豬病實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷技術(shù)細(xì) 菌 學(xué) 檢 查

1、、細(xì) 菌 學(xué) 檢 查（一）細(xì)菌的分離培養(yǎng) 1培養(yǎng)基制作的原則和一般步驟 （1）培養(yǎng)基制作的原則 培養(yǎng)基是人工方法將多種物質(zhì)按照各類微生物生長(zhǎng) 的需要而合成的一種混合營(yíng)養(yǎng)料，一般用以分離和培養(yǎng)菌類。常用的培養(yǎng)基有基礎(chǔ)培養(yǎng)基、增菌培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等。在制作培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)掌握如下原則和要求： = 1 * GB3 培養(yǎng)基必須含有細(xì)菌生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 = 2 * GB3 必須徹底滅菌,不得含有任何活細(xì)菌。 = 3 * GB3 培養(yǎng)基的材料和盛培養(yǎng)基的容器上,沒(méi)有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)。 = 4 * GB3 所制備培養(yǎng)基應(yīng)該是透明的，以便觀察細(xì)菌生長(zhǎng)性狀和其它代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的變化。 = 5 *

2、 GB3 培養(yǎng)基的酸堿度應(yīng)該符合細(xì)菌的生長(zhǎng)要求，多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)適宜范圍是弱堿（pH7.17.6）。 （2）培養(yǎng)基制備的一般過(guò)程 不同的培養(yǎng)基其制備方法不同，一般要經(jīng)如下步驟： = 1 * GB3 根據(jù)不同的菌類和用途，選擇適宜的培養(yǎng)基。 = 2 * GB3 精確稱量各種成分。 = 3 * GB3 將各種成分按規(guī)定加熱溶解，調(diào)整pH到適宜的范圍內(nèi)。再加熱煮沸1015分鐘（注意補(bǔ)加液體的損耗） = 4 * GB3 過(guò)濾（用濾袋或紗布棉花），分裝、滅菌（不同的培養(yǎng)基的滅菌溫度和時(shí)間不同，通常為15磅壓力下1530分鐘） = 5 * GB3 培養(yǎng)基中的某些成分，象血清、腹水、糖類、尿素、氨基酸、酶等，在

3、高溫下易分解，變性，故應(yīng)用濾菌器過(guò)濾，再按規(guī)定的溫度和量加入培養(yǎng)基中。 = 6 * GB3 無(wú)菌檢驗(yàn)，取作好的培養(yǎng)基數(shù)管，置37恒溫箱內(nèi)24小時(shí)，若無(wú)細(xì)菌和霉菌生長(zhǎng)即可使用。 2細(xì)菌的分離培養(yǎng) 在細(xì)菌學(xué)診斷中，細(xì)菌的分離培養(yǎng)是不可缺少的一環(huán)，分離培養(yǎng)的目的是在病料中由多種細(xì)菌里挑選出可疑菌。在分離培養(yǎng)之前，首先應(yīng)該注意下列事項(xiàng)：（1）選擇適合于所含分離細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。（2）培養(yǎng)溫度一般在37，但應(yīng)考慮特殊細(xì)菌對(duì)溫度的要求。 （3）考慮所分離的細(xì)菌是需氧性或厭氧性，進(jìn)一步?jīng)Q定培養(yǎng)條件。 （4）初步分離時(shí)發(fā)現(xiàn)有多種細(xì)菌，應(yīng)進(jìn)一步選擇可疑菌落進(jìn)行純培養(yǎng) 細(xì)菌的接種 1平板劃線法 此法為常用的細(xì)菌分

