草類植物香豆素含量測(cè)定（征求意見稿）

1、DB62/ T 草類植物香豆素含量測(cè)定Determination of coumarin content in herbage plant（征求意見稿）（本稿完成日期：2022-05-06）ICS FORMTEXT CCS FORMTEXT FORMTEXT DB 甘肅省地方標(biāo)準(zhǔn)DB / FORMTEXT FORMTEXT FORMTEXT FORMTEXT - FORMTEXT - FORMTEXT 發(fā)布甘肅省市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)布 FORMTEXT - FORMTEXT - FORMTEXT 實(shí)施IIIIIDB62/ T 目 次 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _To

2、c107844389 前言 PAGEREF _Toc107844389 h III HYPERLINK l _Toc107844390 1 范圍 PAGEREF _Toc107844390 h 1 HYPERLINK l _Toc107844391 2 規(guī)范性引用文件 PAGEREF _Toc107844391 h 1 HYPERLINK l _Toc107844392 3 術(shù)語和定義 PAGEREF _Toc107844392 h 1 HYPERLINK l _Toc107844393 3.1 香豆素 coumarin PAGEREF _Toc107844393 h 1 HYPERLINK

3、l _Toc107844394 4 原理 PAGEREF _Toc107844394 h 1 HYPERLINK l _Toc107844395 4.1 色譜法 PAGEREF _Toc107844395 h 1 HYPERLINK l _Toc107844396 4.2 熒光光譜法 PAGEREF _Toc107844396 h 1 HYPERLINK l _Toc107844397 4.3 紫外光譜法 PAGEREF _Toc107844397 h 1 HYPERLINK l _Toc107844398 4.4 近紅外光譜法 PAGEREF _Toc107844398 h 2 HYPERL

4、INK l _Toc107844399 4.5 電化學(xué)傳感法 PAGEREF _Toc107844399 h 2 HYPERLINK l _Toc107844400 5 試劑或材料 PAGEREF _Toc107844400 h 2 HYPERLINK l _Toc107844401 5.1 甲醇 PAGEREF _Toc107844401 h 2 HYPERLINK l _Toc107844402 5.2 乙醇 PAGEREF _Toc107844402 h 2 HYPERLINK l _Toc107844403 5.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 PAGEREF _Toc107844403 h 2 HYP

5、ERLINK l _Toc107844404 5.4 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液 PAGEREF _Toc107844404 h 2 HYPERLINK l _Toc107844405 5.5 微孔濾膜 PAGEREF _Toc107844405 h 2 HYPERLINK l _Toc107844406 5.6 乙醇/水溶液 PAGEREF _Toc107844406 h 2 HYPERLINK l _Toc107844407 5.7 四丁基四氟硼酸銨 PAGEREF _Toc107844407 h 2 HYPERLINK l _Toc107844408 5.8 N,N-二甲基甲酰胺 PAGEREF _T

6、oc107844408 h 2 HYPERLINK l _Toc107844409 5.9 電解質(zhì)溶液 PAGEREF _Toc107844409 h 2 HYPERLINK l _Toc107844410 6 儀器設(shè)備 PAGEREF _Toc107844410 h 2 HYPERLINK l _Toc107844411 6.1 高效液相色譜儀 PAGEREF _Toc107844411 h 3 HYPERLINK l _Toc107844412 6.2 分析天平 PAGEREF _Toc107844412 h 3 HYPERLINK l _Toc107844413 6.3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 PA

7、GEREF _Toc107844413 h 3 HYPERLINK l _Toc107844414 6.4 振蕩器 PAGEREF _Toc107844414 h 3 HYPERLINK l _Toc107844415 6.5 超聲波清洗器 PAGEREF _Toc107844415 h 3 HYPERLINK l _Toc107844416 6.6 穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀 PAGEREF _Toc107844416 h 3 HYPERLINK l _Toc107844417 6.7 紫外分光光度計(jì) PAGEREF _Toc107844417 h 3 HYPERLINK l _Toc107844

8、418 6.8 近紅外光譜儀 PAGEREF _Toc107844418 h 3 HYPERLINK l _Toc107844419 6.9 電化學(xué)工作站 PAGEREF _Toc107844419 h 3 HYPERLINK l _Toc107844420 6.10 三電極 PAGEREF _Toc107844420 h 3 HYPERLINK l _Toc107844421 7 試樣制備與保存 PAGEREF _Toc107844421 h 3 HYPERLINK l _Toc107844422 8 分析步驟 PAGEREF _Toc107844422 h 3 HYPERLINK l _T

9、oc107844423 8.1 提取 PAGEREF _Toc107844423 h 3 HYPERLINK l _Toc107844424 8.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 PAGEREF _Toc107844424 h 3 HYPERLINK l _Toc107844425 9 測(cè)定 PAGEREF _Toc107844425 h 4 HYPERLINK l _Toc107844426 9.1 色譜法測(cè)定 PAGEREF _Toc107844426 h 4 HYPERLINK l _Toc107844427 9.2 熒光光譜法測(cè)定 PAGEREF _Toc107844427 h 5 HYPERLIN

