。各組織塊應(yīng)包括各臟器的重要結(jié)構(gòu)，如腎臟組織包括皮質(zhì)部分和髓質(zhì)部分。在有漿膜的臟器（如胃等）組織塊中，要至少有一塊帶有漿膜。8、組織內(nèi)的鈣化病灶或骨質(zhì)，應(yīng)在充分固定之后進(jìn)行脫鈣，組織內(nèi)的非病理性異物應(yīng)予剔除。 標(biāo)本上（組織塊）附著的軟組織如脂肪等，如屬非病變成分，則應(yīng)在不影響病理診斷的原則下，盡量剝?nèi)セ蚯谐?，以利制片?0、組織塊的固定時(shí)間不宜過長或過短，不同的固定液，固定時(shí)間有所不同，固定后的組織需要用流水沖洗，再進(jìn)行脫水制片。11、切取鏡檢組織塊后，可將剩余的組織放入70%灑精中保存，這樣有利于日

10、后再取材切片時(shí)的細(xì)胞染色。第二節(jié) 組織的固定一、固定的意義固定是指將各種組織浸入防腐劑內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)為不溶性。固定的作用即是用一種方法將組織盡可能保持在它原來的形態(tài)，且能適于某些研究程序。凡是需要制作作病理檢驗(yàn)標(biāo)本的各種組織，無論是制作切片標(biāo)本，還是制作巨體標(biāo)本，首先必須固定。在制作切片過程中，固定最為重要的步驟，一張優(yōu)秀的組織學(xué)切片是建立在適當(dāng)而完全的固定基礎(chǔ)之上的。固定不良在以后制片的任何階段皆不能補(bǔ)救。因此制片的優(yōu)劣首先取決于最初固定適當(dāng)與否。重要的是，被固定組織在動(dòng)物死后或從活體切取后要盡可能立即固定。及時(shí)的取材給迅速固定提供了先決條件。如果不迅速固定，造成固定不良，將導(dǎo)致染色不良

11、后果。組織的良好固定，應(yīng)該是一次性的；某些固定劑還具有助染的作用，可使細(xì)胞各部易于著色。固定不良的組織，即使進(jìn)行補(bǔ)充固定也起不到改善染色的效果。 二、固定的目的和效果固定組織的目的是設(shè)法得到接近正常生命狀態(tài)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有人說“形態(tài)學(xué)的美是良好固定產(chǎn)物”，這說明固定的特殊重要作用。 1、抑制自溶和腐?。航M織的固定能保持細(xì)胞與生活時(shí)的形態(tài)相似。因?yàn)楫?dāng)機(jī)體生命活動(dòng)停止、或局部器官、組織割離機(jī)體之后，組織細(xì)胞的代謝功能即行喪失，新鮮組織如果不經(jīng)固定，任意放置，由于細(xì)胞內(nèi)酶對(duì)蛋白質(zhì)的分解，以及細(xì)胞的孳生等各種因素的作用，則易因細(xì)胞繁殖而致組織腐爛。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分解酶將蛋白質(zhì)分解為氨基酸后脫離細(xì)胞而引起

12、組織的自溶。 2、保存：細(xì)胞經(jīng)過固定，不但可以防止自溶和細(xì)菌性腐敗，而且能沉淀或凝固組織內(nèi)的各種成份和病理代謝產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)，脂及脂蛋白、脂肪、糖類、色素，其它碳水化合物，無機(jī)成份，微生物等都可以經(jīng)過固定而保存下來，并在制片過程中不為其他試劑溶解破壞。3、硬化：固定劑的硬化作用能使柔軟組織（如腦）的質(zhì)地變硬而易于操作。4、膠質(zhì)物體的固化：固定能使細(xì)胞正常的半液體狀（溶膠）變?yōu)椴荒苣孓D(zhuǎn)的固體狀（凝膠）粘度。5、肉眼鑒別：固定可將各種細(xì)胞和組織成分的析光率作不同程度的改變，增強(qiáng)組織的析光指數(shù)，這樣能使各種染色成份較之未固定時(shí)更容易辨認(rèn)。6、對(duì)染色的影響：某些固定劑尚具有一定的媒染作用而增進(jìn)染色（如

13、苦味酸對(duì)于染色的媒染作用）可使細(xì)胞各種部位易于著色，所以組織固定后有利于制片染色和在顯微鏡下的觀察。此外，固定劑有時(shí)也會(huì)影響染色效果，導(dǎo)致著色效果不理想（如福爾馬林對(duì)水溶猩紅S染色的影響）。7、滲透和固定：固定還可以使組織和細(xì)胞的各種滲透壓不再發(fā)生改變，在制片時(shí)就能在最大范圍內(nèi)保持組織和細(xì)胞的原來形態(tài)。三、固定的方法及注意事項(xiàng)：為使組織固定充分，應(yīng)做到固定容器要合適、固定時(shí)間要充足，固定液量要足夠。固定組織時(shí)，應(yīng)選擇合適的容器、一般容器的容積是組織的1015倍以上。標(biāo)本瓶應(yīng)選擇瓶口較大的為宜，這樣便于固定后的標(biāo)本經(jīng)小口瓶硬塞進(jìn)去，這樣不僅不利于標(biāo)本易于取出，還可能造成人為擠壓組織而致形態(tài)變化，

14、對(duì)大件的標(biāo)本應(yīng)按巨檢常規(guī)切片后放于容器固定。組織固定的時(shí)間要足夠，根據(jù)標(biāo)本體積大小不同，固定時(shí)間應(yīng)有所不同，組織越大越厚，固定時(shí)間應(yīng)越長，反之。一般412小時(shí)或更長。在溫箱內(nèi)將固定液稍加溫，可使固定作用加快而縮短固定時(shí)間。固定組織時(shí)，應(yīng)該使用足量的固定液，多比少好，一般應(yīng)為組織體積的510倍，最少也不應(yīng)于五倍。標(biāo)本最好懸浮于固定液之中，漂浮于固定液之上或沉于固定用器之底部，都不利于固定液對(duì)標(biāo)本的滲入。如標(biāo)本塊多時(shí)，固定時(shí)不應(yīng)重疊。不要先將標(biāo)本塊放入容器后再注入固定液，以免標(biāo)本貼付于器皿，形成固定不均勻之弊。新鮮標(biāo)本應(yīng)及時(shí)固定，否則或因組織陳舊，或因固定不當(dāng)，而使組織原有結(jié)構(gòu)消失而影響觀察。 標(biāo)

15、本經(jīng)固定后，應(yīng)及時(shí)制作切片，如不能及時(shí)制片，而該固定液又不能作為保存液時(shí)，應(yīng)改換適當(dāng)?shù)谋４嬉?。在配制混合液時(shí)，應(yīng)了解每種固定劑的理化性質(zhì)，氧化劑不能與還原劑混合，以免引起化學(xué)反應(yīng)，失去固定作用。對(duì)于某些需要制作神經(jīng)染色和酶反應(yīng)等組織的固定，要求較一般嚴(yán)格，組織的大小，固定的時(shí)間，溫度的適當(dāng)都應(yīng)慎重考慮，尤其是對(duì)于酶反應(yīng)的固定液，一般都要置于冰箱，在低溫的條件下進(jìn)行固定。固定不好，是得不到滿意的切片和合乎標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)效果的。任何固定液對(duì)人體都有損害作用，因此固定液的容器必須密閉，以防揮發(fā)損傷器官和眼睛，忌用手與固定劑直接接觸，以免損傷皮膚。四、固定劑的選擇理想的固定劑應(yīng)該具備下列幾種性能：1、滲透