4、離培養(yǎng)法。平板劃線培養(yǎng)的方法甚多，可按各人的習(xí)慣選擇應(yīng)用，其目的都是將被檢材料作適當(dāng)?shù)南♂專郧螳@得獨(dú)立單在的菌落，防止發(fā)育成菌苔，以致不易鑒別其菌落性狀。劃線培養(yǎng)時(shí)須注意以下幾點(diǎn)： （1）左手持皿，用左手拇指，食指及中指將皿蓋揭開成20度左右的角度（角度愈小愈好，以免空氣中的細(xì)菌進(jìn)入皿中將培養(yǎng)基污染）。 （2）右手持接種環(huán)，將材料少許涂布于培養(yǎng)基邊緣，然后將接種環(huán)上多余的材料在火焰中燒毀，待接種環(huán)冷卻后，再與涂材料之處輕輕接觸，開始劃線。 （3）劃線時(shí)先將接種環(huán)稍稍彎曲，這易和平皿內(nèi)瓊脂平行，不致劃破培養(yǎng)基。 （4）劃線中不宜過(guò)多地重復(fù)舊線，以免形成菌苔。 （5）平皿蓋向下，在培養(yǎng)皿上標(biāo)注樣

5、品名稱、編號(hào)、接種日期后，置溫箱中培養(yǎng)。 2斜面接種法 3液體培養(yǎng)基接種法 （三）細(xì)菌培養(yǎng)性狀觀察 1細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)性狀觀察 （1）渾濁度 觀察是否透明，輕度渾濁，中度渾濁或極度渾濁，還有均勻渾濁，顆粒狀渾濁，絮狀渾濁。 （2）沉淀 試管底有無(wú)沉淀，沉淀物呈顆粒狀，粘稠狀或絮狀。輕搖時(shí)云霧狀，絮狀或發(fā)辮狀開起。（3）表面 有無(wú)菌膜及附著于管壁的菌環(huán)。 （4）色素及氣味 2細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)性狀觀察 （1）大小 各種細(xì)菌菌落大小差異很大，菌落直徑在1毫米以下為露滴狀菌落；12毫米為小菌落；24毫米為中等大菌落；46毫米或更大為大菌落。 （2）形狀 有圓形、規(guī)則形、根足形、菌絲狀等

6、。（3）邊緣 有整齊、鋸齒狀、纖毛狀、卷發(fā)狀等。（4）表面 有光滑、濕滑、粗糙、顆粒狀、皺絲狀、同心狀、放射狀等。（5）降起度 有角平、隆起、臍狀、扭扣狀。（6）顏色 有無(wú)色、白色、灰白色、金黃色、檸檬色、綠色、紅色等。（7）透明度 有透明、半透明、不透明等。 （四）顯微鏡檢查細(xì)菌抹片制備、染色及鏡檢 細(xì)菌細(xì)胞微小，無(wú)色而半透明，原樣直接在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，只能大致見到其外貌，制成抹片和染色之后，則能較清楚地顯示其形態(tài)和特殊構(gòu)造，也可以根據(jù)不同的染色反應(yīng)，作為鑒別細(xì)菌的一種依據(jù)。常應(yīng)用各種染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，由于毛細(xì)管、滲透、吸附和吸收等物理作用，以及離子交換，酸堿等化學(xué)作用，染料就能使細(xì)

7、菌著色，且因細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分不同，而含有不同的染色反應(yīng)。 1細(xì)菌抹片的制備進(jìn)行細(xì)菌染色之前，須先作好細(xì)菌抹片，其方法如下：（1）玻片準(zhǔn)備 載玻片應(yīng)清晰透明、潔凈而無(wú)油漬，滴上水后，能均勻展開，附著性好。如有油漬，可按下列方法處理： = 1 * GB3 滴上95%酒精23滴，用潔凈紗布揩擦，然后在酒精燈火焰上輕輕拖過(guò)幾次。 = 2 * GB3 若上法仍未能去除油漬，可再滴上12滴冰醋酸，用紗布擦凈，再在酒精燈火焰上輕輕通過(guò)。（2）抹片 所用材料情況不同，抹片方法亦有差異。液體材料（如液體培養(yǎng)物、血液、滲出液、乳汁等）可直接用滅菌接種環(huán)取一環(huán)材料，于玻片的中央均勻地涂布成適當(dāng)大小的薄層。不

