包頭醫(yī)學院微生物學與微生物檢驗實驗指導之實驗2 培養(yǎng)基制備技術

1、實驗2 培養(yǎng)基制備技術目的要求1. 掌握培養(yǎng)基制備的基本過程。 2熟悉常用培養(yǎng)基的原理、種類及其用途。器材和試劑1.試劑 牛肉膏、氯化鈉、蛋白陳、瓊脂粉、抗凝綿羊血、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、葡萄糖、乳糖、甘露醇、檸檬酸鈉、硫酸鎂、磷酸二氫銨、硝酸鉀、硫代硫酸鈉、檸檬酸鐵、硫酸亞鐵、尿素、溴甲酚紫、溴麝香草酚藍、中性紅、酚紅、lmol/LNaOH、lmol/LHCl。2.器材 5OOml錐形瓶、5OOml量筒、lOml、5ml和1ml吸管、精密pH試紙、華氏試管、硅膠塞、天平、高壓蒸氣鍋、血清凝固器、脫脂棉、濾紙、漏斗、無菌平皿。步驟和方法1.培養(yǎng)基制備的基本過程 包括調(diào)配成分、溶解、矯正pH、

2、過濾澄清、分裝、滅菌、質量檢查和保存。(1)調(diào)配成分:按培養(yǎng)基組成準確稱取各成分用量，放人錐形瓶或大容量燒瓶中，加一定量蒸餾水，使其充分混合。應注意染料、膽鹽和指示劑等應在矯正pH后加入。(2)溶解:將調(diào)配好的混合物在沸水浴或流動蒸氣滅菌器中，使其完全溶解。不可將培養(yǎng)基裝在銅鐵容器中加熱，因培養(yǎng)基中含銅量超過0.3mg/L時，細菌不易生長；含鐵量超過0.14mg/L時可抑制細菌毒素的產(chǎn)生。(3)矯正pH:一般將培養(yǎng)基的pH凋至7.27.6左右。經(jīng)高壓滅菌后其pH可發(fā)生0.10.2變動。若用NaOH矯正，高壓滅菌后pH下降0.l0.2；若用NaCO3矯正，高壓滅菌后pH升高0.1一0.2。(4)

3、濾過澄清:自配的培養(yǎng)基通常有一些混濁或沉淀，需濾過澄清后方可使用。液體或半固體培養(yǎng)基常用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基在熔化后趁熱以絨布或雙層紗布加脫脂棉過濾。(5)分裝:1）基礎培養(yǎng)基:一般分裝于錐形瓶滅菌后備用，以便隨時分裝傾注平板或配制營養(yǎng)培養(yǎng)基等；2）瓊脂斜面:通常在熔化后分裝于試管，量約為試管高度的1/41/3，加塞后滅菌，趁熱擺成斜面，斜面長度約為試管長度的2/3，且保持試管下端有l(wèi)cm柱高；3）半固體培養(yǎng)基:分裝量為試管容量的1/41/3，加塞滅菌后趁熱直立凝固；4）瓊脂高層培養(yǎng)基:分裝量為管長的2/3(接種厭氧菌用)，滅菌后趁熱直立凝固；5）瓊脂平板無菌分注:先將滅菌瓊脂熔化后冷卻至5O

4、0C左右，以無菌操作傾注于滅菌平皿內(nèi)(內(nèi)徑90mm的平皿約1315ml)，水平旋轉平皿，待瓊脂凝固后將平皿翻轉，置40C保存?zhèn)溆谩?6)滅菌:1)由耐熱物質配制成的培養(yǎng)基(如普通營養(yǎng)瓊脂等)常用高壓蒸氣滅菌，條件為103.43kPa，l52Omin；含糖培養(yǎng)基以68.95kPa，l0l5min為宜，以免破壞糖類物質。2)不耐高熱的物質配制成的培養(yǎng)基，如糖類、明膠和牛乳等常用流通蒸氣滅菌，方法是加溫80100C3Omin，每天一次，連續(xù)3天。3)富含蛋白質的培養(yǎng)基(如含血清或雞蛋清的培養(yǎng)基需用血清凝固器滅菌，方法是將配制好的培養(yǎng)基擺放在血清凝固器內(nèi)(一般做成斜面)，第一天750C3Omin，第二

