15：15-15：35 陳長蘭-微波法蟲草素提取

1、 微波法與超聲破碎法提取蛹蟲草菌絲體中蟲草素的比較研究 Comparison of the Extration of Cordycepin from Cordyceps militaris by Ultrasonic and Microwave method 黃子琪，賁松彬 1所從事研究方向一.分子生物學(xué)方面:1.動物硒蛋白的細胞定位和分子功能研究.主要在研課題有:國家自然基金課題(30671176) ,果蠅硒蛋白G-rich的細胞定位和分子功能研究2.食藥用真菌的富硒和有效成分研究.主要在研課題有:遼寧省教育廳重點實驗室項目(2009S046)；蛹蟲草液體培養(yǎng)提高菌絲體及培養(yǎng)液中蟲草素含量配

2、套技術(shù)研究.2 1 硒的作用 硒是哺乳動物自身不可缺少的一種微量元素，硒具有多重生物學(xué)功能，人和動物的多種疾病被證實與硒缺乏密切相關(guān)，硒和維生素E都是抗氧化劑，二者相輔相成，硒參與甲狀腺激素代謝、抗氧化系統(tǒng)使機體發(fā)揮正常免疫功能。缺硒會引起如衰老組織硬化、肝壞死、發(fā)生克山病，大骨節(jié)病、精神萎靡不振，精子活力下降，易患感冒生長遲緩等10 (近年來又發(fā)現(xiàn)缺硒與許多常見的慢性病有關(guān)，如引發(fā)心肌病、心肌衰竭疾病、癌癥、HIV 感染等11 。3 2 硒蛋白的分類、分布及功能 研究證實，硒以兩種形式存在于蛋白質(zhì)中，一種是以富硒植物和富硒微生物為代表，通過隨機取代蛋白質(zhì)中的硫的形式進入蛋白質(zhì)，所形成的蛋白質(zhì)

3、叫做含硒蛋白12、13（Se-containing protein），這一類蛋白質(zhì)往往沒有確定的生理功能。 另一種是硒以一套高度特化的編碼和合成機制合成蛋白質(zhì)，利用三個終止密碼子之一的UGA 作為密碼子，通過以硒代半胱氨酸（Sec）的形式進入到蛋白質(zhì)中，所形成的蛋白質(zhì)叫做硒蛋白（Selenoprotein），這類硒蛋白在生物體內(nèi)具有特定的生理功能。因此有人認(rèn)為Sec被認(rèn)為是生物體內(nèi)的第21種氨基酸 。4 在已知的哺乳動物硒蛋白中大多可以分成六大類：碘甲腺原氨酸脫氫酶（ID）家族、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）家族、硫氧還蛋白還原酶（TR）、硒蛋白P （Se-P）、硒代磷酸合成酶（SPS）和

4、硒蛋白W （Se-w）。 5 在已知的哺乳動物硒蛋白中大多可以分成六大類：碘甲腺原氨酸脫氫酶（ID）家族、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）家族、硫氧還蛋白還原酶（TR）、硒蛋白P （Se-P）、硒代磷酸合成酶（SPS）和硒蛋白W （Se-w）。 6在參會的另一篇論文蛹蟲草富硒條件優(yōu)化及硒對其中主要活性成分的影響賁松彬，黃子琪，王 瑩，侯 瀟，陳長蘭 發(fā)現(xiàn)在最優(yōu)化富硒培養(yǎng)條件下，菌絲體中兩種主要藥用活性成分：蟲草多糖和蟲草素，其含量分別為226.3mg/g和2.22mg/g，是非富硒菌絲體中的3.4倍和5.8倍，能大幅提高蛹蟲草的藥用價值，為富硒可促進蟲草多糖和蟲草素等活性成分增加的機理研究提

5、供一定的理論依據(jù)。 本論文側(cè)重于對從蛹蟲草中提取蟲草素條件的研究. 7目 錄一.蛹蟲草與蟲草素簡介二.蟲草素提取方法的研究現(xiàn)狀三.微波法與超聲破碎法簡介四.微波法提取蟲草素的單因素實驗五.微波法提取蟲草素的正交試驗六.超聲破碎法提取蟲草素的單因素實驗七.超聲破碎法提取蟲草素的正交試驗八. 微波提取法和超聲波提取法的比較8一.蛹蟲草與蟲草素簡介9 冬蟲夏草和蛹蟲草是近年來食藥用真菌中的研究熱點之一.它們都具有提高人體免疫力和抗癌抗氧化等重要生理功能.其主要藥用成分都是蟲草多糖和蟲草素. 50年代即從蛹蟲草人工培養(yǎng)液的菌絲中分離出蟲草素(Cordycepin) ，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為3-脫氧腺苷(3-De