8、是液體材料（如菌落、膿、糞便等）則應(yīng)先用滅菌接種環(huán)取少量生理鹽水或蒸餾水，置于玻片中央，然后再用滅菌接種環(huán)取少量材料，在液滴中混合，均勻涂布成適當(dāng)大小的薄層。組織臟器材料，先用鑷子夾持局部，然后以滅菌或潔凈剪刀取一小塊，夾出后將其新鮮切面在玻片上壓積或涂抹成一薄片。如有多個(gè)樣品同時(shí)需要制成抹片，只要染色方法相同，亦可以在同一張玻片上有秩序地排好，作多點(diǎn)涂抹，或者先用蠟筆在玻片上劃分成若干小方格，每方格涂抹一種樣品，需要保留標(biāo)本片，應(yīng)貼標(biāo)簽，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。（3）干燥 上述涂片，應(yīng)讓其自然干燥。（4）固定 有兩類固定方法。 火焰固定 將干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在

9、酒精燈火焰上來(lái)回通過(guò)數(shù)次，略作加熱（但不能太熱，以不燙手背為度）進(jìn)行固定。 化學(xué)固定 血液、組織臟器等抹片要作姬姆薩（Giemsa）染色，不用火焰固定，而應(yīng)用甲醇固定，可將已干燥的抹片浸入甲醇中23 分鐘，取出晾干；或者在抹片上滴加數(shù)滴甲醇使其作用23分鐘后，自然揮發(fā)干燥。抹片如作瑞特氏染色（Wrights stain），則必先須作特別固定，染料中含有甲醇，可以達(dá)到固定的目的。將抹片固定的目的有如下幾種：除去抹片的水分，涂抹材料能很好地貼附玻片，以免水洗時(shí)易被沖掉使抹片易于著色或更好地著色，因?yàn)樗赖牡鞍踪|(zhì)比活的蛋白質(zhì)著色力較強(qiáng)。 = 3 * GB3 可能殺死抹片中的微生物。 必須注意：在抹片固

10、定過(guò)程中，實(shí)際上并不能保證殺死全部細(xì)菌，也不能完全避免在染色水洗時(shí)不將部分抹片沖脫。因此，在制備烈性病原菌，特別是帶芽孢的病原菌的染色抹片時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格慎重處理染色用過(guò)殘液和抹片本身，以免引起病原的散播。固定好的抹片，即可進(jìn)行各種方法的染色。 2幾種常用染色方法常用的細(xì)菌染色方法，主要有兩種類型： （1）簡(jiǎn)單染色法 只應(yīng)用一種染料進(jìn)行染色的方法，如美藍(lán)染色法。 （2）復(fù)染色法 應(yīng)用兩種或兩種以上的染料或再加媒染劑進(jìn)行染色的方法。染色時(shí)，有些是將染料分別先后使用，有些則同時(shí)混合使用。染色后不同的細(xì)菌和物體，或者細(xì)菌構(gòu)造的不同部分可以呈現(xiàn)不同的顏色，有鑒別細(xì)菌的作用，又可稱為鑒別染色，如革蘭氏染色法、

11、抗酸性染色法、瑞特氏染色法和姬姆薩染色法。 美藍(lán)染色法 在已干燥、固定好的抹片上，滴加適量的（足夠覆蓋涂抹點(diǎn)即可）美藍(lán)染色液，經(jīng)13分鐘，水洗，干燥（可用吸水紙吸干，或自然干燥，但不能烤干），鏡檢。革蘭氏染色法A在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，經(jīng)12 分鐘，水洗。B加革蘭氏碘溶液于抹片上媒染，作用12 分鐘，水洗。C加95%酒精于抹片上脫色，約0.51 分鐘，水洗。D加稀釋石炭酸復(fù)紅（或沙黃水溶液）復(fù)染1030秒，水洗。E吸干或自然干燥，鏡檢。革蘭氏陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。 抗酸染色法 A萋一尼（Ziehl-Neelsen）氏抗酸染色法 首先在已干燥、固定好的抹片