5、天800C3Omin，第三天850C3Omin。在三次滅菌的間隙將培養(yǎng)基取出置350C孵箱中過夜。(7)質量檢驗:需做無菌試驗和效果試驗。1）無菌試驗:將滅菌后的培養(yǎng)基置350C孵育24h，無任何細菌生長為合格；2）效果試驗:將已知的標準參考菌株接種于待檢培養(yǎng)基中。檢查細菌的生長繁殖狀況和生化反應是否與預期的結果相符合。(8)保存:制備好的培養(yǎng)基應注明名稱、制作日期，如瓊脂平板應將底(帶培養(yǎng)基的平面)朝上，蓋在下;用牛皮紙包裹或裝于保鮮袋內(nèi)，以減少水分蒸發(fā)。液體培養(yǎng)基應直立放置。制作好的培養(yǎng)基應存放于冷暗處或40C冰箱。2.常用培養(yǎng)基的制備(1)肉湯:將新鮮牛肉(去除筋和脂肪)5009絞碎加水

6、。40C過夜。加熱45500Clh，用數(shù)層紗布或濾紙過濾，加水補充至1OOOml。再加入蛋白胨lOg和NaCl5g加熱熔化，冷至40500C。矯王pH至7.4一7.6。分裝于錐形瓶或試管內(nèi)，加塞后高壓蒸氣滅菌；103.43kPa 2Omin。冷后放陰暗處或40C備用。供作無糖基礎培養(yǎng)基用。適用于營養(yǎng)要求一般的細菌。(2)肉膏湯:將牛肉膏3g、蛋白陳lOg。NaCl5g、蒸餾水l0OOml置錐形瓶或大容量燒杯中，加熱熔化后矯證pH至7.6，煮沸35min，過濾后分裝，高壓滅菌103.43kPa2Omin后。40C貯存。供作無糖培養(yǎng)基用，適廟營養(yǎng)要求一般的細菌。(3)普通瓊脂(營養(yǎng)瓊脂):將肉湯或

7、肉膏湯1000ml、瓊脂20g混合，加熱熔化，調(diào)pH 至7.6，趁熱分裝試管或錐形瓶，加塞后高壓滅菌103.43kPa 2Omin,取出試管擺成斜面，待瓊脂凝固后即成瓊脂斜面；錐形瓶中的瓊脂冷至5O0C左右傾注滅菌平皿，凝固后即成普通瓊脂平板。供一般細菌培養(yǎng)用，可作無糖基礎培養(yǎng)基。（4）半固體培養(yǎng)基:將肉湯或肉湯膏1000ml(已調(diào)pH至7.6，下同)，瓊脂5g混合,加熱熔化后凋pH至7.6，分裝小試管，每管2ml，加塞，高壓滅菌103.43kPa 2Omin，取出后直立待凝即成?？勺饔^察細菌動力和保存菌種用。(5)血液和巧克力瓊脂培養(yǎng)基:將滅菌后的普通瓊脂培養(yǎng)基(pH7.6)加熱熔化，冷至5

8、O0C左右。以無菌操作加入無菌脫纖維羊血(臨用前置370C水浴預溫30min)。輕輕搖勻(避免產(chǎn)生氣泡)，分裝于無菌試管和平皿內(nèi)，凝固后即成血液瓊脂斜面和血液瓊脂平板。 若在瓊脂溫度800C時加入血液。并在800C水浴中搖勻3Omin，傾注平板后即成為巧克力瓊脂平板。血液瓊脂用于分離培養(yǎng)和保存營養(yǎng)要求高的細菌；巧克力瓊脂主要用于分離培養(yǎng)奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬、肺炎鏈球菌等苛養(yǎng)菌。注意事項1培養(yǎng)基的澄清 如需要制備十分澄清的培養(yǎng)基，可用卵蛋白加熱澄清法。其方法為:取一個蛋的卵蛋白加水2Oml，攪拌至出現(xiàn)泡沫，倒入l0OOml液體或熔化的固體培養(yǎng)基中混勻。然后在流動蒸氣中加熱306Omin，使培養(yǎng)基中不溶性物質附著于凝固蛋白，取出后以紗布夾脫脂棉(固體培養(yǎng)基)或濾紙(液體或半固體培養(yǎng)基)過濾即可。 2平板的澆注 傾注培養(yǎng)基時，切勿將皿蓋全部開啟，以免空氣中塵埃及細菌等微生物的落入。 傾注時若培養(yǎng)基溫度過高，冷凝水過多，易致污染。不易分離到菌落；若溫