gg基因工程的操作程序課件

1、第二節(jié) 基因工程的基本操作程序第1頁，共22頁。基因工程的基本操作程序獲取目的基因構建表達載體導入受體細胞目的基因檢測與鑒定第一步第二步第三步第四步第2頁，共22頁。一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸熘蝎@取目的基因1. 基因組文庫 將含有某種生物不同基因的許多片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。 受體菌包含了某種生物所有的基因，該受體菌群體稱為這種生物的基因組文庫。2. 部分基因文庫 受體菌包含了一種生物部分基因，該受體菌群體稱為這種生物的部分基因文庫，如cDNA文庫。第3頁，共22頁。3. 基因文庫的構建（1）基因組文庫的構建提取某生物全部DN

2、A用適當限制酶切割許 多DNA片段與載體連接導入受體菌群該生物基因組文庫（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文庫的構建mRNA反轉錄形成mRNA逆轉錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA與載體連接導入受體菌群該生物cDNA文庫第4頁，共22頁。（二）利用PCR技術擴增目的基因1. 原理 PCR是聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction）,它是利用DNA 雙鏈復制的原理，將基因的核苷酸序列不斷的加以復制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。因為整個過程是在體外進行，所以又叫做體外DNA擴增技術。第5頁，共22頁。2. 過程高溫變性（9095）低溫退火（

3、5560）中溫延伸（7075） 雙鏈DNA是在高溫條件下解鏈為單鏈DNA的，因此整個過程不需要解旋酶。多次重復3.特點：指數(shù)形式擴增第6頁，共22頁。（三）通過DNA合成儀直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測推測合成 當基因比較小、蛋白質的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。第7頁，共22頁。二、基因表達載體的構建 用限制酶切割質粒使之出現(xiàn)一個切口，將目的基因插入切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補配對后，在連接酶的作用下連接形成重組DNA分子，即基因表達載體。（一）構建目的 使目的基因在受體細胞中穩(wěn)

4、定存在，并且可遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。第8頁，共22頁。質粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA第9頁，共22頁。1.用一定的_切割 質粒，使其出現(xiàn)一個切 口，露出_。2.用_切斷目 的基因，使其產生_ _。 核心3.將切下的目的基因片段插入質粒的_處， 再加入適量_，形成了一個重組 DNA分子（重組質粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同基因表達載體的構建第10頁，共22頁。 科學家在培育抗蟲棉時，經過了許多復雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質粒中，然后導入棉花的受精卵中，結果抗蟲基因在棉花體內沒有表達

5、。 然后在插入抗蟲基因的質粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學家又在有啟動子、抗蟲基因的質粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導入棉花受精卵，結果成長的植株，有了抗蟲能力。 資 料:第11頁，共22頁。（二）構建零件及其作用1. 目的基因2. 啟動子 RNA聚合酶識別和結合的一段特殊結構的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶與之結合才能驅動基因轉錄出mRNA，進而獲得需要的蛋白質。第12頁，共22頁。3. 終止子 一段特殊結構的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使轉錄在所需要的地方停止。4. 標記基因 鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目

6、的基因的細胞篩選出來。第13頁，共22頁。三、將目的基因導入受體細胞 將目的基因導入受體細胞并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程稱為轉化。 基因工程中常用的受體細胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌和動植物細胞等。 第14頁，共22頁。1.農桿菌轉化法（一）導入植物細胞2.其他方法（見教材P12“生物技術資料卡”）（1）基因槍法（2）花粉管通道法第15頁，共22頁。（二）導入動物細胞顯微注射技術含目的基因的表達載體動 物 的受 精 卵含目的基因的受精卵早 期胚 胎雌性動物輸卵管或子宮轉基因動 物顯微注射分裂分化移 植發(fā)育第16頁，共22頁。（三）導入微生物細胞2. 常用受體細胞 大腸桿菌（E.c

7、oli）1. 過程（1）制備感受態(tài)細胞：用Ca2+（CaCl2）處理細胞，改變細胞膜的通透性，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。（2）重組DNA分子與感受態(tài)細胞混合，完成轉化。Ca2+ 處理法第17頁，共22頁。四、目的基因的檢測與鑒定 目的基因是否真正插入受體細胞的DNA中，是否能夠在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達，只有通過檢測、鑒定才能得知。 常用的檢測手段主要從分子水平和個體水平進行。第18頁，共22頁。（一）分子水平1. 檢測轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因 提取受體生物全部DNA適當限制酶切割DNA片段用同位素標記的目的基因片段雜交顯 出雜交帶（表明目的基因已插入）分子雜交技術第19頁，共22頁。2. 檢測目的基因是否轉錄出了mRNA 提取受體生物的mRNA用同位素標記的目的基因片段雜交顯 出雜交帶（表明目的基因已轉錄出了mRNA） 檢測DNA利用的是DNA與DNA雜交，檢測mRNA利用的是DNA與mRNA雜交。第20頁，共22頁。3. 檢測目的基因是否翻譯出蛋白質 抗原抗體雜交技術提取受體生物的蛋白質與相應抗