16、性強(qiáng)：固定劑必須能迅速滲入組織，這樣組織內(nèi)各種成分才能盡快地被固定在原位置，而不致彌散。2、組織在固定液的作用下，不應(yīng)發(fā)生顯著的收縮和膨脹現(xiàn)象。實(shí)際上經(jīng)過固定后的組織，由于蛋白質(zhì)發(fā)生凝固或沉淀，必然導(dǎo)致組織出現(xiàn)不同程度的收縮或膨脹。因此，良好的固定劑應(yīng)盡量減少組織發(fā)生這類變化。3、固定劑應(yīng)該有利組織切片和染色，這其中含有兩種意義；（1）固定劑對(duì)固定后的組織應(yīng)有利于染色劑的染色。例如：重鉻酸鉀對(duì)于類脂質(zhì)具有一定媒染作用；中性福爾馬林比一般福爾馬林所固定組織更優(yōu)于核的染色。(2)固定劑能將組織或細(xì)胞中某些必須觀察的成分予充分固定而保存下來，以便染色。例如：酸可以滲入脂類物質(zhì)使其固定下來而不至在制片

17、過程中為酒精和二甲苯溶解或較少地溶解，并可用石蠟包埋進(jìn)行切片。糖原的證明，則宜使用非水溶性固定劑如無水酒精、Camoy氏固定液等。 4、固定液應(yīng)該同時(shí)也是一種較好的保存液。實(shí)際上，沒有哪一種固定液，無任是單一固定液或混合固定液都能夠完全達(dá)到上述要求。各種固定劑性能和作用都不盡相同，因此，對(duì)標(biāo)本的固定應(yīng)根據(jù)組織的制片目的和要求去選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌Ｎ?、固定劑的種類組織制片技術(shù)上所使用的固定劑種類繁多，性能各有不同，有的為氧化劑，有的為還原劑；有的呈酸性，有的呈堿性；有的滲透力強(qiáng)，有的滲透力弱；有些易使組織收縮，有些則使組織發(fā)生輕微膨脹現(xiàn)象。一般地說，單一固定劑要想使組織固定后達(dá)到某種特殊染色要求是

18、比較困難的。因此，在標(biāo)本固定中常使用兩種以上成分（固定劑）的混合固定液。六、用做固定劑的試劑1、單一固定劑：僅由一種化學(xué)物質(zhì)加水溶解后用以固定標(biāo)本的固定液叫單一固定液。常用單一固定試劑有甲醛，灑精，冰醋酸，苦味酸，重鉻酸鉀，餓酸，氧化汞 ，丙酮等。除福爾馬林，酒精和丙酮常用作單一固定劑外，其它多作混合液中的一種成分。 甲醛formaldeloyde (HCHO) 甲醛是一種氣體，約有40%重量溶于水。這是一種還原劑，頗易揮發(fā)，這種飽和溶液稱為甲醛溶液；其商品名叫福爾馬林。10%福爾馬林的組成系；甲醛溶液（福爾馬林） 10ml 水 90 ml甲醛是一種使用廣泛、簡便的固定劑，同時(shí)又是一種良好別的

19、標(biāo)本保存液。經(jīng)它固定的標(biāo)本，可適應(yīng)一些特殊染色。它的滲透性較強(qiáng)，固定均勻，能增加組織的韌性，組織 縮輕微，硬性大于酒精。福爾馬林主要是由甲醛的聚合形式構(gòu)成，然而聚合形式的固定效果低于單體形式構(gòu)成的10%福爾馬林，為阻止在放置一定時(shí)間的重聚作用，一般將溶液的PH值調(diào)節(jié)至中性或偏堿性。甲醛與蛋白質(zhì)是在分子間的交聯(lián)上起反應(yīng)，最終產(chǎn)生一種不溶性產(chǎn)物。它經(jīng)過絡(luò)合交聯(lián)，使蛋白質(zhì)固定，能較好地保存脂類；對(duì)肝糖也有固定作用，但必須及時(shí)固定及時(shí)處理，以免產(chǎn)生水解。甲醛當(dāng)長期貯存，特別于寒冷氣候下，自行分解，可變混濁，有白色沉淀物，這種沉淀即三聚甲醛，是甲醛的一種聚合形式（加熱可重新分解成甲醛）。商品福爾馬林用甲

20、醇阻止聚合作用。有時(shí)由于溶液不純或甲醛氧化產(chǎn)生的甲酸成分使溶液呈酸性，酸性的甲醛溶液使標(biāo)本嗜染酸性、嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞核的嗜酸性染色。因此，在備用的甲醛中宜放入小量的碳酸鎂或碳酸鈉作為中和劑。如果每100毫升的福爾馬林固定液中加入5ml的吡啶，則可調(diào)整PH為7。不過，這些方法不能永久保持其PH值；欲望使其長期保持中性，則需以磷酸緩沖液作溶劑進(jìn)行配制。其配制方法如下：10%福爾馬林 1000ml磷酸二氫鈉（NaH2PO4） 4g磷酸氫二鈉（Na2HPO4） 6.5g固定小的組織塊數(shù)小時(shí)即可達(dá)到固定要求。如需要快速固定時(shí)，可加溫到7080，經(jīng)過10分鐘即可達(dá)到固定要求。在甲醛溶液中短時(shí)固定的標(biāo)本，沖

21、洗時(shí)間在10分鐘至2小時(shí)即可，但固定時(shí)間較長的標(biāo)本需要較長時(shí)間的流水沖洗。一般要沖洗24小時(shí)，甚至延長48小時(shí)，否則，由于甲酸的沉淀將會(huì)影響染色的結(jié)果。甲醛能保存脂肪和類脂體，對(duì)染色體，線粒體，高爾基體，具有良好的固定作用。經(jīng)甲醛固定的陳舊組織，尤以多血的肝脾組織內(nèi)?？沙霈F(xiàn)棕黑色的福爾馬林色素顆粒，這種色素不溶于水，酒精及丙酮等，如欲與含鐵血黃素加以區(qū)別，可用普魯士蘭反應(yīng)進(jìn)行鑒別。福爾馬林色素不含有鐵，因此，福爾馬林色素呈陰性反應(yīng)，用中性或微堿性福爾馬林固定的效果能顯著增加對(duì)鐵離子的檢出速度且可完全避免福爾馬林色素的形成。此外也可以使用其他試劑以浸洗方法除去福爾馬林色素的沉淀，如：（1）苦味酸