10、K l _Toc107844428 9.3 紫外光譜法測(cè)定 PAGEREF _Toc107844428 h 5 HYPERLINK l _Toc107844429 9.4 近紅外光譜法測(cè)定 PAGEREF _Toc107844429 h 5 HYPERLINK l _Toc107844430 9.5 電化學(xué)傳感法測(cè)定 PAGEREF _Toc107844430 h 5 HYPERLINK l _Toc107844431 10 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 PAGEREF _Toc107844431 h 5 HYPERLINK l _Toc107844432 11 精密度 PAGEREF _Toc1078444

11、32 h 6 HYPERLINK l _Toc107844433 附錄A （資料型附錄） 香豆素標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖 PAGEREF _Toc107844433 h 7 HYPERLINK l _Toc107844434 附錄B （資料性附錄） 香豆素標(biāo)準(zhǔn)樣品熒光光譜圖 PAGEREF _Toc107844434 h 8 HYPERLINK l _Toc107844435 附錄C （資料性附錄） 不同樣品香豆素近紅外圖譜 PAGEREF _Toc107844435 h 9 HYPERLINK l _Toc107844436 附錄D （資料性附錄） 香豆素標(biāo)準(zhǔn)樣品電化學(xué)差分脈沖伏安圖(DPV) PAG

12、EREF _Toc107844436 h 10前言本文件按照GB/T 1.12020給出的規(guī)則起草。本文件由甘肅省林業(yè)和草原局提出并監(jiān)督實(shí)施。本文件由甘肅省草業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位: 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院、中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所、農(nóng)業(yè)部牧草與草坪草種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（蘭州）、蘭州市農(nóng)業(yè)科技研究推廣中心。本文件主要起草人: 張吉宇、董樹清、王藝蒙、彭文靜、閆啟、王彥榮、邵士俊、王朋磊、張正社。DB62/ T 草類植物香豆素含量測(cè)定范圍本文件規(guī)定草類植物中香豆素含量的色譜、光譜、電化學(xué)測(cè)定方法。本文件適用于草類植物中香豆素含量的測(cè)定和定量分析。規(guī)范性引用文件下列文件

13、中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T 14699.1 飼料 采樣術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件香豆素 coumarin2H-1-苯并吡喃-2-酮，分子式為C9H6O2，相對(duì)分子質(zhì)量146.13，呈白色結(jié)晶固體，具有抗腫瘤、抗菌、抗真菌、抗凝血等作用，可提高植物的抗逆性。原理色譜法以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，

14、在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。長(zhǎng)期以來作為最常見的主流分析方法。用80%乙醇提取草類植物樣品中的待測(cè)物質(zhì)香豆素，用液相色譜法檢測(cè)，外標(biāo)法定量。熒光光譜法利用熒光激發(fā)光譜、發(fā)射光譜和三維熒光光譜，可以鑒定植物中含量高且熒光強(qiáng)度大的香豆素活性成分，可通過低濃度溶液熒光分析測(cè)定其含量。是強(qiáng)熒光物質(zhì)測(cè)定最適用的方法。紫外光譜法利用香豆素在300600nm光譜區(qū)的分子吸收來進(jìn)行分析測(cè)定的方法，這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價(jià)電子和分子軌道上的電子在電子能級(jí)間的躍遷。近紅外光譜法利用香豆素中的化學(xué)鍵的泛頻振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)對(duì)近紅外光的吸收特性，以漫反射或投射方式獲得在近紅外區(qū)的吸收光譜或投射光譜，建立香豆素近

15、紅外光譜模型，計(jì)算植物中香豆素的含量。電化學(xué)傳感法香豆素進(jìn)入電解槽，在電解液中發(fā)生氧化還原反應(yīng)，并產(chǎn)生電流，在一定范圍內(nèi)，電流大小與香豆素濃度成正比。試劑或材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純；水均為GB/T 6682中規(guī)定的一級(jí)水。甲醇CH3OH, CAS號(hào): 65-56-1，色譜純；光譜純；分析純。乙醇C2H6O, CAS號(hào): 64-17-5，色譜純；光譜純；分析純。標(biāo)準(zhǔn)品溶液香豆素，C9H6O2, CAS號(hào): 91-64-5，純度98%。標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液香豆素為干態(tài)標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確稱量標(biāo)準(zhǔn)香豆素0.0146 g，用甲醇定容至100 mL的容量瓶中，并稀釋1000倍至濃度為0.146 g/m