6、oxyadenosine)。 蟲草素是一種具有抑制細胞分裂作用和抗生素作用的生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抑菌、抗瘧原蟲、抑制病毒、防治心腦血管疾病、增強免疫等功能。由于蟲草素為具有重要藥用價值的生物活性物質(zhì)，近年來對于它的研究受到廣泛重視。 : : 10二.蟲草素提取方法的研究現(xiàn)狀 蟲草素溶于水、熱乙醇、甲醇，所以一般采用水、乙醇或甲醇等作為溶劑提取蟲草素。 目前常用的提取方法有：浸提法、超聲法、索氏提取法和回流法和微波提取法。傳統(tǒng)的提取方法如浸提法、索氏提取法和回流法存在著耗時長、被提取成分損失大、工序多不利于下一步實驗進行、提取效果一般等缺點 11三.蟲草素的高效液相色譜測定分別稱取0.20

7、g蛹蟲草菌絲體干粉，加入100ml超純凈水，調(diào)節(jié)pH值為5、6、7、8、9，采用微波功率為500W提取3min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮至50ml，濃縮液濾紙過濾，上清液過0.2nm微孔濾膜，濾液靜置一夜，10000r/min離心5min，經(jīng)過超聲清洗后進高效液相色譜柱檢測蟲草素提取率。12三.蟲草素的高效液相色譜測定1.6.1 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)液的配制 準(zhǔn)確稱取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品0.0050g，超純水溶解定容至10.0ml，配制成500mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再將其稀釋成10、20、30、50、70、100g/ml蟲草素標(biāo)準(zhǔn)液，待測定?；貧w方程為：y=-58391.8720930233+58011.315

8、1162791.x ,相關(guān)系數(shù) r0.99971.6.2 蟲草素的HPLC 測定色譜條件：色譜柱Waters Nova-pak C18 4.6mm 250mm，5m；流動相為超純水-乙腈；流速1.00ml/min；柱溫為35；檢測波長260nm；進樣20l。梯度洗脫。13四.微波法提取蟲草素單因素實驗1. 不同提取液pH值的提取效果pH=5.0 、pH=6.0的酸性浸提液和pH=9.0、pH=8.0堿性提取液明顯提高蟲草素的浸出率。 采取方式：首先確定提取液適宜pH，其次提取溶劑，其次提取時間、其次功率。14四.微波法提取蟲草素單因素實驗2.不同提取溶劑的提取效果 從表4 可知，當(dāng)以微波輔助提

9、取時，當(dāng)提取溶劑為乙醇時蟲草素的提取得率明顯的比提取溶劑為純凈水時要低。在水與乙醇以不同比例混合為提取溶劑的實驗中，水和乙醇比例為1:3時提取效果最好。表4 不同提取溶溶劑的提取效果數(shù)據(jù)表Table 4 Extraction ratio of different solvents 提取液 水 乙醇 水:乙醇=1:1 水:乙醇=1:3 水:乙醇=3:1蟲草素得率(mg/g)1.357 1.242 1.279 1.447 1.20715四.微波法提取蟲草素單因素實驗3.不同提取時間的提取效果 表5 不同處理時間的提取效果數(shù)據(jù)表 Table 5 Extraction ratio of differe

10、nt extraction time提取時間(min) 1 2 3 4 5 蟲草素得率(mg/g) 1.303 1.486 1.668 1.497 1.324從表5 可以看出，用500w微波處理時，隨著處理時間的延長，蟲草素的提取率逐步增長，若繼續(xù)延長處理時間蟲草素的提取率有小幅回落。其中微波爐功率為500W，提取3.0min時蟲草素提取效果最好。 16四.微波法提取蟲草素單因素實驗4.不同微波功率的提取效果 2.1.4 不同功率的提取效果表6 不同處理功率的提取效果數(shù)據(jù)表Table 6 Extraction ratio of different microwave power微波功率 300

11、W 500W 1000W蟲草素得率(mg/g) 1.570 2.431 2.031從表6 中可以看出，在微波提取中，功率為500W時蟲草素的提取得率較另兩個功率下的蟲草素含量提取得率明顯要高?？梢娞崛r間為3.0min，微波功率為500W提取效果最佳。17五.微波法提取蟲草素正交實驗表11 微波法提取蟲草素正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析Table 11 Analysis of orthonogal design for microwave extraction 實驗號 提取液pH值 提取液 微波功率 提取時間 蟲草素得率 (W) (min) (mg/g)1 5 水 300w 1 1.1672 5 水:

12、乙醇=1:3 500w 2 1.6483 5 水:乙醇=1:1 1000w 3 0.9374 7 水 500w 3 1.6005 7 水:乙醇=1:3 1000w 1 1.2916 7 水:乙醇=1:1 300w 2 1.2017 9 水 1000w 2 0.7138 9 水:乙醇=1:3 300w 3 1.2659 9 水:乙醇=1:1 500w 1 1.199K1 3.752 3.480 3.633 3.657K2 4.092 4.204 4.447 3.562K3 3.177 3.337 2.941 3.802R 0.915 0.867 1.506 0.240 18五.微波法提取蟲草素正