22、飽和酒精（90%）溶液浸洗30分鐘后經(jīng)70%酒精再水洗后進(jìn)行染色。（2）什端氏（Schriade）法：70%酒精 200ml28%氨水 1ml將石蠟切片在脫蠟以后放于上述液體中30分鐘，再用流水沖洗，而后染色。若甲醛產(chǎn)生的色素沉淀仍未被其洗去，則可在Schriade氏液中延長時(shí)間。此法并不損害組織。(3)費(fèi)羅氏（Verocay）法:80%酒精 100ml1%KOH 1ml將切片在脫蠟至80%酒精后，浸入上液10分鐘，再流水沖洗5分鐘，入80%酒精之后水洗染色。福爾馬林固定的標(biāo)本，經(jīng)酒精脫水收縮較大，是其缺點(diǎn)。酒精（C2H5OH）可單獨(dú)用作固定液；亦可作混合固定液，因?yàn)榫凭ㄒ掖迹┦且环N還原劑，

23、所以不可與鉻酸，重鉻酸鉀或鋨酸等氧化劑相混合使用。在氧量不足時(shí)酒精易氧化成乙醛；氧量充足則能生成酯酸，所以在正常情況下，酒精是偏酸性試劑。酒精為常用的有機(jī)溶劑，能溶解多種有機(jī)物，高濃度酒精能凝固白蛋白，球蛋白和核蛋白，對(duì)肝糖有固定作用，核蛋白和肝糖經(jīng)酒精固定成水溶性狀態(tài)，因此，經(jīng)酒精固定的標(biāo)本如果固定后用水洗滌，則核著色欠佳，肝糖也將被水解。作為一種脂溶劑，濃度在50%以上的酒精可溶解脂肪和類酯體，因此，對(duì)脂類的證明，高爾基氏體，線粒體等染色不宜使用酒精作固定劑。酒精還可溶解血紅蛋白和損害多數(shù)其他色素，因此，如果證明組織蛋白的色素時(shí)也不宜以酒精作為固定劑。濃酒精有較大的收縮力，被它固定的組織收

24、縮顯著，表面發(fā)硬，因而酒精較難滲入到組織中去，組織必須用酒精固定時(shí)宜先用80%的酒精固定數(shù)小時(shí)，然后再換95%酒精，這樣可以避免組織過度收縮，因此它的穿透力緩慢且與組織長期接觸能使之硬化，如需要證明尿酸結(jié)晶和保存糖類，則須用100%酒精固定。酒精既有固定作用，又有脫水作用，經(jīng)酒精固定的標(biāo)本不需洗滌，可用較高濃度酒精直接進(jìn)行脫水，也可暫存于70%酒精中。醋酸（CH3COOH）純醋酸為無色，具有強(qiáng)烈刺激性的酸性液體，溫度低于17時(shí)呈固體狀，形成冰樣結(jié)晶體。所以，一般稱為冰醋酸。醋酸因使膠原纖維腫脹，故不能單獨(dú)使用；但在混合固定液中有抗其它試劑使細(xì)胞皺縮的作用。因此，醋酸常同酒精配制成為混合固定液來

25、抵消經(jīng)過固定所引起組織的高度收縮和硬化的作用。醋酸可與水，酒精等溶劑相混合。一般使用濃度為0.35%，以5%為備用液。用醋酸固定后的組織不必水洗，即可直接投入50%或70%酒精之中。醋酸的滲透性很強(qiáng)，一般較小的組織塊只須1小時(shí)即可。醋酸可使核蛋白沉淀，因此染色質(zhì)固定很快，是染色質(zhì)良好的固定液。對(duì)蛋白質(zhì)具有保存作用，對(duì)脂類、糖不產(chǎn)生影響，高濃度醋酸則可溶解脂肪及類脂，并使線粒體和高爾基體被破壞或變形。所以，一般配制含醋酸的混合液時(shí)，其濃度都不超過5%?？辔端幔–6H2(NO2)3OH）苦味酸是一種具毒性的黃色結(jié)晶體，味苦，在空氣中干燥時(shí)有爆炸性，故需保濕保存，最好是儲(chǔ)存在一層水下。一般情況下，制

26、片室將苦味酸制成飽和溶液作為常備用液，通常固定的濃度是飽和液，其飽和度為0.9%1.2%?？辔端崛苡诰凭妆?，固定后的組織經(jīng)酒精脫水即可。苦味酸也是一種良好的組織染色劑，經(jīng)苦味酸固定劑固定的組織作三色染色可使顏色對(duì)比鮮艷。苦味酸能沉淀一切蛋白質(zhì)，并與其結(jié)合形成苦味酸鹽，遇水時(shí)，其中有的部分可溶與水，因此在一般情況下，組織經(jīng)苦味酸或含有苦味酸的固定劑固定后，這種水溶性苦味酸鹽在與水接觸前需先經(jīng)酒精處理使其呈不溶性，可以70%酒精浸洗，在酒精內(nèi)加上少量碳酸鋰或氨水即可被洗去?；蛘呤遣唤?jīng)水洗，直接投入70%酒精脫水。在脫水過程中，苦味酸可被各級(jí)酒精溶解洗去。即使不能全部洗去，亦不妨礙染色，脫水酒

27、精雖被染黃，但亦不失其脫水效果。通?？辔端岢恋砑t細(xì)胞，可移走鐵離子，特別是僅少量存在時(shí)可使RNA抵抗核糖核酸酶的消化。重鉻酸鉀(K2Cr207) 重鉻酸鉀為一種橘紅色有毒性的塊狀結(jié)晶體，溶于水，不溶于酒精，為一種強(qiáng)氧化劑。所以其水溶液不應(yīng)與酒精，福爾馬林等還原劑相混合使用。在某些情況下，同福爾馬林混合固定標(biāo)本時(shí)，只能在使用前相混合，過久即失去固定作用。經(jīng)重鉻酸鉀固定后的組織應(yīng)及時(shí)進(jìn)行水洗脫水，否則標(biāo)本變硬脆化，不易制成切片。如不能當(dāng)即制作切片，可將標(biāo)本保存于福爾馬林液內(nèi)。重鉻酸鉀對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合作用像福爾馬林一樣，固定胞漿不易引起沉淀作用。但在溶液中加入醋酸，PH為時(shí)，會(huì)使染色質(zhì)和細(xì)胞漿硬化，使

28、之產(chǎn)生鉻酸，才能使蛋白質(zhì)呈網(wǎng)狀沉淀。重鉻酸鉀對(duì)細(xì)胞質(zhì)，染色質(zhì)固定良好，但染色質(zhì)則被溶解。未酸化的重鉻酸鉀雖不能沉淀蛋白質(zhì)，但可使蛋白質(zhì)變?yōu)椴蝗苄?，還可以保護(hù)磷脂類，亦能固定類脂物，使其不溶解于脂溶劑。因此，可以固定高爾基氏體和線粒體。重鉻酸鉀不是糖的固定液，用重鉻酸鉀（或鉻酸）固定的組織幾乎完全不會(huì)發(fā)生收縮，但經(jīng)酒精脫水時(shí)，則收縮明顯。所以在脫水之前，組織需用流水沖洗1612小時(shí)。如把含鉻組織直接轉(zhuǎn)移到酒精內(nèi)，會(huì)形成一種非溶性低氧化物而不易除去。重鉻酸鉀有溶解染色質(zhì)的缺點(diǎn)，一般備用液為5水溶液，固定液使用濃度為13水溶液。鉻酸（CrO3）為暗紅色或帶暗紫色的塊狀結(jié)晶，具有強(qiáng)酸性及腐蝕性，劇毒，