16、L，超聲處理10 min后經(jīng)0.45 m濾膜過濾并作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。微孔濾膜尼龍濾膜或性能相當(dāng)者，孔徑0.45 m。乙醇/水溶液800 mL乙醇與200 mL水超聲混勻。四丁基四氟硼酸銨C16H36BF4N, CAS號(hào): 429-42-5，純度98%。N,N-二甲基甲酰胺C3H7NO, CAS號(hào): 68-12-2，純度98%。電解質(zhì)溶液稱取相應(yīng)重量的四甲基四氟硼酸銨，以N，N-二甲基甲酰胺為溶劑配制成1 mol/L的電解質(zhì)。儀器設(shè)備高效液相色譜儀配二極管陣列檢測(cè)器（DAD）。分析天平精確度0.0001g。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀振蕩器超聲波清洗器穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀發(fā)射波長(zhǎng)范圍：350800n

17、m。紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)范圍：300600nm。近紅外光譜儀波長(zhǎng)范圍：14002600 nm。電化學(xué)工作站電壓范圍：48V。三電極玻碳電極、對(duì)電極、參比電極。試樣制備與保存按GB/T 14699.1的規(guī)定采集牧草樣品。將鮮草樣品于常溫通風(fēng)干燥或自然曬干制成干草樣品，用四分法縮至50 g100 g，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，全部通過0.45 mm孔徑篩，常溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?。分析步驟提取稱取干草樣品1 g（精確到0.001 g）試樣于25 mL離心管中，加入25 mL 80%乙醇溶液，振蕩10 min，常溫下超聲提取30 min后過濾，共提取2次，合并濾液，濾液減壓濃縮至干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加

18、甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 m微孔濾膜過濾。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備色譜法分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.5、1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度。準(zhǔn)確吸取20 L，在色譜條件下進(jìn)樣，以對(duì)照品峰面積（Y）作為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)作圖，得線性回歸方程。熒光光譜法分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.5、1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度。用甲醇稀釋500倍后，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）為660 nm，采樣間隔（Inc）為 5 nm，激發(fā)狹縫（Ex Slit）為2 nm；發(fā)射波長(zhǎng)的（Em）范圍取650-750 nm，采樣間隔（Inc）為5 nm，發(fā)射狹縫（E

19、m Slit）為2 nm；積分時(shí)間設(shè)置為（integration time）：0.2 s，于S1c模式下進(jìn)行二維熒光圖譜測(cè)定，以熒光強(qiáng)度（Y）作為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)作圖，得線性回歸方程。紫外光譜法 分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.5、1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度。用甲醇稀釋500倍，在300800 nm紫外波長(zhǎng)范圍內(nèi)直接進(jìn)樣，以吸光度（Y）作為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)作圖，得線性回歸方程。近紅外光譜法將粉碎的樣品在儀器上進(jìn)行多次掃描，收集每個(gè)樣品光譜值。通過光譜值與經(jīng)典分析方法測(cè)定值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，建立預(yù)測(cè)模型，以樣品的近紅外預(yù)測(cè)值（X）為橫坐標(biāo)，

20、經(jīng)典分析方法測(cè)定值（Y）為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程。電化學(xué)傳感法分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.5、1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度。采用三電極體系，稱取適量的四丁基四氟硼酸銨作為溶質(zhì)，以N，N-二甲基甲酰胺為溶劑制備1.0 mol/L電解質(zhì)；測(cè)量前，用氮?dú)鈱⑷芤好摎? min。在5.0 mL電解液中加入10.0 L樣品溶液。將玻碳電極在砂紙上打磨，將氧化鋁（0.1 m）和水混合后用于電極拋光，之后超聲清洗并晾干備用。在電解池中加入5 mL的電解質(zhì)溶液，在-2.0-0.0 V電位范圍內(nèi)以1.0 mv/s的掃速進(jìn)行掃描，待曲線穩(wěn)定后加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述條件下用差分脈沖伏

21、安法（DPV）測(cè)定不同樣品的氧化峰電流。每次掃描結(jié)束后，要重新超聲清洗后再檢測(cè)，這是為了保持電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。以電流（Y）作為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)作圖，得線性回歸方程。測(cè)定色譜法測(cè)定高效液相色譜參考條件色譜柱: C18（填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠），柱長(zhǎng)250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm。流動(dòng)相: A相為甲醇，B相為水，A:B為65:35。流速:1.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng): 280 nm。柱溫: 35 。進(jìn)樣量: 20 L。色譜法定量測(cè)定取樣品溶液上機(jī)分析，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線作多點(diǎn)校準(zhǔn)，用外標(biāo)法定量測(cè)定。熒光光譜法測(cè)定熒光光譜法參考條件二維熒光光譜激發(fā)波長(zhǎng)600 nm，發(fā)射波長(zhǎng)672 nm，狹縫4 nm，步徑2 nm，樣品量2 mL。光譜法定量測(cè)定 待測(cè)樣品按照8.1方法制備好樣品溶液，使用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，由8.2.2的標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品中香豆素的濃度。紫外光譜法測(cè)定紫外光譜法參考條件紫外波長(zhǎng)范圍: 300800 nm, 樣品量