12、上，滴加較多量的石炭酸復(fù)紅染色液，在玻片下以酒精燈火焰微微加熱至發(fā)生蒸氣為度（不要煮沸），維持微微發(fā)生蒸氣，經(jīng)35分鐘，水洗。然后用3%鹽酸酒精脫色，至標(biāo)本紅色脫出為止，充分水洗。再用堿性美蘭染色液復(fù)染約1分鐘，水洗。最后吸干，鏡檢?？顾嵝约?xì)菌呈紅色，非抗酸細(xì)菌呈藍(lán)色。B又法之一：將固定后的抹片滴加金（Kinyoun）氏石炭酸復(fù)紅液，歷3 分鐘。此液配法為： 堿性復(fù)紅 4克 95%乙醇 20毫升 石炭酸（化學(xué)純） 9毫升 蒸餾水 100毫升溶堿性復(fù)紅于酒精，再緩緩加水并搖振，再加入石炭酸混合。連續(xù)水洗1.5分鐘后滴加加鮑脫（Gabbott）氏復(fù)染液歷1分鐘。此液配法為： 美藍(lán) 4克 無(wú)水乙醇

13、20毫升 濃硫酸 20毫升 蒸餾水 50毫升先將美藍(lán)溶于乙醇，再加蒸餾水，再加硫酸。連續(xù)水洗1 分鐘，吸干，鏡檢。抗酸菌呈紅色，其他菌呈藍(lán)色。C.又法之二：滴加石炭酸復(fù)紅液于抹片（已干燥固定過(guò)的）上染1 分鐘；水洗；再用1%美藍(lán)酒精溶液復(fù)染20秒；水洗，干燥，鏡檢?？顾峋t色。鏡檢前對(duì)光檢查染色片，標(biāo)本片務(wù)必全呈藍(lán)色。如標(biāo)本片呈現(xiàn)紅色或棕色，表示復(fù)染不足，應(yīng)再作復(fù)染510 秒，再觀察。如仍未全呈藍(lán)色時(shí)，仍可反復(fù)復(fù)染，至符合要求為止。 瑞氏染色法 方法一：抹片自然干燥后，滴加瑞特氏染色液于其上，為了避免很快變干，染色液可稍多加些，或者看情況補(bǔ)充滴加，經(jīng)13分鐘，再加約與染液等量的中性蒸餾水或緩沖

14、液，輕輕晃動(dòng)玻片，使與染液混勻，經(jīng)5分鐘左右，直接用水沖洗（不可先將染液傾去），吸干或烘干，鏡檢。細(xì)菌染成藍(lán)色，組織、細(xì)胞等物呈其他顏色。方法二：抹片自然干燥后，按涂抹點(diǎn)大小，蓋上一塊略大的清潔濾紙片，在其上輕輕滴加染色液，至略浸過(guò)濾紙，并看情況補(bǔ)滴，維持不使變干；染色35分鐘鐘，直接以水沖洗，吸干或烘干，鏡檢。此法的染色液經(jīng)濾紙濾過(guò)，可大大避免沉渣粘附抹片上而影響鏡檢觀察。 姬姆薩氏染色法 A.于5毫升新煮過(guò)的中性蒸餾水中滴加510滴姬姆薩染色液原液，即稀釋成 常用的姬姆薩染色液。B.抹片經(jīng)甲醇固定并干燥后，在其上滴加足量染色液或?qū)⒛ㄆ胧⒂腥旧旱娜旧字?，染?0分鐘，或者染色數(shù)小時(shí)至

15、24小時(shí)，取出水洗，吸干或烘干，鏡檢。細(xì)菌呈藍(lán)青色，組織、細(xì)胞等呈其他顏色，視野常呈紅色。3.細(xì)菌基本形態(tài)及構(gòu)造的觀察 （1）細(xì)菌的形態(tài) 球菌： 雙球菌：注意其成雙的排列，兩個(gè)菌體接觸面的形狀以及菌體的形態(tài)。鏈球菌：注意其鏈狀排列，鏈的長(zhǎng)短，個(gè)體的形態(tài)。四聯(lián)球菌：注意其四個(gè)聯(lián)結(jié)成方形排列的形態(tài)。八疊球菌：注意其八個(gè)堆疊一起，呈立體方形的形態(tài)。葡萄球菌：注意其無(wú)一定次序，無(wú)一定數(shù)目，不規(guī)則地堆在一起的形態(tài)。 桿菌：?jiǎn)螚U菌：注意其單個(gè)散在的狀態(tài)，菌體外形、大小、菌端的形狀。雙桿菌：注意其成雙的排列以及菌體外形、大小、菌端的形狀。鏈桿菌：注意其成鏈狀排列，鏈的長(zhǎng)短，菌體外形、大小、菌端的形狀。 螺旋