29、易潮解，為強(qiáng)氧化劑，應(yīng)置于暗處。它是Orth氏液或ZenRer氏液等復(fù)合固定劑中的一種成分，不應(yīng)同酒精、福爾馬林等還原劑混合使用。鉻酸與乙醇，乙醚少許接觸即可引起爆炸。鉻酸可沉淀所有的蛋白質(zhì)，使不溶于水，并可保存糖類。鉻酸水解DNA系將其戊糖轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N醛；亦可將糖類轉(zhuǎn)變?yōu)槿?。因此DNA和糖類不需經(jīng)過常規(guī)PAS或Feulgen反應(yīng)的預(yù)先處理即與Schiff試劑呈陽性染色。鉻酸的滲透力較低，對(duì)標(biāo)本收縮輕微，經(jīng)鉻酸固定劑固定的組織像用重鉻酸鉀固定一樣需徹底水洗，將組織中鉻酸全部洗去，否則在脫水過程中，鉻酸與酒精作用生成氧化鉻的沉淀，使組織脆化，且不易于組織的著色。鉻酸適合固定的濃度為0.5%1%。四

30、氧化鋨（OsO4）為微黃色結(jié)晶，通常密裝于安瓿內(nèi)出售，為強(qiáng)氧化劑，一般認(rèn)為它使未飽和鍵氧化。對(duì)飽和脂肪不起反應(yīng)，未飽和脂類可還原OsO4，易氧化為黑色氫氧化物，溶液呈中性，揮發(fā)性強(qiáng)，在操作四氧化鋨時(shí)應(yīng)小心，因其氣體有刺激性，會(huì)引起結(jié)膜炎。遇熱和光時(shí)易還原，故應(yīng)貯于冷暗處。平時(shí)溶液密閉有色瓶中，并置于冰箱內(nèi)。四氧化鋨是脂肪和類脂質(zhì)的固定液，用以顯示脂類（例如髓脂類）。能使單個(gè)細(xì)胞或小組織的微細(xì)構(gòu)造得以極好地保存，因此幾乎是用于電子顯微術(shù)最佳固定劑。組織經(jīng)固定后，脂肪，類脂呈黑色，微溶于二甲苯及酒精，脫水后最好以苯作透明劑。四氧化鋨的滲透力弱。組織塊如過23厘米厚度則穿透不良和不均。所有含四氧化鋨

31、固定劑的固定作用皆很不均勻；固定不良的組織切片表現(xiàn)周圍有一圈過度固定的暗色區(qū)帶；中心為固定不足致使細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)不清的區(qū)域。有些成分變暗是由于無色的OsO4轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏衔颫sO45H2O形式。四氧化鋨常與鉻酸，醋酸，重鉻酸鉀等混合使用，固定后的組織需經(jīng)流水沖洗，否則在脫水酒精中易被還原產(chǎn)生沉淀，不利于核著色，在每10毫升溶液中內(nèi)加入1滴飽和氯化汞水溶液有助于制止還原作用。氯化汞（又名升汞或二氯化汞HgCL2）氯化汞為白色粉末或針狀結(jié)晶，后者為化學(xué)純品，易升華，能溶于水和酒精。一般固定用其飽和溶液。氯化汞是一種能迅速透入并使組織硬化的蛋白沉淀劑。通常像別的金屬離子那樣，它與蛋白質(zhì)的酸基以及核蛋白

32、的磷酸基相結(jié)合，亦特異地與氫硫基起反應(yīng)。因而經(jīng)Hg固定后的蛋白質(zhì)不溶于水，大多數(shù)蛋白反應(yīng)可被利用。可惜，它的透入速度于最初幾毫米后就急驟降低，因此組織塊厚度如超過5毫米常使外圍過度固定致堅(jiān)硬而中心固定不足仍柔軟，只宜固定薄片組織。由于此缺點(diǎn)加之使組織收縮劇烈，很少單獨(dú)使用；當(dāng)與拮抗此缺點(diǎn)的試劑如醋酸，福爾馬林，重鉻酸鉀等結(jié)合使用時(shí)，氯化汞仍是很多優(yōu)良常規(guī)固定劑的一種成分。用氯化汞固定的組織使染色特別對(duì)胞漿著色比較鮮麗。凡用含氯化汞的固定劑固定的組織如超過規(guī)定時(shí)間會(huì)使組織過度硬化，而難切薄片。組織內(nèi)常存有汞鹽，切片時(shí)能損傷切片刀，所以在脫水前應(yīng)予以洗去。常用方法是用70%酒精加入少量碘（0.5%

33、）浸洗，再進(jìn)行充分的沖洗或以70%酒精洗后進(jìn)行脫水。也可在切片染色前用含碘的70%酒精漂洗數(shù)分鐘，再以5%硫代硫酸鈉漂洗，水洗后進(jìn)行染色。氯化汞常備溶液為飽和（約7%）水溶液，固定用濃度常為5%水溶液。用升汞飽和液固定組織時(shí)，臨時(shí)須加5%冰醋酸。固定23mm厚的組織塊須經(jīng)618小時(shí)，然后用水洗24小時(shí)，再保存于80%酒精中。氯化汞腐蝕金屬，混有此試劑的固定液不能使用金屬容器盛裝或用金屬鑷子夾持。氯化汞有劇毒，應(yīng)妥善保管。固定劑的選擇取決于研究工作當(dāng)時(shí)和下一步的需要，在選擇混合固定劑時(shí)，應(yīng)注意各種試劑的平衡，如使組織收縮的試劑可配以使組織膨脹的試劑，滲透力弱的可與滲透力強(qiáng)的混合使用。但是，氧化劑

34、原則上不與還原劑混用，如需要時(shí)，只能在使用前臨時(shí)混合。一種混合固定劑內(nèi)不宜有兩種以上的鹽類，以免產(chǎn)生復(fù)鹽影響對(duì)組織的固定，如氧化納和氯化鈉同時(shí)應(yīng)用時(shí)，常將氯化鈉改用硫酸鈉。技術(shù)工作者和病理工作者都應(yīng)了解各種固定劑的性能。固定液的選擇恰當(dāng)，才能獲得滿意的制片結(jié)果?；旌瞎潭ㄒ旱姆N類很多，本章內(nèi)所述的固定劑皆是較常用的，特殊染色所需的固定劑皆列在相應(yīng)的標(biāo)題下。Miiller氏液配方：重鉻酸鉀 g 硫酸鈉 g 蒸餾水加至 100ml此液固定作用緩慢，但頗均勻，收縮亦小。多用于媒染和硬化神經(jīng)組織，在這種固定溶液中，重鉻酸鉀未經(jīng)酸化，所以對(duì)染色質(zhì)無固定作用。不適用于一般細(xì)胞學(xué)染色。除用于骨骼標(biāo)本外，此液是

