包頭醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)之實(shí)驗(yàn)7 銅綠假單胞菌的檢測(cè)

1、實(shí)驗(yàn)7 銅綠假單胞菌的檢測(cè)目的要求掌握銅綠假單胞菌檢測(cè)的主要步驟與方法。熟悉化妝品標(biāo)本的采集原則。掌握銅綠假單胞菌菌落的觀察和生化反應(yīng)結(jié)果的判斷。器材和試劑1樣本 可疑化妝品2培養(yǎng)基及試劑 SCDLP液體培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、血瓊脂平板、麥康凱平板、KIA、十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、麥芽糖、木糖微量發(fā)酵管、硝酸鹽培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水、肉湯培養(yǎng)基等。1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺（氧化酶試劑）、硝酸鹽還原試劑、吲哚試劑、3%過(guò)氧化氫、氯仿、1mol/L的鹽酸3其他 接種環(huán)、接種針、載玻片、革蘭染液、香柏油、擦鏡液、生理鹽水。步驟和方法一、樣品的前處理1.親水性樣品（

2、水包油型）：可取10g加到90ml帶玻璃珠的滅菌生理鹽水中，如樣品量少于10ml，仍按10倍稀釋法進(jìn)行。如為5ml則加45ml滅菌生理鹽水，混勻后，制成1：10稀釋液。2. 疏水性樣品（油包水型）：取樣品10g先加10ml滅菌液體石蠟混勻，再加10ml滅菌的吐溫80，在40-44水中振蕩混勻10min，加入滅菌生理鹽水75ml，在40-44水浴中乳化，制成1：10懸液。或用均質(zhì)器，將加有助溶劑、稀釋液的樣品放入均質(zhì)器，均質(zhì)3-5min后，取上清液待檢（上清液的稀釋倍數(shù)為1：10）。3.膏、霜、乳劑半固體狀樣品1）親水性樣品取10g加到90ml帶玻璃珠的滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振蕩混勻，放3

3、0-32水浴中靜置15min，用其上清液作為1：10的稀釋液。2）疏水性樣品稱取10g，放到滅菌的研缽中，加10ml滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加10ml滅菌吐溫80，研磨待溶解后，加70ml滅菌生理鹽水，在40-44水浴中充分混勻，制成1：10稀釋液。4.固體樣品：取10g加到90ml帶玻璃珠的滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振蕩混勻，放30-32水浴中靜置15min后取出，充分振蕩混勻，再放到30-32水浴中靜置15min，取上清液作為1：10的稀釋液。如有均質(zhì)器，上述親水性膏、霜、乳劑等，可稱10g樣品加90ml的滅菌生理鹽水，均質(zhì)1-2mi；疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱10g樣品加90

4、mlSCDLP液體培養(yǎng)基，或1g樣品加1ml滅菌液體石蠟、1ml滅菌吐溫80、7ml滅菌生理鹽水，均質(zhì)3-5min。二、增菌培養(yǎng)：取1：10稀釋樣品10ml加入90mlSCDLP液體培養(yǎng)基中，置37培養(yǎng)18-24h，進(jìn)行增菌。如有銅綠假單胞菌生長(zhǎng)，則培養(yǎng)基表面有一薄層菌膜，培養(yǎng)液呈黃綠色或藍(lán)綠色。三、分離培養(yǎng)：從増菌液的菌膜處挑去培養(yǎng)物，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱平板、十六烷三甲基溴化銨平板和血瓊脂平板上，經(jīng)35孵育18-24h后觀察菌落特征及色素等。本菌為專性需氧菌，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上形成圓形、大小不一、邊緣不整齊、扁平、光滑、濕潤(rùn)而常呈融合狀態(tài)的 菌落，瓊脂被染成藍(lán)綠色或黃綠色。

5、在血瓊脂平板上形成大而扁平、濕潤(rùn)、有金屬光澤、有生姜味的 灰綠色或藍(lán)綠色菌落，菌落周圍出現(xiàn)的菌落呈有透明的溶血環(huán)。在麥康凱平板上形成微小、半透明菌落，48h后菌落中央常呈棕綠色。十六烷三甲基溴化銨平板具有較強(qiáng)的選擇性，大腸埃希氏菌不能生長(zhǎng)，革蘭陽(yáng)性菌生長(zhǎng)較差而銅綠假單胞菌則生成無(wú)定型扁平菌落，向周邊擴(kuò)散或略有蔓延、表面濕潤(rùn)，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素。四、形態(tài)觀察：將可疑菌落進(jìn)行涂片革蘭染色可見(jiàn)革蘭陰性球桿狀或長(zhǎng)絲狀，成雙或成鏈排列。不染色標(biāo)本動(dòng)力觀察，運(yùn)動(dòng)活躍；鞭毛染色，一端有1-3根紅色的鞭毛。五、生化反應(yīng)：將上述幾個(gè)平板上的可疑菌落接種到各種生化培養(yǎng)基中。1.氧化酶、

6、觸酶試驗(yàn)、本菌均陽(yáng)性。2.綠膿菌素提取試驗(yàn)：本來(lái)應(yīng)該用專門(mén)的綠膿菌素培養(yǎng)基提取，但效果不如在十六烷三甲基溴化銨平板上提取，所以采用十六烷三甲基溴化銨平板，具體方法為在十六烷三甲基溴化銨平板中加入3-5ml氯仿，輕輕振搖2分鐘左右，當(dāng)氯仿提取液呈藍(lán)色時(shí)，用吸管將氯仿移至另一試管中，并加入1mol/L的鹽酸1ml左右，震蕩片刻后靜止，如上層鹽酸層液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色為陽(yáng)性，表明有綠膿菌素的存在。3.42生長(zhǎng)試驗(yàn)：挑去純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，放41-42培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24-48h。銅綠假單胞菌能生長(zhǎng)，為陽(yáng)性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長(zhǎng)。4.其他生化反應(yīng)：銅綠假單胞菌的最后鑒定，主要根據(jù)生化反應(yīng)特征，與嗜麥芽窄食單胞菌的生化區(qū)別如下表1。銅綠假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌主要生化反應(yīng)結(jié)果 KIA 氧化酶 枸櫞酸鹽 硝酸鹽產(chǎn)氮 吲哚 色素 葡萄糖 麥芽糖 木糖細(xì)菌 底層 斜面 產(chǎn)氣 H2S銅綠假單胞菌 - - - - + + + - + + - +嗜麥芽窄食單胞菌 - - - - + - - - - + + -檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告：被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，在分離平板上有典型或可疑菌落