16、狀菌：弧菌：注意其彎曲成弧形以及菌體大小，菌端的形狀。螺菌：注意其具有兩個(gè)彎曲以上的螺旋狀及菌體的長(zhǎng)度、大小，菌端的形狀。 （2）細(xì)菌的一些構(gòu)造 莢膜：注意莢膜的位置、形狀、大小、染色及相互間的聯(lián)結(jié)。 鞭毛：注意鞭毛的形狀、長(zhǎng)度、大小、數(shù)目及其在菌體上的排列（單毛、叢毛、周毛）。 芽孢：注意芽孢的形狀，與菌體相比的大小以及在菌體中的位置（中央、偏端、末端）。 = 4 * GB3 異染顆粒：注意其與菌體不同的染色反應(yīng)、形狀、大小、多少、位置等。動(dòng)物試驗(yàn) 為了作細(xì)菌或其它微生物的分離鑒定，致病力測(cè)定等，常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行接種，常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種方法有下列數(shù)種。皮下接種 （1）家兔皮下接種 由助手把兔

17、伏臥或仰臥保定，于其背側(cè)或腹側(cè)皮下結(jié)締組織疏松部分剪毛消毒，術(shù)者右手持注射器，以左手拇指、指食和中指捏起皮膚使成一個(gè)三角形皺褶，于其底部進(jìn)針，感到針頭可隨意撥動(dòng)即表示插入皮下。當(dāng)壓入注射物時(shí)感到流利暢通也表示在皮下。拔出注射針頭時(shí)用消毒棉球壓住針孔并稍加按摩。 （2）豚鼠皮下接種 保定和術(shù)式同家兔。 （3）小白鼠皮下注射 作小白鼠皮下注射接種無(wú)須助手幫助保定。術(shù)者在做好接種準(zhǔn)備后，以右手捏取鼠尾，此時(shí)鼠頭會(huì)向前掙扎而可以緊牽其尾，然后用左手的拇指和食指捏住其兩耳及其頭頸部皮膚使其翻轉(zhuǎn)，背部皮膚固定于左手中指、無(wú)名指及拇指基部之間，以小指壓住其尾根，小白鼠即仰臥保定于左手上。右手操作局部消毒，把

18、持注射器，以針頭稍微挑起皮膚插入皮下，注入時(shí)見有水泡微微鼓起即表示注入皮下。拔出針頭后，同家兔皮下注射時(shí)一樣處理。 2皮內(nèi)接種 作家兔、豚鼠及小白鼠的皮內(nèi)接種時(shí)，均需助手保定動(dòng)物，其保定方法與皮下接種相同。接種時(shí)術(shù)者以左手拇指及食指夾起皮膚，右手持注射器，針頭要很細(xì)，針頭插入拇指與食指之間的皮膚內(nèi)，針頭插入不宜過(guò)深，同時(shí)針頭插入角度要小，即與夾起的皮膚平行，注射時(shí)感到有阻力且注射完畢后皮膚上有小硬皰即為注入皮內(nèi)的表現(xiàn)。皮內(nèi)接種要慢，否則容易使皮膚脹裂或自針孔流出注射物而散播傳染。 3腹腔內(nèi)接種 在家兔、豚鼠及小白鼠的腹腔接種，宜采取仰臥保定。接種時(shí)其后軀應(yīng)稍抬高使其內(nèi)臟傾向前腔，接種部位在腹后側(cè)面，針頭先插入皮下，后進(jìn)入腹腔，注射后皮膚應(yīng)無(wú)皰隆起。其余術(shù)式同于皮下接種法。 4靜脈注射 （1）家兔的靜脈注射 將家兔納入保定器內(nèi)或由助手保定兔體露出其頭。選一側(cè)耳邊緣靜脈，助手以拇指及食指緊壓耳根部，使靜脈努張，術(shù)者剪去靜脈管上皮膚的毛，消毒局部，若需對(duì)同一動(dòng)物作多次接種時(shí)，應(yīng)自接近耳尖初處開始刺入接種，以后逐次接近耳根。接種時(shí)術(shù)者