35、一種不常用的固定劑。固定時(shí)間數(shù)天至數(shù)周，在固定過程中，需要每日更換新液并置暗處，固定后的組織用流水沖洗，再放入酒精中脫水。Orth氏液（Mullr氏液福爾馬林）配方：重鉻酸鉀 g 硫酸鈉 g福爾馬林 10ml蒸餾水 加至 100ml一般以Mullr氏液為備用液，用前以9份Mullr氏液加1份福爾馬林混合而成，因?yàn)橹劂t酸鉀是氧化劑，福爾馬林為還原劑，混合后久放即失去固定作用。固定厘米的標(biāo)本塊約需34日，每日需更換新液，標(biāo)本固定后要充分水洗，然后進(jìn)行脫水包埋。如固定過久，標(biāo)本變脆，顏色由棕黃轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏?，則不能制作切片，標(biāo)本經(jīng)固定后如不能及時(shí)制片時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本保存于福爾馬林內(nèi)或70%酒精中。Orth氏

36、液對(duì)染色質(zhì)，線粒體有較好的固定效果。硫酸鈉在固定液中有助于滲透作用，在一般情況下，可省去不用。Zenker氏液（以Muller液為基液加入氯化汞在臨用前再加醋酸混合而成）配方：重鉻酸鉀 g 硫酸鈉 g 氯化汞 g 蒸餾水 加至 100ml 冰醋酸（臨用時(shí)加入） 5ml Muller液加入醋酸后則不能貯存，未加醋酸的溶液（ZenRer氏原液）可保存較久。此液加入冰醋酸后，與重鉻酸鉀作用生成鉻酸，是蛋白質(zhì)的良好固定劑，其穿透力迅速而均勻硬化組織能力強(qiáng)，經(jīng)它固定后的標(biāo)本利于鹽基性染色劑著色，胞核和胞漿染色頗為清晰，是一種優(yōu)良的常規(guī)固定劑。 Zenker氏固定液中含有兩種蛋白質(zhì)和三種染色質(zhì)的固定劑：所

37、以Zenker氏液在組織學(xué)和病理學(xué)方面均較廣泛使用，固定作用通常于12小時(shí)內(nèi)完成。固定薄組織塊24毫米時(shí)，固定1214小時(shí)，然后用流水沖洗過夜（以除去多余的鉻化物，汞色素須用碘來脫除）后進(jìn)行脫水，或保存于80%酒精中。Heely氏液Heely氏液將Zenker氏液中的醋酸以福爾馬林替代，并名之為Helly氏液。液中重鉻酸鉀未經(jīng)酸化，對(duì)細(xì)胞質(zhì)固定較好，對(duì)造血系統(tǒng)（骨、髓、脾、肝）等為一良好固定液。用于結(jié)締組織染色效果也好。配方：重鉻酸鉀 g 硫酸鈉 g 氯化汞 g 蒸餾水 加至 100ml 臨用前加福爾馬林 5ml此液配好后24小時(shí)內(nèi)有效，組織固定1224小時(shí)后，流水沖洗，脫水。Bouin氏固定

38、液配方：苦味酸飽和水溶液 75ml 福爾馬林（40%甲醛液） 25ml 冰醋酸 5ml 此固定液保存性良好，滲透速度快，穿透力迅速而均勻，且很少引起收縮，不使組織變硬和變脆，固定后的組織用三色染色法著色鮮艷絢麗，過量苦味酸使組織呈黃色，但并不妨礙染色，毋須洗凈除去。此液也是皮膚組織較好的固定液，它可以軟化表皮不使其變硬變脆。利于切片，對(duì)蛋白質(zhì)核酸有較好的固定作用，一般固定時(shí)間為數(shù)小時(shí)至一日。Carrnoy氏固定液配方：無水酒精 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml此液穿透力非常塊、固定力強(qiáng)，對(duì)核固定良好，并可保存糖原也用于糖類的固定。于脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的固定。一

39、般組織固定23小時(shí)后即可直接投入95%酒精和純酒精中進(jìn)行脫水，因此也可作快速固定的固定劑，厚度29毫米的小塊組織僅需15分鐘即可，外檢胸腹水經(jīng)過離心沉淀后，將沉淀物用Carrnoy氏液固定可制作石蠟切片。 醋酸酒精福爾馬林混合固定液配方：福爾馬林 10ml 冰醋酸 5ml 70%酒精 85ml 這種混合固定液通常簡稱“AAF”固定液。使用較廣泛，配制時(shí)一般可以酒精作為溶劑，然后加入福爾馬林，醋酸。酒精可因組織種類不同而采用不同的濃度，在常規(guī)切片中，我們常采用濃度為95%酒精。 此液對(duì)糖原的固定佳良，就是說在蛋白質(zhì)成分完全固定之前可以防止糖類溶解，加入醋酸以保證蛋白質(zhì)的固定，由于酒精和福爾馬林二

40、者皆為迅速穿透的試劑，這是一種相當(dāng)好的快速固定劑，對(duì)臨床外檢工作特別有利，福爾馬林對(duì)組織染色效果較好，醋酸可以防止酒精而引起的收縮。常溫下，5毫米厚的組織固定4小時(shí)即可，加溫（60）條件下，一般組織半小時(shí)內(nèi)可固定良好，固定后組織直接放入95%酒精中脫水。AAF固定液的缺點(diǎn)是組織固定后對(duì)細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)有一定破壞作用，而對(duì)免疫組織化學(xué)染色有一定影響（詳見免疫組織化學(xué)技術(shù)一章）。其它常用固定液配方10%甲醛生理鹽水液配方：福爾馬林 100ml 氯化鈉 g蒸餾水 900ml Gendre液配方：苦味酸飽和于95%酒精溶液 80ml 福爾馬林 15ml 冰醋酸 5ml用此液在室溫下3

41、4小時(shí)即可使糖原固定良好。緩沖福爾馬林液配方：福爾馬林 10ml 磷酸二氫鈉（NaH2PO42H2O） g 磷酸氫二鈉（Na2HPO4） g 蒸餾水 100ml 緩沖福爾馬林固定劑具有能較好地保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)和某些細(xì)微結(jié)構(gòu)，適于免疫組織化學(xué)染色和電鏡觀察，并且可較長時(shí)間保存組織（半年至一年）而又不影響制片和染色。是近年來越來越受到重視的固定劑。第三節(jié) 大體標(biāo)本的處理和固定解剖所得的臟器標(biāo)本，可提供臨床病理討論及教學(xué)和科研之用，除對(duì)有典型的病變臟器制成標(biāo)本外，對(duì)有重要病變的臟器亦應(yīng)固定保存，條件允許可將全部臟器切成需要的大小保留。 通常所用的固定液是10%甲醛（即福爾馬林）水溶液（市售甲醛溶液用水稀