13、交實驗從表11極差R分析結(jié)果可知：微波法R值由大到小依次為微波功率，提取溶液的pH值，提取溶劑和提取時間。從正交分析表直觀分析可以看出，各因子單因素的不同水平中， 分別以A2(pH7.0) 、B2(水：乙醇=1：3) 、C3 (500w)、D3(3min)水平的極差最大，為最優(yōu)水平，但其組合A2B2C2D3 未包括在參加試驗的9個組合為此， 加做一個該組合處理， 測得蟲草素含量為1.731mg/g，證明該組合確實優(yōu)于組合2和4。19六.超聲波法提取蟲草素單因素實驗1. 不同提取液pH值的提取效果pH=5.0 、pH=6.0的酸性浸提液和pH=9.0、pH=8.0堿性提取液明顯提高蟲草素的浸出率

14、。 表7 不同提取液pH值的提取效果數(shù)據(jù)表Table 7 Extraction ratio of different solvent pH提取液pH值 5 6 7 8 9蟲草素得率(mg/g) 1.117 0.714 0.479 1.423 1.40120六.超聲波法提取蟲草素單因素實驗2.不同提取液的提取效果 從表8 可以看出，乙醇作為提取溶劑的提取效率反而比純凈水要低，水和乙醇比例為1:3時提取效果最好。超聲波破碎法中水和乙醇比例為1:3的混合溶劑提取效果最佳，此點與微波法相似。 表8 不同提取溶液的提取效果數(shù)據(jù)表 Table 8 Extraction ratio of different

15、 solvents提取液 水 乙醇 水:乙醇=1:1 水:乙醇=1:3 水:乙醇=3:1蟲草素得率(mg/g) 1.214 1.119 1.207 1.231 1.20121六.超聲波法提取蟲草素單因素實驗3.不同提取時間的提取效果 表9 不同處理時間的提取效果數(shù)據(jù)表Table 9 Extraction ratio of different extraction time提取時間(min) 20 25 30 35 40 蟲草素得率(mg/g) 1.117 1.211 1.347 1.225 1.119 從表9 可以看出，當(dāng)超聲波功率為600W處理時，隨著處理時間的延長，蟲草素的提取率逐步增長，

16、若繼續(xù)延長處理時間蟲草素的提取率有小幅回落。其中提取時間為30min時蟲草素提取效果最好。 22六.超聲波法提取蟲草素單因素實驗4.不同微波功率的提取效果從表10 中可以看出，800W時超聲破碎法提取蟲草素含量測定值最大。從表10 中可以看出，800W時超聲破碎法提取蟲草素含量測定值最大。 表10 不同處理功率的提取效果數(shù)據(jù)表 Table 10 Extraction ratio of different ultrasonic power超聲功率（W） 200 400 600 800 1 000 蟲草素得率(mg/g) 1.102 1.119 1.123 1.323 1.207 23七.超聲波法

17、提取蟲草素正交實驗表12 超聲破碎法提取蟲草素正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析Table 12 Analysis of orthonogal design for ultrasonic extraction 實驗號 提取液pH值 提取液 超聲波功率 提取時間 蟲草素得率 (W) (min) (mg/g)1 5 水 400 25 0.854 2 5 水:乙醇=1:3 600 30 1.2353 5 水:乙醇=1:1 800 35 1.3974 7 水 600 35 1.435 5 7 水:乙醇=1:3 800 25 1.119 6 7 水:乙醇=1:1 400 30 1.2217 9 水 800 30 1

18、.2238 9 水:乙醇=1:3 400 35 1.2259 9 水:乙醇=1:1 600 20 1.117 K1 3.486 3.512 3.301 3.090K2 3.775 3.579 3.787 3.739K3 3.565 3.735 3.739 4.057R 0.289 0.223 0.486 0.967 24七. 超聲波法提取蟲草素正交實驗從表12極差R分析結(jié)果可知：超聲破碎法R值由大到小依次為提取時間、超聲波功率、提取溶液的pH值和提取溶劑。從正交分析表的直觀分析可以看出，各因子單因素的不同水平中， 分別以A2(pH7.0) 、B3(水：乙醇=1：1) 、C2 (600W)、D3(35min)水平的極差最大，為最優(yōu)水平，但其組合A2B3C2D3 未包括在參加試驗的9個組合為此， 加做一個該組合處理， 測得蟲草素含量為1.447mg/g，證明該組合確是優(yōu)于組合4和3。25八. 微波提取法和超聲波提取法的比較 根據(jù)以上確定的微波法和超聲波法提取的最佳提取條件，即微波法的處理組合為A2(pH7.0) 、B2(水:乙醇=1:3) 、C3 (500w)、D3(3min)，超聲波