42、釋1：9）。這樣既可使組織內(nèi)的蛋白和脂類等成分凝固，又可使組織不致腐爛。為了保存組織內(nèi)的各種水溶性成分、如粘液、肝淀粉和尿酸鹽結(jié)晶等，應(yīng)在剖驗(yàn)當(dāng)時(shí)將部分臟器切成組織塊放入純酒精液固定，切不可著水。 只有細(xì)心且有計(jì)劃地進(jìn)行尸體剖檢，并在切除器官后仔細(xì)處理才能獲得良好地陳列標(biāo)本。剖檢過程中的粗心和草率，很容易破壞一個(gè)有價(jià)值的標(biāo)本。因?yàn)榻裉斓某Ｒ姴∶魈鞎?huì)成為罕見病例，為此重要的是保持這些病理標(biāo)本原有的形態(tài)和色澤。有時(shí)外科手術(shù)摘除的標(biāo)本，如經(jīng)適當(dāng)處理也可以成為最好的陳列標(biāo)本。 常規(guī)的福爾馬林固定后，大體標(biāo)本常呈灰褐色，用下述方法擬可保存大體標(biāo)本的色澤，使之更接近自然色彩。配方：甲醛 20ml 硝酸鉀

43、3g 醋酸鉀 3g 生理鹽水 加至 100ml固定時(shí)間視標(biāo)本的大小而定，一般2472小時(shí)。固定后經(jīng)充分的流水沖洗后再放入下述保存液中長期保存。 甘油 20ml 醋酸鉀 4g 麝香草酚 g 蒸餾水 加至 100ml（PH8）陳列標(biāo)本的固定一.為供日后臨床病理討論、教學(xué)和研究用的標(biāo)本，必須將有關(guān)主要病變的臟器和其它繼發(fā)變化的臟器一并保留，這樣就保持了各臟器病變的聯(lián)系性和整體性。二.將每一尸體的內(nèi)臟放入一個(gè)較大的玻璃缸內(nèi)。這種園缸應(yīng)有緊密的玻璃蓋，使之不漏氣。缸內(nèi)先裝半缸10%甲醛液，再將需要保留的各臟器放入，一定要浸在固定劑內(nèi)，若聽任露在液面外的組織變干，則會(huì)造成一塊永久的暗色區(qū)。三.各標(biāo)本如肝、

44、脾和腎等應(yīng)具有一光滑平整地切面（須以鋒利的長刃刀一次切出）。輕放在缸內(nèi)，以免彎曲變形，缸內(nèi)切不可多裝標(biāo)本，特別是新鮮的軟標(biāo)本和對(duì)有教學(xué)價(jià)值的標(biāo)本要分別固定，以免擠壓、防止固定不足和變形而失去原有的特征。缸內(nèi)固定液的量是標(biāo)本體積的45倍。一般實(shí)質(zhì)性臟器制作標(biāo)本時(shí)，其厚度宜在厘米左右，過厚則固定液不易滲透入內(nèi)，過薄則易變形翹起。四.肺臟標(biāo)本比重較輕，易漂浮在液面，可用薄層脫脂棉花覆蓋其表面、借以棉花纖維的虹吸現(xiàn)象，可不斷地浸濕標(biāo)本。在有條件的情況下，為保證充分固定，應(yīng)盡可能向標(biāo)本內(nèi)灌注固定劑。五.標(biāo)本放入固定液12小時(shí)后應(yīng)加以翻轉(zhuǎn)，以使標(biāo)本與缸底或缸壁接觸部分能很好浸透固定液。六.具有空腔的臟器（

45、如大、小腸）膜組織（如胸膜、腹膜等），皮膚等則應(yīng)在剪開后用扣針將其邊沿釘在硬紙板上，標(biāo)本朝下浸到固定液內(nèi)，以保持病變的形態(tài)，使用的扣針需防銹（也可用玻璃，竹簽或不銹鋼針）以免污染標(biāo)本。七.囊腔組織如果沒有打開可用注射器注入固定液使之充盈；如已打開則需填入浸有固定劑的脫脂棉以保持其自然狀態(tài)。八.被膽汁污染或含膽汁的標(biāo)本，必須分別固定貯存，否則會(huì)污染別的標(biāo)本。九.標(biāo)本的外觀、標(biāo)簽和目錄也同樣重要，大體標(biāo)本的編號(hào)最好用布條，用碳素墨水書寫解剖號(hào)碼，然后將布條浸漬溶化的石蠟，冷卻后將標(biāo)簽系于標(biāo)本上或投入缸內(nèi)，標(biāo)本缸外面亦須貼上解剖號(hào)碼，以便隨時(shí)取驗(yàn)。十.大體標(biāo)本的保存和管理必須予以重視，應(yīng)定期加入甲醛

46、溶液以補(bǔ)充平時(shí)之揮發(fā)。液體內(nèi)混和少量麝香草酚，作為防霉劑。平時(shí)也勤加管理，以防止發(fā)霉和標(biāo)本腐爛。除有明確病變需要保留的標(biāo)本外，對(duì)廢舊標(biāo)本亦須妥善處理。一般相隔36個(gè)月后，集中裝于草包內(nèi)焚化或深埋。第五節(jié) 脫 鈣組織里存有鈣鹽可妨礙用常規(guī)方法制作良好切片。骨組織及鈣化病灶，經(jīng)過固定后，必先將鈣鹽除去使組織軟化，才能進(jìn)行常規(guī)切片。如脫鈣不全則切片易撕開或碎裂并損傷切片刀刃。脫去鈣鹽的過程稱為脫鈣。脫鈣時(shí)應(yīng)注意：1.骨組織固定24小時(shí)后，鋸下不超過mm厚的薄骨片，再以10%福爾馬林固定后進(jìn)行脫鈣。（未固定的組織在酸性脫鈣液中受到的損傷比已固定的組織約大三倍）。骨組織過厚則需延長脫鈣時(shí)間，長時(shí)間浸于強(qiáng)

47、酸影響切片染色效果。2.在不影響診斷的條件下，應(yīng)將骨組織周圍的軟組織全部剝?nèi)ァＨ绻衅康脑谟谟^察骨髓病變或骨組織腫瘤，最好除去一部分正常的致密的骨組織，以利于脫鈣和制片。3.脫鈣前最好先將骨組織進(jìn)行脫脂。4.脫鈣要徹底，脫水應(yīng)充分，在脫水過程中，要注意不使其過度硬化。脫鈣劑優(yōu)質(zhì)脫鈣劑的標(biāo)準(zhǔn)是：（a） 完全脫鈣。（b） 不損傷組織細(xì)胞或纖維。（c） 不妨礙以后的染色技術(shù)。（d） 適當(dāng)?shù)拿撯}速度。一、強(qiáng)酸脫鈣劑1.含甲酸脫鈣液Gooding和Stewart氏液（甲酸福爾馬林液）配方：甲酸 525ml 福爾馬林 5ml 蒸餾水 加至 100ml5%的甲酸是一種良好的常規(guī)脫鈣劑，速度適當(dāng)，組織損害小

48、。當(dāng)甲酸成分增至25%則增快脫鈣速度，加入甲醛可適當(dāng)保護(hù)組織不受酸損害，但應(yīng)切記，增加脫鈣速度只能靠犧牲細(xì)胞微細(xì)構(gòu)造來獲得。 根據(jù)組織的厚度和鈣化程度，在5甲酸液內(nèi)24天可完全脫鈣，橫切的肋骨需3648小時(shí)。2.含鹽酸脫鈣液Von Ebner氏液配方：濃鹽酸 15ml 氯化鈉ml 蒸餾水 加至 100ml 鹽酸脫鈣易使組織收縮，作用速度較快，用氯化鈉作為溶劑則效果良好，牙齒脫鈣時(shí)鹽酸可增至1020%。脫鈣時(shí)，每日應(yīng)加鹽酸（0.5%）直至完成脫鈣，橫切的人肋骨（5毫米厚度）于3672小時(shí)內(nèi)脫鈣。硝酸脫鈣液是最常用的脫鈣劑，用硝酸作脫鈣液的缺點(diǎn)是形成亞硝酸而使溶液呈黃色，產(chǎn)生顏色即迅速影響脫鈣速度

49、，且組織的黃染會(huì)妨礙隨后的染色反應(yīng)。在硝酸內(nèi)加入尿素可以防止變黃而使之無色，但尿素僅有暫時(shí)作用，一旦硝酸顯淡黃時(shí)需要加入。福爾馬林硝酸液（Clayden氏液）配方：福爾馬林 5ml 硝酸（比重）15ml 蒸餾水 加至 100ml 此處方中甲醛可部分地抑制硝酸的浸軟作用，這即具有脫鈣作用，又具有固定作用，硝酸脫鈣迅速，組織不膨脹，掌握好脫鈣時(shí)間可直接脫水，不影響染色效果。但最好先洗去硝酸。 橫切人肋骨（5mm）用含硝酸液于12天內(nèi)脫鈣。硝酸水溶液配方：硝酸（用尿素穩(wěn)定） 510ml 蒸餾水 加至 100ml此液用作常規(guī)脫鈣劑，作用迅速，對(duì)組織不膨脹，對(duì)細(xì)胞的保存和染色比前者更好，能適用多種染色技

50、術(shù)，但每日需要更換新鮮溶液，最好早晚各一次，一般13天完成。 橫切人肋骨（5mm）在1224小時(shí)內(nèi)脫鈣。二、螯合劑脫鈣 乙二胺四乙酸（EDTA）是用以脫鈣地螯合劑。為有機(jī)化合物，有結(jié)合某些金屬的能力，能結(jié)合鈣鹽，15%的溶液即起脫鈣作用，組織用此方法脫鈣，對(duì)組織破壞性小，即放置數(shù)月亦不致引起對(duì)組織的破壞，對(duì)以后大多數(shù)的染色技術(shù)皆可得到滿意結(jié)果。 經(jīng)10%中性福爾馬林鹽固定后，將組織移到50倍用磷酸鹽緩沖劑緩沖至PH值等于7的EDTA內(nèi)。 不超過5毫米厚度的小塊組織在此液內(nèi)每45天換液一次，更換三次后再每天換液一次以便較準(zhǔn)確的確定脫鈣終點(diǎn)。脫鈣“終點(diǎn)”可用X射線方法或用草酸鹽化學(xué)方法。 完全脫鈣

51、后將組織直接移到70%酒精內(nèi)常規(guī)脫水，浸蠟，石蠟或火棉膠包埋。三、脫鈣步驟1取材：骨組織固定于10%福爾馬林24小時(shí)后再鋸取厚度約厘米骨片。2固定：再以10%福爾馬林固定2天。3將組織置于脫鈣劑中，每日更換新鮮液、直至組織軟化為止。4流水沖洗24小時(shí)（除酸）。5進(jìn)行常規(guī)脫水，透明，浸蠟，切片。四、鑒定脫鈣是否徹底確定脫鈣“終點(diǎn)”三種方法：1. 最常用的是最簡單的方法針刺，如果很容易被刺透，而且不感到阻力時(shí)，說明組織基本上脫鈣完全，否則應(yīng)繼續(xù)脫鈣?？拷M織的柔軟性測驗(yàn)脫鈣作用靠不住，而且這種插入一根針以察覺鈣沉淀的方法會(huì)造成組織損傷。2用X射線檢查：看組織內(nèi)是否仍有鈣質(zhì)。3用化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢查：取5ml

52、脫鈣液用2M的NaOH（氫氧化鈉）調(diào)整至中性，再加5草酸鈉或草酸銨1ml，液體混濁表示有鈣質(zhì)。遲至5分鐘仍不混濁表示脫鈣液中不含有鈣質(zhì)。組織中仍有鈣質(zhì)時(shí)，一定量的鈣離子會(huì)溶于脫鈣液中，游離的鈣會(huì)干擾脫鈣作用的完成。顯然，應(yīng)在每次試驗(yàn)時(shí)完全更換，再試驗(yàn)中必須經(jīng)過23小時(shí)間隔讓鈣溶解。五酸的中和脫鈣后水洗24小時(shí)，目的是除去組織中經(jīng)無機(jī)酸浸漬后過多的酸，以免影響染色。再?zèng)_洗前應(yīng)將組織用一種堿處理以使之脫酸呈中性，可用5硫酸鉀或硫酸鈉處理過夜。（否則會(huì)引起組織膨脹）但直接轉(zhuǎn)移到稀酒精（70）內(nèi)過1218小時(shí)換液2次，再繼續(xù)脫水，經(jīng)無水酒精，氯仿透明，石蠟包埋，切片，整個(gè)過程其酸已全部除去，在多數(shù)情況

53、下不僅不膨脹且對(duì)染色反應(yīng)能有所改善。因此不沖洗對(duì)染色也沒大礙，只是脫水劑被酸化。第六節(jié) 組織的沖洗組織經(jīng)過固定后，脫水之前應(yīng)進(jìn)行沖洗，將組織內(nèi)的固定液洗干凈，否則殘留組織內(nèi)的固定液有礙制片和染色，而有些固定液則可在組織中繼續(xù)起到脆化組織的作用，以至于損壞組織，給制片工作帶來不利。在沖洗時(shí)，沖洗劑的選擇應(yīng)依固定液的種類和性質(zhì)而有所不同。沖洗時(shí)應(yīng)注意以下事項(xiàng)：水溶性的固定劑：需用流水沖洗。酒精溶劑的固定劑：應(yīng)用同濃度的酒精浸洗。含苦味酸的固定劑：（苦味酸與甲醛混合液除外），須用70酒精浸洗，以免水洗后固定作用消失。含有升汞固定劑：組織經(jīng)固定后應(yīng)在沖洗劑水或酒精中加碘以洗去組織內(nèi)汞的沉淀。含有鉻酸的

54、固定劑：組織在沖洗時(shí)最好置于暗處，以免產(chǎn)生沉淀或使組織硬化而影響制片。第二章 石蠟包埋技術(shù)制作石蠟切片，切片前須將石蠟滲透組織包埋于石蠟中，而水與石蠟又是不相混合的，所以在浸蠟，包埋前必須將組織內(nèi)所含的水分脫去。而大多數(shù)的組織固定劑是水溶液，隨后的水沖洗也使其含有大量水分，因此必須先行脫水，一般是浸入逐級(jí)增加濃度的酒精來完成。由于酒精和石蠟不能混合，須再用一種石蠟的溶劑來置換酒精，因大多數(shù)石蠟溶劑有使組織的折光率增高并表現(xiàn)為透明或半透明狀，所以此步驟又稱透明。最后用石蠟浸漬組織并鑄制成堅(jiān)實(shí)的蠟塊。常規(guī)的石蠟包埋過程包括五個(gè)基本步驟，即固定，脫水，透明，浸蠟和包埋，前一章中已述過固定。 脫 水脫

55、水就是用脫水劑完全除去組織內(nèi)的水分，為下一步透明及浸蠟創(chuàng)造條件。此外，脫水還可以使組織再次發(fā)生一定的硬化，脫水劑必須是與水在任何比例下均能混合的液體。常用的脫水劑1酒精：是制片最常用的試劑，可與水在任何比例下相混合，酒精的脫水能力比較強(qiáng)，又能硬化組織。但是酒精的船頭速度很快，對(duì)于組織會(huì)有明顯的收縮作用。因此在以酒精作為脫水劑時(shí)，應(yīng)該先從濃度較低的酒精開始，然后遞增其濃度，這樣可以避免組織過度收縮。第一瓶酒精濃度隨固定劑，脫水組織的大小和種類而異，經(jīng)水溶性固定劑固定的細(xì)柔組織需要慢慢脫水，從50酒精開始。如眼球，組胚組織等大多數(shù)組織標(biāo)本則是從70酒精開始，再經(jīng)80，95以至無水酒精。但是有時(shí)為了

56、某種特殊要求，例如要做糖元的切片標(biāo)本或是要做尿酸結(jié)晶染色切片標(biāo)本，為了防止糖元和尿酸結(jié)晶在水中消失卻要直接投入無水酒精中固定，而不需要經(jīng)過水洗和低濃度酒精的脫水過程。經(jīng)無水酒精固定后的組織只需要再經(jīng)過換一次無水酒精脫水即可。用AAF固定液固定的組織可直接置于95酒精開始脫水。用醇性固定劑（如Carnoy）則可置于高濃度無水酒精內(nèi)，但應(yīng)多次換液以除酸。一般情況下，組織經(jīng)過70，80，90，95，以至無水酒精的脫水程序，即可達(dá)到脫水的要求。但是為了能使大量的組織塊同時(shí)進(jìn)行脫水，則要求保持液體的濃度以保證脫水的作用，最好是以兩次95酒精，兩次100酒精重復(fù)進(jìn)行脫水，以保證組織的水分脫凈。脫水時(shí)間應(yīng)視

57、組織種類，組織塊大小，厚薄和固定劑的不同而異。如脫鈣的骨組織，實(shí)質(zhì)性臟器等的脫水過程宜短，而疏松結(jié)締組織，脂肪組織等，脫水過程則宜適當(dāng)延長。水分必須脫干凈，脂肪必須溶去。含有鉻酸的固定劑固定的組織，脫水時(shí)間不宜過長，而鍍銀組織更應(yīng)注意，脫水時(shí)間應(yīng)比為鍍銀的同類組織要短。脫水的基本原則：從低濃度酒精開始逐漸升到高濃度酒精，以保持組織中的水分完全脫凈。一般1cmX1cmX大小的組織,脫水全過程僅需要數(shù)小時(shí)即可達(dá)到完全脫水。在各級(jí)濃度酒精內(nèi)處理的最短時(shí)間分別減少到24小時(shí)也能獲得滿意的結(jié)果。如果組織脫水不盡,隨后的透明,浸蠟都會(huì)受到影響,致使切片很難以完成。較差質(zhì)量的切片,很容易造成在染色時(shí)脫片,這

58、樣的組織蠟塊，因其含有一定的水分,一經(jīng)與空氣接觸即干燥而凹陷。脫水不盡的組織是不能切出很好的切片的。外檢標(biāo)本的制作,目前都采用快速脫水的方法。科研標(biāo)本,教學(xué)標(biāo)本的脫水時(shí)間比較長,其目的在于更充分脫水,并適當(dāng)加強(qiáng)了組織的硬度。酒精脫水劑使用不宜太久,應(yīng)適時(shí)更換新液。當(dāng)酒精混濁,變黃或酒精滴于水中出現(xiàn)乳白色混濁時(shí),說明酒精中溶解了過量的脂類,這種情況一出現(xiàn),將會(huì)影響脫水,則應(yīng)及時(shí)更換。各種濃度酒精的配制：切片室內(nèi)應(yīng)常備有70%,80%,85%等各種濃度的酒精。配制時(shí)應(yīng)以95%酒精作為基液加水稀釋,不要用無水酒精去配制,因無水酒精的價(jià)格較高,極不經(jīng)濟(jì)。配制方法如下：1先將高濃度酒精注入量杯，其量同將

59、要稀釋酒精濃度數(shù)字相等。2加入蒸餾水，致總量達(dá)到原酒精濃度的數(shù)字量。例如：(一)用95%酒精配制成70%酒精時(shí)：(1)取95%酒精70毫升；(2)加蒸餾水使達(dá)到95毫升；稀釋后的酒精既為70%的酒精。(二) 用80%酒精配制成60%酒精時(shí)：(1)取80%酒精60毫升；(2)加蒸餾水使達(dá)到80毫升；稀釋后的酒精既為濃度為60%的酒精.其余類推,其他的試劑的稀釋也均可以參照此方法進(jìn)行配制。2.丙酮(Acetone)：可用作固定液,也是一種比較好的脫水劑。脫水能力強(qiáng)、速度快,可配制不同濃度進(jìn)行脫水。但一般情況下,多用在無水酒精的補(bǔ)充脫水。丙酮脫水時(shí)間比酒精強(qiáng),但容易使組織過度硬化,所以應(yīng)適當(dāng)掌握脫水

60、時(shí)間。3.正丁醇(-Buty alcohol)：正丁醇脫水能力較酒精弱,可與水、酒精相混合,而且也能溶解石蠟,因此正丁醇不僅可以替代酒精使組織脫水,還可以代替二甲苯使組織透明。平常在稀釋時(shí)都與酒精按照一定比例配制使用,或?qū)⒔M織脫水至90%酒精后移入正丁醇, 正丁醇再脫水后可直接投入石蠟。用正丁醇脫水,組織比較少引起收縮和硬化等不良結(jié)果。4.二氧乙環(huán)(Dioxan)：二氧乙環(huán)是一種有毒物質(zhì),易揮發(fā)(使用場所必須通風(fēng)),能同水、酒精、二甲苯相混合并能溶解石蠟,是一種既可以脫水,也具有透明效果的液體。脫水一般可以70%開始,再經(jīng)過90%至純二氧乙環(huán),然后浸入石蠟。二氧乙環(huán)脫水對(duì)組織無收縮和硬化等不良